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结课论文

题 目
突破衍射极限的超高分辨率成像的技术进展

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十二月

一 引言
1.1 选题意义
光学显微成像具有极为悠久的历史，但一直以来，光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200 nm。后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，但是使用光学显微镜可以在活体状态下观测生命体使得其在生物、医学观测方面仍有巨大优势。值得庆贺的是近年来，超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达成了20 nm以下。其中德国科学家Stefan Hell、美国科学家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出奉献获得了2023年的诺贝尔化学奖。在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用，并对诸位大师致以敬意。
1.2 技术指标
显微技术成像优劣一般通过X-Y平面分辨率与Z轴分辨率大小来鉴定，分辨率越高数值越小。下表是各种显微成像技术的分辨率指标。

成像技术
X-Y平面分辨率（nm）
Z轴分辨率(nm)
普通光学显微镜
200-300
500-700
4Pi显微镜

100-150
STED显微技术
50-70

STED+4技术
50
50
PALM技术
20
30
3D STORM技术
20-30
50-60
dSTORM技术
30
50
2D SSIM技术
50

3D SSIM技术
100
200
电子显微镜
0.05

X光衍射仪
0.03-10

二 衍射极限
2.1 衍射极限
我们能看到什么？看到多小的范围？看得有多清楚？几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。
人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观测薄薄的软木塞切片。虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间同样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。
此后，显微镜制造和显微观测技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。那么，光学显微镜是否可以无止境地“放大”下去，让我们想看到多小就能看到多小？科学家为此做了很多尝试，最终发现，存在一道法逾越的“墙”—衍射极限。
1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点通过光学系统成像后，不也许得到抱负的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，假如这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。
阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的一半(d=λ/2)。可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（0.2微米）左右。假如物体小于0.2微米，你依旧看到的是一个模糊的光斑。这就是很长一段时间内，光学显微镜的分辨极限——衍射极限。

2.2 突破衍射极限
为了更进一步的观测世界，后来有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，人们借助它们可以看得更“细”。但是这些设备仍然没有突破衍射极限，他们仍然遵循着阿贝衍射极限。这些设备使用的是电子束等波长非常短的入射光，自然，它们的分辨率就高。比如电子显微镜，分辨率可以达成0.5埃（一埃等于十分之一纳米），这样就可以看到一粒一粒的原子。
由于生物学、医学方面的研究，更希望在生命体存活的自然状态下进行观测，在这方面，光学显微镜有它不可比拟的优势。因此，光学显微镜的研发还是世界科学家的研究热点。突破性的进展发生在本世纪初，近年来，随着新的荧光探针和成像理论的出现，研究者开发了多种实现超过普通共聚焦显微镜分辨率的三维超分辨率成像方法。较成熟的有基于单分子成像的超分辨率显微成像方法，涉及光激活定位显微技术 (photoactivated localization microscopy, PALM) 和随机光学重构显微技术 (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。以及两大类通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的方法，分别是受激发射损耗显微技术(stimulated emission depletion, STED)和饱和结构照明显微技术。
(参考文献：吕志坚，陆敬泽.几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展)
以上这些进展,都让光学显微镜突破了衍射极限，我们称之为“超分辨成像技术”。美国光学学会把它列为21世纪光学五大研究计划之首。

三 超高分辨率显微技术
3.1光激活定位显微技术PALM
当显微镜需要分辨两个或者更多点光源的时候，很难突破光学分辨率的极限来进行精拟定位．而当显微镜的物镜视野下仅有单个荧光分子的时候，通过特定的算法拟合，此荧光分子位置的精度可以很容易超过光学分辨率的极限，达成纳米级．
如上所述，尽管单分子的定位精度可以达成纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多 个 点 光 源 时 的 分 辨 率．2023 年 ， Patterson 和Lippincott-Schwartz初次运用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA-GFP)来观测特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋白 PA-GFP 在未激活之前不发光，用 405 nm 的激光激活一段时间后才可以观测到 488 nm 激光激发出来的绿色荧光．德国科学家 Eric Betzig 敏锐地结识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2023 年 9 月， Betzig和 Lippincott-Schwartz 等初次在 Science 上提出了光激活定位显微技术( photoactivated localization microscopy, PALM) 的 概 念 ． 其 基 本 原 理 是 用PA-GFP 来标记蛋白质，通过调节 405 nm 激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用 488 nm 激光照射，通过高斯拟合来精拟定位这些荧光单分子．在拟定这些分子的位置后， 再长时间使用 488 nm激光照射来漂白这些已经定位对的的荧光分子，使它们不可以被下一轮的激光再激活出来．之后，分别用 405 nm 和 488 nm 激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环．这个循环连续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精拟定位．将这些分子的图像合成到一张图上， 最后得到了一种比传统光学显微镜至少高 10 倍以上分辨率的显微技术，如图 1 所示。PALM 显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达成 1 nm 的数量级。2023 年， Betzig 的研究小组更进一步将PALM 技术应用在记录两种蛋白质的相对位置，并于次年开发出可应用于活细胞上的PALM 成像技术来记录细胞黏附蛋白的动力学过程。
（参考文献：Patterson G H, Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells；
Betzig E, Patterson G H, Sougrat R, et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution；
Shroff H, Galbraith C G, Galbraith J A, et al. Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes）
图1：应用PALM技术定位单个荧光分子最后实现超分辨率成像的示意图
A， B， C， D， E， F 展示了实际实验过程及得到的原始数据； A′，B′， C′， D′， E′， F′ 展示了用高斯拟合拟定荧光分子的中心，叠加产生了超分辨率图像； (A, A′) 未激活任何荧光分子时； (B, B′) 用
405 nm 的激光激活了 4 个荧光分子； (C, C′) 用 488 nm 的激光观测一段时间后漂白了第一轮激活的 4 个荧光分子； (D, D′)第二轮重新激活的此外的几个荧光分子； (E, E′) 两轮激活的荧光分子总和组成的图像； (F, F′) E 图的局部放大
3.2多色随机光学重构显微法
PALM 的成像方法只能用来观测外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力。但是运用化学小分子Cy3和Cy5、 Cy7等荧光分子对的光转换效应同样可以达成突破光学极限的效果。这项技术被称为“随机光学重建显微术” (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。其发明人是哈佛大学的庄小威专家。这项技术是用很弱的光激发荧光分子，使细胞内的一小部分荧光分子发光，而不是所有。这样由于发光的点分布比较分散，重叠比较少，因此每个光晕可以近似为一个荧光分子。在一次激发中，可以拟定一部分光晕的中心，在下一次激发中，可以拟定此外一部分光晕的中心，把这许多次激发的结果叠加，就是完整而清楚的图像（图2）。因此， STORM需要运用荧光发色团标记抗体对靶蛋白进行辨认，可以检测到内源性蛋白，避免由于外源性表达偶联荧光蛋白的靶蛋白对其定位产生的也许的影响，但是在活细胞应用中受到限制，并且也有也许受到免疫荧光染色过程的影响。随后，他们又运用光学像散性实现了3D STORM，达成了平面20~30 nm，纵向50~60 nm的成像精度。
（参考文献：夏鹏，窦震.超高分辨率显微技术研究进展；
Huang B, Wang W, Bates M, et al. Three-dimensional superresolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy）
运用某些荧光小分子自身可被反复激发淬灭的性质，通过与STORM相似的操作方法，可以实现单一荧光分子的超高分辨率成像，这一方法大大简化了原始STORM的样品制备过程，被称为dSTORM(direct STORM)。值得一提的是，庄小威研究组将SNAP标签与靶蛋白融合表达，同时将荧光分子偶联到可以结合SNAP标签的小分子化合物上，进而标记靶蛋白，再通过减少溶解氧消耗系统以及脂肪族巯醇的添加量，成功地在三维超高分辨率的成像中实现了空间分辨率平面30 nm，轴向50 nm，时间分辨率1~2 s的优异效果。故意思的是几种细胞膜标记物也被鉴定出具有光转换性质，并被用于超高分辨率显微成像，在活细胞中得到了30~60 nm的空间分辨率和1~2 s的时间分辨率。最近，基于ImageJ的PALM/STORM数据解决插件已经发布，为这两种关键技术的应用提供了极大便利。
（参考文献：Heilemann M, van de Linde S, Schuttpelz M, et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes；
杨光.随机光学重建显微中的光学设计与数据解决）
但是， STORM 方法也存在缺陷，由于用抗体来标记内源蛋白并非一对一的关系，所以STORM 不能量化胞内蛋白质分子的数量，同时也不能用于活细胞测量。
（参考文献：毛铮乐，王琛.超分辨远场生物荧光成像-突破光学衍射极限）

图2：随机光学重构显微技术效果图
3.3 STED受激发射损耗显微术
在1994年， Stefan提出了一种理论，运用受激辐射损耗原理，将一束由相位调制产生的空心环形激光围绕激发光，导致环形区域内的分子受激辐射，而只有光束中心部分的荧光分子被激发光照射产生自发辐射，进而被独立检测出来。随着环形激光强度不断升高，其孔径也相继减小，藉此突破光学极限(图3)。他们将这种显微镜技术命名为STED(stimulated emission depletion microscopy)。几年后他在哥廷根大学制造出了这种显微镜，将xy轴分辨率水平从200 nm提高到了70 nm左右(图3)，成功地打破了光学分辨率极限。随后， Hell领导的研究组又通过将STED与4Pi结合以及通过两种相位调制的方法，将其从二维成像扩展到三维(3D STED)，实现了xyz三个方向上的超高分辨率成像。由于STED技术以共聚焦显微镜为基础，因而在成像深度上具有很大的优势，实验证实其可以在350厚度的脑切片中得到极高的分辨率。目前应用STED技术已经实现了在活体小鼠中直接对脑组织进行观测，其观测深度达10~15 ，分辨率至少达成70 nm。
（参考文献：夏鹏，窦震.超高分辨率显微技术研究进展）
应用 STED 成像，点光源的光斑大小直接发生 改 变 ， 其 半 高 宽 大 小 从 传 统 的 变 成，其中 I 是 STED 激光器的最大聚焦强度，而 Isat 则是当受激荧光强度被减少到 1/e时的 STED 激光的强度特性值．由此公式可看出，当 I/Isat 的值趋近无穷大时， STED 成像的点光源的半高宽趋近于 0，亦即分辨率不再受光的衍射过程所限制．STED 成像技术的最大优点是可以快速地观测活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广泛．例如，应用成熟的 STED 显微成像技术发现，海马神经元上囊泡蛋白 synatotagminⅠ在各种刺激后都以一种“簇”的形式存在于神经突触前端膜上，这初次揭示了这种膜蛋白以集合的形式存在于细胞质膜上然后被统一回收的方式。之后 Hell等又进一步发展了这种方法，使之可以用于 EGFP标记的信号和多种颜色的超分辨率检测．目前， STED 作为一种成熟的方法，已经可以高速地监测活细胞内高分辨率图像。例如在2023年Science上发表的文章表白，应用STED技术已经可以以视频的速度(每秒 28 帧)来采集记录神经细胞内突触小泡的高分辨率图像(50 nm)。
（参考文献：吕志坚，陆敬泽.几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展；
Willig K I, Kellner R R, Medda R, et al. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy；
Meyer L, Wildanger D, Medda R, et al. Dual-color STED microscopy at 30-nm focalplane resolution）
STED技术的局限性之处在于光学系统实现起来比较困难，需要非常强的STED激光来克制受激点光源的激发。因此， Stefan进一步对这个系统进行了改善，他找到了一些具有可反复激发淬灭特性的荧光分子，运用其特性，将STED激光以高频蓝光代替，使得激发光束中心的点光源周边的分子非常快速的被淬灭，待中心点光源成像后再移动光束进行下一个位置的激发-淬灭循环。这个改善中使用的高频蓝色激光所需要的能量较STED激光缩小了千倍，大大减少了对光学系统的规定。运用这种原理， Stefan小组进一步发明了GSDIM(ground state depletion with individual moleculereturn)，可运用多种小分子进行超高分辨率显微成像，可以得到50~70 nm的分辨率。但是为使这些小分子可以反复激发和淬灭，需要在溶液中添加一种溶解氧消耗系统以及脂肪族巯醇，使得其无法应用于长时间的活细胞观测。而后来发现的一些可反复激活型荧光蛋白，使得该方法在活细胞层次上的应用得到了进一步加强。

图2：STED超高分辨码率成像技术
3.4 饱和结构照明显微技术SSIM
改变光学的点扩散函数来突破光学极限的另一个 方 法 是 利 用 饱 和 结 构 照 明 显 微 技 术(saturated structure illumination microscopy, SSIM)．早在 1963年， Lukosz 和 Marchand就提出了特定模式侧向入射的光线可以用来增强显微镜分辨率的理论．2023 年，加州大学旧金山分校的 Gustafsson 博士一方面将非线性结构性光学照明部件引入到传统的显微镜上，得到了分辨率达成 50 nm 的图像。SSIM技术的原理是将多重互相衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息，如图4所示。
（参考文献：吕志坚，陆敬泽.几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展；
候尚国.基于多种非线性效应的超分辨成像研究)

图4：通过衍射的莫阿干涉效应来提高分辨率
当一个未知结构的物体(a)被一个结构规则的照射模式(b)的光所照射时，会产生云纹条纹(moiré fringes)(c)．云纹条纹发生在采样物体的空间频率与照射光线的空间频率有差异的地方．显而易见，在显微镜下直接观测，就可以看到它放大了原先不可以分辨出来的样本结构．通过计算机进一步分析所有条纹中包含的信息，可以重组出样本的高分辨率图像。

四 超高分辨率成像技术的发展趋势
4.1 z平面轴向的超高分辨率需求
以上所讨论的几种超分辨率成像方法，其分辨率的改善都在 xy 平面．而事实上，由于传统显微镜在光传播方向上(z 轴)的点扩散函数的半高宽敞约为 ，小于 xy 平面的半高宽 ，因此其理论 z 轴分辨率本来就低于其 xy 平面的分辨率．此外，对厚的生物样本进行显微三维成像时，由于样本自身的折射系数与物镜的折射系数不同，在 z 轴方向上产生显著的球面象差(spherical aberration)，从而使图像在 z 轴上的分辨率减少．假如要充足观测细胞内的三维精细图像，就必须大幅度提高成像的 z 轴分辨率．因此，近年来，国际上各个研究超分辨率显微成像的小组也不断地探索提高 z 轴分辨率的手段。
（参考文献：孙育杰，陈轩泽.浅谈2023年诺贝尔化学奖：超高分辨率荧光显微成像）

4.2 超高分辨率显微技术发展趋势
与 21 世纪初相比，三维超分辨率显微成像已有很大的发展，有多种不同成像技术实际应用于生物系统的范例，甚至已经出现了商业化的超分辨率显微成像系统．但是，目前的成像模式仍然远远没有达成完美状态，对于固定样本成像其三维分辨率还没有达成可以和电子显微镜相媲美的几个纳米的范围．当前的发展趋势是结合不同成像模式的优点，进一步提高成像的精度和准确度．例如，2023年霍华德 - 休斯研究院的研究人员将 PALM/STORM技术和光的干涉原理结合起来(类似于 4π 和 SSIM成像的原理)，将三维的分辨率提高到 20 nm 以内，并极大地提高了收集同样光子后的定位精度．为了进一步提高图像的分辨率、对比度和成像的灵活性，人们努力的另一个方面是继续开发出量子效率更高、荧光更稳定、颜色不同的荧光蛋白或者是荧光染料．例如， Jennifer Lippincott-Schwarz 实验室于 2023 年 开 发 出 稳 定 的 红 色 光 激 活 荧 光 蛋 白PA-mCherry，使对两种不同蛋白质同时进行超分辨率 PALM 成像成为也许。由于生命现象是非静止的不断歇活动的本质，超分辨率成像应用的一个重要领域是活细胞成像，如近来已有报道的可应用于 活 细 胞 上 的 超 分 辨 率 成 像 技 术 包 括 SSIM 技术、PALM 技术和 STED 技术等。但是，活细胞上快速成像的分辨率远低于固定样本成像，其时间分辨率也较低。因此，当前的研究热点集中在通过改善荧光探针和成像模式来进一步提高活细胞上超分辨率成像的时空分辨率。
（参考文献：Shtengel G, Galbraith J A, Galbraith C G, et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure）
应用和进一步完善超分辨率显微镜成像技术，将使得科学家实时动态观测生物有机体内的生化反映过程成为现实，为深刻结识复杂生命现象的本质打开了黑箱之窗，使得人们可以直观地从基因表达、蛋白质互相作用、信号网络、细胞功能等多层面、多视角观测研究有机体个体发育、遗传进化、重大疾病发生、环境对生命个体影响等生命现象发生、发展的过程，对阐释生命活动的基本规律、揭示疾病发生机理、建立疾病预警系统、提高医疗诊治水平、探寻发现新药物具有重大作用。