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冷冻电镜的发明及其在生物学的应用冷冻电镜的发明及其在生物学的应用报告人：报告人：XXXXXX1 冷冻电镜是什么？冷冻电镜是什么？冷冻电子显微镜技术冷冻电子显微镜技术（cryo-electron microscopy）简称简称 冷冻电镜冷冻电镜：应用冷冻固定技术，低应用冷冻固定技术，低温下使用透射电子显微镜观察样品的温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，从而得到生物大分子的结显微技术，从而得到生物大分子的结构。构。22024/6/17 周一我们或许在不久的将来就能获得生命复杂机制的原子级分辨率的图片了32024/6/17 周一冷冻电镜技术获冷冻电镜技术获20172017诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖20172017年年1010月月4 4日下午日下午5 5点点4545分许，诺贝尔奖评委会主席格荣分许，诺贝尔奖评委会主席格荣汉森汉森（Goran HanssonGoran Hansson）宣布，因发明用于生物分子的高分辨率结构测）宣布，因发明用于生物分子的高分辨率结构测定的冷冻电子显微镜（定的冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopycryo-electron microscopy），瑞士洛桑大），瑞士洛桑大学的雅克学的雅克杜波切特（杜波切特（Jacques DubochetJacques Dubochet）、美国哥伦比亚大学的）、美国哥伦比亚大学的乔基姆乔基姆弗兰克（弗兰克（Joachim FrankJoachim Frank）和英国剑桥大学的理查德）和英国剑桥大学的理查德亨亨德森（德森（Richard HendersonRichard Henderson）获得）获得20172017年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。诺贝尔奖官方称为诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代使得生物化学进入一个新时代”42024/6/17 周一52024/6/17 周一62024/6/17 周一上世纪50年代，利用X射线成像技术解析蛋白质结构，人们才首次得以拍出蛋白质晶体的螺旋状结构图片。X射线晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。其中关键步骤之一即是，为获得可供X射线衍射的单晶，需要将纯化后的生物样品进行晶体生长。现实情况却是，目前很多复杂的大分子物质难以获得晶体。冷冻电镜产生背景冷冻电镜产生背景彼得阿格雷(美)和罗德里克麦金农(美)对细胞膜中的水通道的发现以及对离子通道的研究，共同分享了2003年的诺贝尔化学奖。72024/6/17 周一82024/6/17 周一上世纪80年代初，核磁共振成像技术问世，人们得以对溶液中和固态的蛋白质进行成像研究，不仅进一步认识了蛋白质的结构，更获得了蛋白质如何运动及与其他分子相互作用的基本了解。92024/6/17 周一被认为比晶体结构更能够描述生物大分子在细胞内的真实结构，并且能获得氢原子的结构位置。缺点则在于蛋白质在溶液中往往结构不稳定而难得获取稳定的信号。102024/6/17 周一X射线晶体学法和核磁共振技术均对蛋白质的纯度、结晶性和绝对量有较高的要求，使得图像分辨率难以提升，更是无法获得蛋白质结构的动态变化。因此，无论是X射线晶体学成像还是核磁共振，都不能让研究者获得高分辨率的大型蛋白复合体结构，生物结构学领域的发展也因此受困于成像技术。112024/6/17 周一电子显微镜1、为什么不使用光学显微镜？光学显微镜利用的是光子的波动性，而光子的波长大概在500纳米左右。蛋白质分子大小在1-100nm之间，所以光子的波长比蛋白质分子还要大，因此光波能绕过蛋白质分子，也就看不到蛋白质了。2、电子显微镜的原理？电子的波长是光子波长的十万分之一左右，是一根极细的探针，理论上它打在蛋白质分子这类生物大分子身上能被反射，这些反射的电子就能产生一张照片，电子显微镜相当于是用电子替代光线来照射物体，由于电子的波长远低于光波，它能够看到非常小尺度的结构。122024/6/17 周一3、电子显微镜观测蛋白质分子有活性的生物大分子遇到的问题？第一个问题第一个问题是真空问题，电子显微镜的电子只能在真空中飞行的时候才能保持稳定的动能。而蛋白质这类生物大分子一般处于溶液中，在真空环境下，溶液会挥发出来，污染电子显微镜。液态水在电子显微镜的真空管里蒸发，会使得生物大分子瓦解。第二个问题第二个问题是电子打在蛋白质这类生物大分子上容易把蛋白质打坏了，因为电子的能量比较高，而生物大分子一般依靠氢键来形成它的空间结构，氢键的能量很低，电子打上去以后，氢键就被打断了。第三个问题第三个问题则更加严重，因为蛋白质分子这类生物大分子是有活性的，它们是运动的，电子打上去反射回来的方向会因为分子的运动而变得杂乱无章。132024/6/17 周一冷冻电镜的诞生冷冻电镜的诞生1975年，亨德森利用电子显微镜的方法，发表出来第一个非常粗糙的视紫红质蛋白结构，图片上可以看出七个跨膜蛋白链。证明了电子显微镜在生物领域的适用性。这也是历史上第一张膜蛋白领域的三维结构。细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像142024/6/17 周一亨德森将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下进行观察，借助表面覆盖的葡萄糖防止真空干涸借助表面覆盖的葡萄糖防止真空干涸，并采用强度更低的电子束流，得出细菌视紫红质在细胞膜上是规整排列且朝向一致。之后，在前述Aron Klug等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和同事获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。亨德森所发展出来的方法也具有其局限性，这是因为他所研究的蛋白本身的特性让研究者能够采用所谓“冷冻电子断层成像术”来测定其结构。简单来说，研究人员要转动细胞膜，从不同角度对蛋白拍照，最终构建出蛋白的三维结构。这种方法只适用于排列有一定规律的蛋白如果它们是杂乱无章的，这种方法就难以奏效了。152024/6/17 周一1981年，弗兰克完成了单颗粒三维重构算法及软件Spider，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像。弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基础。162024/6/17 周一在1980年代初，雅克杜伯切特成功将水玻璃态化，他将水快速冷却，在生物样本周围以液态形式固化，使生物分子即使在真空中也能维持天然形态。雅克杜伯切特（Jacques Dubochet）的重要贡献则是在真空环境下使生物分子保持自然形状。172024/6/17 周一一般情况下，通过氢键的相互作用，水分子会在凝固过程中形成有序排列，形成晶体。而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前就让其凝固，将生物样品浸入事先经液氮冷却的乙烷中，就能使水迅速冷却、在数毫秒之内完全凝固，这种方式得到的就不是晶体而是无定形态，而玻璃也是处于无定形态，玻璃化名称由此而来。生物样品嵌在无定形冰中，堪称留下了真实的一瞬间。1982年，迪波什开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品。182024/6/17 周一在1990年，理查德亨德森成功地使用电子显微镜拍摄到原子级分辨率的蛋白质三维图像，并提出了实现原子级分辨率冷冻电镜技术的可行性理论。冷冻电镜的雏形基本建立，总的思路为冷冻电镜的雏形基本建立，总的思路为1.样品冷冻（保持蛋白溶液态结构）2.冷冻成像（获取二维投影图像）3.三维重构（从二维图像通过计算得到三维密度图）分辨率达到原子层面的细菌视紫红质立体图像192024/6/17 周一基于三位科学家的这些重大发现，电子显微镜自此得到全面优化，并在2013年，研究者们终于获得了理想的原子级别成像，用以制作生物分子的三维结构图像。过去几年中，科学文献充满了导致抗生素耐药性的蛋白质、寨卡（Zika）病毒表面等各种图像，生物化学正在面临爆炸性的发展。20142014年利用冷冻电镜三维重构技术确定蛋白质年利用冷冻电镜三维重构技术确定蛋白质TRPVTRPV1 1结构，标志着冷结构，标志着冷冻电镜跨入冻电镜跨入“原子分辨率原子分辨率”时代。时代。冷冻电镜在2013年的技术革命202024/6/17 周一冷冻电镜的工作流程：冷冻电镜的工作流程：样品的制备样品的制备 透射电子显微镜成像透射电子显微镜成像图像处理图像处理结构解析结构解析212024/6/17 周一图图1 1 冷冻电子显微学解析结构基本步骤冷冻电子显微学解析结构基本步骤222024/6/17 周一冷冻电镜技术的操作过程：1、样品的制备、样品的制备用于冷冻电镜研究的生物大分子样品必须非常纯净必须非常纯净。生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又能抗脱水、电子辐射。一种方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。该方法有两个关键步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。另一种方法是通过喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），利用结合底物混合冰冻技术(spray-freezing)，可以把两种溶液（如受体和配体）在极短的时间内混合起来(ms量级)，然后快速冷冻，将其固定在某种反应中间状态，这样能对生物大分子在结合底物时或其他生化反应中的快速的结构变化进行测定，深入了解生物大分子的功能。232024/6/17 周一样品在液氮中冷冻242024/6/17 周一冷冻的样品通过专门的设备冷冻输送器转移到电镜的样品室。在照相之前，必须观察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。由于生物样品对高能电子的辐射敏感，照相时必须使用最小曝光技术（minimal exposure technic）。要得到高分辨率的电镜图像，照相时累积的电子剂量不能超过临界剂量1000到2000e-nm-2；中等分辨率的电镜图像图像不能超过临界剂量 10000e-nm-2。2、数据采集、数据采集252024/6/17 周一数据处理的最终目的是为了获得生物样品的三维质量密度图。由于冷冻电镜获得图像信躁比低，结构信息常常淹没在躁声中而难辨认。只有通过大量拍摄生物样品的同一个图像，然后用某种方法加以平均来消除躁声。由二维图像推知三维结构的方法即三维重构。3、图像处理和三维重构、图像处理和三维重构262024/6/17 周一冷冻电镜数据分析处理流程272024/6/17 周一冷冻电镜的工作原理：冷冻电镜的工作原理：原理：原理：样品经过在液氮中的冷冻固定，样品经过在液氮中的冷冻固定，使得生物大分子中的使得生物大分子中的H H2 2O O分子以玻璃态分子以玻璃态的形式存在，保持低温，将样品放入显的形式存在，保持低温，将样品放入显微镜，高度相干的电子作为光源从上面微镜，高度相干的电子作为光源从上面照射下来，透过样品和附近的冰层，受照射下来，透过样品和附近的冰层，受到散射，利用探测器和透镜系统把散射到散射，利用探测器和透镜系统把散射的信号成像记录下来，再进行信号处理，的信号成像记录下来，再进行信号处理，最后利用三维重构的技术得到样品的三最后利用三维重构的技术得到样品的三维结构。维结构。282024/6/17 周一三维重构技术的原理三维重构技术的原理：透射电子显微镜成像过程中透射电子显微镜成像过程中,电子束穿透样品电子束穿透样品,将样品的三将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上方向垂直的二维平面上。运用运用中心截面定理中心截面定理(如如图图),),从而从而可以通过三维物体不同角可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构三维结构。292024/6/17 周一三维重构原理图 中心截面定理中心截面定理302024/6/17 周一核孔复合体不同角度的影像312024/6/17 周一冷冻电镜提供原子分辨率的结构信息322024/6/17 周一冷冻电镜优点：冷冻电镜优点：样品需求量少样品需求量少 更接近生理状态更接近生理状态 适用研究对象广泛（如：天然的、动态的结构）适用研究对象广泛（如：天然的、动态的结构）可以对不均一样品进行研究可以对不均一样品进行研究 不需要对样品进行特殊化处理（如：不需要结晶）不需要对样品进行特殊化处理（如：不需要结晶）可获得不同构象或中间物的动态快照可获得不同构象或中间物的动态快照332024/6/17 周一冷冻电镜局限：冷冻电镜局限：设备昂贵设备昂贵 样品的准备困难样品的准备困难 样品需冷冻，不是在室温下进行样品需冷冻，不是在室温下进行 样品可能被过强的电子束损伤样品可能被过强的电子束损伤 342024/6/17 周一冷冻电镜在现代生物学中的应用冷冻电镜在现代生物学中的应用：1 1.研究那些不适合于应用研究那些不适合于应用X-X-射线晶体学和核磁共射线晶体学和核磁共振波谱学的分子及其聚合物的结构振波谱学的分子及其聚合物的结构如：如：AlzhiemerAlzhiemer疾病的淀粉状蛋白纤维聚合物的疾病的淀粉状蛋白纤维聚合物的结构结构2.2.研究生物大分子处于不同功能状态时的结构研究生物大分子处于不同功能状态时的结构如：离子通道开关如：离子通道开关3.3.为为X-X-射线晶体学结构解析提供初始分子置换模射线晶体学结构解析提供初始分子置换模型及初始相位型及初始相位如：核糖体的三维结构如：核糖体的三维结构352024/6/17 周一4.4.研究生物大分子复合物的结构研究生物大分子复合物的结构如：病毒如：病毒-受体复合物的结构受体复合物的结构5.5.研究细胞器甚至是活细胞的结构研究细胞器甚至是活细胞的结构如如:生物分子在运动过程中的结构和结构的变化生物分子在运动过程中的结构和结构的变化362024/6/17 周一谢谢观赏谢谢观赏372024/6/17 周一