实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点.doc

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等电点聚焦测蛋白质等电点
一． 实验目的
1. 了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；
2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二． 实验原理
等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
三． 实验步骤
1.凝胶制备
按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。每组4管，每管加胶液1.8ml。混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。
表1 凝胶工作液配比
凝胶母液（丙烯酰胺30%：甲叉双丙烯酰胺0.8%）
1ml
10%过硫酸铵
0.02ml
水
2.68ml
载体两性电解液
0.15ml
蛋白样品液
0.1ml,0.05ml
TEMED
0.02ml
2.电泳
吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。于电泳槽下槽加入0.2％的500ml硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳，全程约需3h。
3.剥胶
电泳结束后，取下凝胶管用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。剥离后，量出并记录凝胶的长度。
4. 固定
取其中的凝胶条3根置于一个小培养皿内，倒入10%放在三氯乙酸固定液中固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液用直尺量出胶条长度L1和正极端到蛋白质白色沉淀带中心，即聚焦部位的长度L2。
5. pH梯度的测量
切段法：将未经固定的1根胶条，按照从正极端(酸性端)到负极端(碱性端)的顺序切成相等的10段，按次放人有标号的、装有0.0lM氯化钾的试管中，浸泡过夜。然后用pH计测出每管浸泡液的pH并记录。
四． 实验结果
1.凝胶条的长度及染色蛋白带的位置
凝胶条编号
1
2
3
4
固定前的长度L0
7.8cm
7.8cm
7.4cm
7.7cm
固定后的长度L1
7.7cm
7.8cm
7.4cm
未染色，测pH梯度
蛋白带距酸端距离L2
1.3cm
1.4cm
1.3cm
蛋白质距正极实际长度LS
1.32cm
1.4cm
1.3cm
2.pH梯度表及其相应标准曲线
标号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
长度/cm
0.77
0.77
0.77
0.77
0.77
0.77
0.77
0.77
0.77
0.77
pH值
3.05
3.72
5.04
6.76
7.24
7.99
8.62
9.58
10.14
10.18

蛋白质样品等电点的计算 ：
蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度=固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离*固定前凝胶条长度/ 固定后凝胶条长度
则将上述数据代入LS=L2*，求出蛋白质距正极实际长度LS分别为13cm、1.4cm、1.3cm。由凝胶条1、2和3及其相应蛋白带距离可计算出蛋白带距酸端的平均距离：(1.3+1.4+1.32)/3=1.34
②计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。
得出其标准公式为：y = 0.8372x + 2.6273
则待测蛋白质的等电点为0.8372*1.34+2.6273=3.75
五． 实验分析及讨论
（1）实验结果测得的样品蛋白的等电点为3.75，通过查常见蛋白质等电点参考值表格可知，其为β-卵黄脂磷蛋白。由于记录凝胶长度及蛋白质距正极的距离存在读数误差，所以也可能是伴花生球蛋白（3.7-5.0）。
（2） 等电点聚焦测蛋白质等电点分辨率高，可将等电点相差0.01—0.02pH单位的蛋白质分开。不像一般电泳易受扩散作用影响，使区带越走越宽；聚焦电泳则能抵消扩散作用，使区带越走越窄。同时，很稀的样品也可以聚焦而浓缩，实验操作起来也简单方便。
（3） 其存在其不足之处是在实验操作过程当中，读数的取值、样品溶液是否含盐、在等电点时蛋白质是否溶解或变性，都会影响实验结果。因为盐会增大电流量，产生热量；盐分子移至两极时，将产生酸或碱，中和两性电解质。由于这些影响因素的存在，个人认为利用这一种方法还不足以鉴定出蛋白质种类。
附 常见蛋白质等电点参考值

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