近端小管RAS功能轴在早期糖尿病小鼠肾脏中的变化.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（8）：1373-1382杂志网址：http:/近端小管RAS功能轴在早期糖尿病小鼠肾脏中的变化*虎璇1，杨一菲1，韦忠平1，John S.D.CHAN2，苏可1，21武汉大学人民医院肾内科，湖北 武汉430060；2蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM），加拿大 魁北克省 蒙特利尔市 H2X 0A9摘要 目的：观察自发性糖尿病小鼠模型中，糖尿病肾病早期近端小管肾素-血管紧张素系统（RAS）两条轴 血管紧张素转换酶（ACE）-血管紧张素II（Ang II）-血管紧张素II 1型受体（AT1）经典轴和ACE2-Ang（1-7）-Mas受体（MasR）新轴 的变化特征及对肾脏结构和功能的影响。方法：应用雄性自发性1型糖尿病Akita小鼠（以C57BL/6背景的雄性非糖尿病小鼠为正常对照）和自发性2型糖尿病db/db小鼠（以C57BLKS/J背景的雄性db/m非糖尿病小鼠为正常对照），饲养至16周龄时处死小鼠，测定相应生理指标。收集尿液，检测尿液中Ang II和Ang（1-7）的含量；收取肾脏组织行病理切片染色观察肾脏结构变化；免疫组化法观察肾脏组织血管紧张素原（Agt）、ACE、ACE2和MasR的表达部位及变化；Western blot和RT-qPCR测定近端肾小管的上述蛋白及mRNA的变化。结果：两种糖尿病小鼠16周龄时，肾小球滤过率和尿白蛋白/肌酐比值显著增加（P0.05），PAS染色可见近端肾小管细胞体积增加，管腔扩张，肾小管肥大，肾小管损伤分数显著增加（P0.01）。RAS成分检测结果显示，与对照组相比，糖尿病小鼠近端小管Agt和ACE2的蛋白和mRNA表达水平显著升高（P0.01），尿Ang II排泄显著增加（P0.01），而ACE和MasR的蛋白和mRNA表达水平显著下调（P0.01），尿Ang（1-7）含量显著减少（P0.01）。结论：在自发性糖尿病小鼠中，近端小管RAS在糖尿病肾病早期被激活，激活的RAS可能参与糖尿病肾病早期肾小球高滤过、肾小球和肾小管肥大及近端小管损伤。关键词 肾素-血管紧张素系统；近端肾小管；糖尿病肾病；自发性糖尿病小鼠中图分类号 R587.2；R363 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.004Changes of RAS in mouse proximal tubules in early stage of diabetic kidney diseaseHU Xuan1，YANG Yifei1，WEI Zhongping1，John S.D.CHAN2，SU Ke1，21Department of Nephrology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China；2University of Montreal Hospital Research Centre（CRCHUM），Quebec H2X 0A9，Canada.E-mail：ABSTRACT AIM：To observe the changes of renin-angiotensin system（RAS），including the angiotensin-converting enzyme（ACE）-angiotensin II（Ang II）-Ang II type 1 receptor（AT1）classic axis and the ACE2-Ang（1-7）-Mas receptor（MasR）new axis，in the proximal tubule of diabetic mice，and their effects on kidney structure and function in the early stage of diabetic kidney disease（DKD）.METHODS：Male spontaneous type 1 diabetic Akita mice and type 2 diabetic db/db mice were used，and male nondiabetic mice with C57BL/6 background and db/m nondiabetic mice with C57BLKS/J background were used as controls，respectively.At 16 weeks of age，the mice were sacrificed to measure corresponding physiological parameters.Urine was collected，and the levels of Ang II and Ang（1-7）were measured by ELISA.Kidney tissue was collected for pathological section staining to evaluate morphological changes in kidney structure.Immunohistochemistry was used to observe the localization and changes of angiotensinogen（Agt），ACE，ACE2 and MasR in kidney tissues.Western blot and RT-qPCR were used to measure the changes of these proteins and mRNA in isolated proximal renal tubules.RESULTS：The glomerular filtration rate，urinary albumin/creatinine ratio，proximal tubular cell vol文章编号 1000-4718（2023）08-1373-10 收稿日期 2023-02-10 修回日期 2023-05-28*基金项目 国家自然科学基金资助项目（No.81700559）；湖北省自然科学基金资助项目（No.2021CFB360）；Canadian Institutes of Health Research（PJ9-179813 to JSDC）通讯作者 Tel：[phone]；E-mail：1373ume，tubular luminal dilation，tubular hypertrophy and tubular injury score were increased in type 1 and type 2 diabetic mice（P0.05）.The Agt and ACE2 expression levels were increased in proximal tubules of diabetic mice compared with control mice（P0.01），while the ACE and MasR expression levels in proximal tubules of diabetic mice were lower than those in control mice（P0.01）.Urinary Ang II excretion was increased，while urinary Ang（1-7）level was decreased in these 2 types of diabetic mice compared with control mice（P0.01）.CONCLUSION：The proximal tubular RAS in spontaneously diabetic mice is activated in the early stage of DKD.Activation of RAS leads to glomerular hyperfiltration，glomerular and tubular hypertrophy，and proximal tubular injury in the early stage of DKD.KEY WORDS renin-angiotensin system；proximal tubule；diabetic kidney disease；spontaneously diabetic mice糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是终末期肾脏疾病的主要病因之一。肾素-血管紧张素系 统（renin-angiotensin system，RAS）过 度 激 活 是DKD进展的重要机制之一1。肾脏在DKD发生发展过程中不仅受到全身RAS的影响，还受到肾脏局部RAS的影响。大量证据表明，DKD肾脏局部激活的RAS可改变肾脏的血流动力学，改变细胞表型、引起细胞增殖，调节多种生物活性物质（血管活性激素等）的基因表达，并激活成纤维细胞、内皮细胞、系膜细胞等多种细胞内的信号传导通路2，从而促进DKD的进展。RAS系统包括两条相互抗衡的轴，一条是血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）-血管紧张素 II（angiotensin II，Ang II）-血管紧张素II 1型受体（Ang II type 1 receptor，AT1）经典轴，主导促血管收缩、水钠潴留、氧化应激、炎症和纤维化、细胞增殖等作用。另一条血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）-血管紧张素（1-7）angiotensin（1-7），Ang（1-7）-Mas受体（Mas receptor，MasR）轴能对抗RAS经典轴的作用，发挥舒张血管、抗纤维化和利尿、降低氧化应激、抗细胞增殖的作用，保护肾脏免于损伤3。这两条相互对抗的轴之间的平衡决定了肾脏结局最终走向。既往研究显示，DKD患者肾活检标本中肾小球和肾小管中ACE2表达下调、ACE表达上调，且与肾小球滤过率呈负相关4。那么在DKD的早期肾脏中ACE和ACE2介导的RAS两大功能轴如何变化？本研究应用自发性1型糖尿病Akita小鼠和自发性2型糖尿病db/db小鼠5-6，观察在DKD早期阶段，近端肾小管RAS成分的变化，旨在揭示肾小管 ACE-Ang II-AT1和ACE2-Ang（1-7）-MasR两条RAS轴在DKD早期的变化特征。材料和方法1动物1型和2型自发性DKD小鼠模型的建立：78周龄 C57BL/6 背景的雄性 Akita 小鼠与雌性野生型（wild-type，WT）C57BL/6小鼠按1 2近交繁殖，产生子1代生长至45周龄时，经基因型鉴定和测量尾静脉随机血糖，随机血糖大于16.7 mmol/L的小鼠判定为 1 型 糖 尿 病 Akita 鼠7，同 窝 血 糖 正 常 的 WT C57BL/6小鼠为正常对照（下文用WT表示）。78周龄C57BLKS/J背景的db/m雄性和雌性小鼠按1 2近交繁殖，产生子1代生长至68周龄时观察颜色和体型，尾静脉测量随机血糖，黑色、肥胖且血糖大于16.7 mmol/L的小鼠为db/db 2型糖尿病小鼠7，同窝出生黑色瘦小鼠为 db/m正常对照。本研究中糖尿病小鼠和对照组小鼠的子1代雄性小鼠用于实验。所有亲代动物均购自Jackson Laboratory，以常规饲料饲养于加拿大蒙特利尔大学医院研究中心（University of Montreal Hospital Research Centre/Centre de Recherche du Centre Hospitalier de lUniversit de Montral，CRCHUM）动物房（SPF级）。所有动物实验均经过 CRCHUM 动物伦理委员会批准并遵循动物福利原则。2主要试剂及仪器Percoll细胞分离液（Cytiva）；胶原酶、菊粉（inulin）-荧光素异硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，FITC）和DMEM/F-12培养液（Sigma-Aldrich）；透析袋MW3500 Fisherbrand 及 Autokit Glucose 葡萄糖检测试剂盒（FUJIFILM Wako）；尿白蛋白 ELISA 试剂盒（Ethos Biosciences）；ACE抗体（Santa Cruz）；ACE2抗体（R&D）；MasR 抗体（Novus Biologicals）；血管紧张素原（angiotensinogen，Agt）抗体由CRCHUM的Chan Lab自制8；DAB显色试剂盒（Santa Cruz）；小鼠 Ang II和Ang（1-7）含量检测ELISA试剂盒（BMA Biomedicals）；C18 Sep-Pak columns（Waters）。Accu-Chek Performa型血糖仪（Roche）；BP-2000尾套法血压仪（Visitech Systems）；Victor 3V 酶标仪（Perkin Elmer）；ChemiDoc凝胶成像系统（Bio-Rad）；7500型实时定量PCR仪（Applied Biosystems）。3主要方法3.1一般指标检测和标本采集糖尿病组小鼠和1374对照组小鼠（每组小鼠911只），从8周龄开始，每2周监测小鼠体重、随机血糖、尾套法测量血压，至16周龄末处死小鼠。处死前2 d代谢笼收集6 h尿液标本，按照ELISA试剂盒说明书测量尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin/creatinine ratio，UACR）。处死前1 d禁食过夜，处死当天尾静脉注射5%inulin-FITC，注射后分别于3、7、10、15、35、55和75 min用肝素抗凝毛细管采集股静脉血，用于测量肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）9。处死后心脏采血，离心分离血清，应用Autokit Glucose检测试剂盒（葡萄糖氧化酶法）检测禁食后血清葡萄糖水平。取新鲜右肾分离近端肾小管，左肾固定在福尔马林溶液中，用于形态学观察。3.2近端肾小管分离近端肾小管分离采用改良后的Percoll密度梯度分离法9-11。将立即处死的小鼠右肾取出，去除肾蒂及包膜，切碎肾皮质，1 g/L胶原酶 37 消化 45 min，100 目尼龙网过筛，在 42%Percoll分离液中用冷冻高速离心机4、27 822g离心30 min，离心后取近管底的一层即为分离纯化的近端肾小管。分离纯化的近端肾小管保存于80 冰箱用于蛋白和mRNA的检测。3.3PAS染色和肾脏病理形态学观察取已固定的小鼠肾脏制成3 m厚的石蜡切片，行PAS染色，观察小鼠肾脏组织病理形态变化。应用 Motics Images Plus 2.0软件，测量和计算平均肾小球体积、近端肾小管细胞平均体积、肾小管管腔扩张情况。平均肾小球体积大小计算方法参照Weibel-Gomez方法12，每张切片随机测量30个肾小球面积，计算公式：平均肾小球体积=肾小球面积1.51.382/1.01。近端肾小管细胞平均体积测量方法参照文献13-15，按照球体积公式V=4r3/3计算近端肾小管细胞平均体积（r指肾小管细胞从细胞核中心至细胞边缘的平均半径），每张切片测量外皮质100个肾小管细胞的体积来计算平均体积。肾小管管腔面积的测量方法参照文献13-15，每张切片测量100个近端肾小管，计算肾小管管腔面积平均值。根据肾小管扩张、萎缩、管型、刷状缘脱落、基底膜增厚等指标，对肾小管损伤程度进行15分的评分16。3.4免疫组织化学染色石蜡切片脱蜡后，采用pH 6.0的柠檬酸钠微波加热修复抗原，3%H2O2封闭内源性过氧化酶，分别加入抗 Agt抗体（1 300）、ACE抗体（1 250）、ACE2抗体（1 200）和MasR抗体（1 200），4 过夜，再加生物素标记的抗IgG（1 200），DAB显色液。显微镜下观察各蛋白定位与表达并拍照，使用ImageJ软件（https：/rsb.info.nih.gov/ij）定量分析阳性染色的平均光密度。3.5尿 Ang II和 Ang（1-7）的检测方法将非糖尿病小鼠尿液 180 L 和糖尿病小鼠尿液 360 L 用C18 Sep-Pak columns进行纯化，按照小鼠尿液Ang II和Ang（1-7）含量检测ELISA试剂盒说明书推荐方法进行检测，并用尿肌酐进行标化17-18。3.6Western blot实验取分离纯化的近端肾小管，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂cocktail，4 超声破碎裂解蛋白，于 4、13 800g 离心 10 min，取上清，BCA法测定总蛋白浓度。进行SDSPAGE，转膜，牛血清白蛋白封闭2 h，孵育抗 Agt抗体（1 1 000）、ACE抗体（1 500）、ACE2抗体（1 500）和actin抗体（1 10 000），4 过夜，抗室温孵育2 h，ECL显色，Bio-Rad ChemiDoc 凝胶成像系统曝光。应用 Image Lab软件分析处理图像。3.7RT-qPCR实验Trizol法提取分离纯化的近端肾小管总RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA纯度和含量，采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。加入SYBR Green Mix和引物进行扩增和分析，用核糖体蛋白L13A（ribosomal protein L13A,RPL13A）进行标化，每个样本设2个复孔，采用2Ct法计算mRNA的相对表达量。Agt的上游引物序列为5-CCACGCTCTCTGGATTTATC-3，下游引物序列为 5-ACAGACACCGAGATGCTGTT-3；Mas1 的上游引物序列为5-GCATTCGTCTGTGCCCTTCT-3，下游引物序列为 5-TTCCGTATCTTCACCACCAAGA-3；RPL13A 的上游引物序列为 5-GCCCCACAAGACCAAGAGAG-3，下游引物序列为5-TAGGCTTCAGCCGAACAACC-3。4统计学处理采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均数标准差（meanSD）表示。两组间均数比较采用独立样本t检验。以P0.05为差异有统计学意义。结果1小鼠生化及肾脏病理改变Akita小鼠45周龄左右出现血糖升高，db/db小鼠45周龄左右出现肥胖，68周龄血糖升高。至16周龄时，分别与WT小鼠和db/m小鼠相比，Akita小鼠和db/db小鼠的血糖、肾脏重量、肾重/胫骨长和GFR均显著增加（P0.01），见表1和图1A。两种糖尿病小鼠的UACR随周龄增加而增加，至16周龄时较非糖尿病小鼠显著增加（P0.05），见图1B。两种糖尿病小鼠的体重变化符合1型或2型糖尿病小鼠模型1375的表现，自8周开始监测起，Akita小鼠体重低于WT小鼠，db/db小鼠体重显著高于db/m小鼠（P0.01），见表1。PAS染色可见糖尿病组小鼠肾组织肾小球体积增大、系膜基质增生、肾小管扩张、刷状缘不完整、部分小管细胞核脱落，见图 2A。与非糖尿病小鼠相比，肾小球体积、近端肾小管细胞体积、近端小管管腔扩张面积、肾小管损伤评分在2种糖尿病小鼠肾脏组织中显著增加（P0.01），见图2B。2小鼠肾脏Agt表达变化肾脏组织石蜡切片免疫组化染色结果显示，Agt主要分布于近端小管，肾小球内可见少量表达，见图3A。光密度分析结果显示：与各自对照组相比，Agt在 Akita 和 db/db 小鼠近端小管中的表达显著升高（P0.01），见图3B。在分离近端小管中检测Agt的mRNA表达，RT-qPCR结果显示，Akita和db/db鼠近端肾小管中Agt mRNA显著高于各自对照的非糖尿病小鼠（P0.01），见图3C。3小鼠肾组织ACE和ACE2表达变化肾脏组织石蜡切片免疫组化染色结果显示，ACE和ACE2主要表达在皮质区域肾小管的刷状缘，见图4A。免疫组化光密度分析结果显示与对照组比，ACE在两种糖尿病小鼠的皮质肾小管中表达显Figure 1.Changes of glomerular filtration rate（GFR）and urinary albumin/creatinine ratio（UACR）in mice.A：GFR was measured by injecting inulin-FITC via the tail veil in 16-week-old mice（MeanSD.n=9.Each dot represents one mouse）；B：UACR was measured at 8，12 and 16 weeks of age（MeanSD.n=7 in WT group at 8 weeks of age；n=8 in db/m group at 12 weeks of age；n=9 in other groups.Each dot represents one mouse）.*P0.05，*P0.01 vs WT group；#P0.05，#P0.01 vs db/m group.图12种自发性糖尿病小鼠16周龄时肾小球滤过率的变化和不同周龄小鼠尿白蛋白/肌酐比值的变化表 116周龄糖尿病小鼠生理数据Table 1.Physiological data from 16-week-old diabetic mice（MeanSD.n=9）BiomarkerBody weight（g）FBG（mmol/L）RBG（mg/dL）RW（mg）RW/TL（mg/mm）WT29.131.059.130.36245.1032.50274.609.1113.310.26Akita22.731.01*21.602.20*942.3049.18*403.7031.34*19.961.38*db/m29.951.128.780.36299.7029.15419.5019.6518.510.52db/db54.761.57#28.180.35#838.9076.34#555.0012.35#25.090.60#FBG：fasting blood glucose；RBG：random blood glucose；RW：renal weight；TL：tibial length.*P0.01 vs WT group；#P0.01 vs db/m group.1376著降低（P0.01）；而 ACE2表达在两种糖尿病鼠皮质肾小管中表达升高（P0.01），见图 4B。Western blot结果与免疫组化结果一致，与各自对照相比，在近端肾小管中 ACE 表达在糖尿病组显著降低，而ACE2表达在糖尿病组显著升高（P0.05），见图4C。根据Western blot检测的蛋白表达量计算ACE2/ACE比值，在两种糖尿病小鼠近端小管中，ACE2/ACE比值升高（P0.01），见图4D。4糖尿病小鼠尿Ang II和Ang（1-7）含量的变化与各组非糖尿病小鼠相比，尿液 Ang II尿肌酐的含量在糖尿病小鼠中显著升高，而糖尿病小鼠尿液Ang（1-7）的含量却显著低于对照组（P0.01），见图5A、B。同时，免疫组化及mRNA结果显示，MasR在糖尿病小鼠中表达均低于非糖尿病小鼠（P0.01），见图5CE。讨论RAS系统可分为循环RAS和局部RAS两部分。两个系统的 RAS均影响肾脏结局。DKD 肾脏局部RAS激活促进 DKD 的进展。激活的 RAS系统可改变肾脏的血流动力学，改变细胞表型、调节血管活性激素等的基因表达，并激活成纤维细胞、促进肾小管间质纤维化和肾小球硬化2。在RAS系统中Agt被肾素剪切生成Ang，Ang被ACE水解形成Ang II，从而诱导血管收缩。ACE2能够水解 Ang的一个氨基酸使之转化为Ang（1-9），或直接水解Ang II直接生成大量Ang（1-7）来对抗Ang II活性19。本研究观察到肾内RAS系统的几个成分在糖尿病和非糖尿病小鼠肾小管中差异显著。在1型和2型糖尿病鼠肾小管中Agt和ACE2表达增加，而ACE表达降低；尿Ang II含量升高，而尿Ang（1-7）含量降低。这说明肾Figure 2.Pathological changes of kidney tissues in the 2 types of spontaneously diabetic mouse models（PAS staining，scale bar=50 m）.Glomerular and tubular size was measured using Motic Images Plus 2.0 software.A：mouse kidney stained with PAS；B：glomerular tuff volume，proximal tubular cell volume，renal tubular luminal area and renal tubular injury score were shown.MeanSD.n=6.Each dot represents one mouse.*P0.01 vs WT group；#P0.01 vs db/m group.图22种自发性糖尿病小鼠肾组织的PAS染色观察及肾小球肾小管损伤评价1377内RAS系统参与DKD的进展过程。人类DKD的临床及病理表现为蛋白尿、肾小球体积增大，系膜基质增生、肾小球基底膜增厚，发展至临床糖尿病肾脏疾病期时肾小球内可出现典型的K-W结节，患者可出现大量蛋白尿，随之GFR下降；随疾病进一步进展，至晚期时发展为肾衰竭期，50%以上肾小球硬化，小管间质纤维化20。本研究中我们使用的两种自发性糖尿病小鼠与非糖尿病小鼠相比，血糖显著升高，肾脏表现为肾脏体积增大、GFR明显升高、肾小球体积增大、系膜基质扩张、16周龄尿蛋白显著增加，符合人类DKD临床分期的早期阶段（即高滤过期和微量蛋白尿期）。在本研究中选取雄性小鼠为研究对象，是因为1型糖尿病Akita雄鼠高血糖症状较雌鼠更为严重，雌鼠可能是由于受到雌激素的保护作用，血糖升高不如雄鼠明显21。此外，我们使用肾重/胫骨长度替代肾重/体质量来评价小鼠肾脏大小，主要为了避免因Akita小鼠多尿脱水体重减轻和db/db小鼠肥胖引起的体重变化而产生偏差，故使用胫骨长度作为归一化处理指标22-23。因此这两种16周龄的小鼠可以很好模拟人类DKD的早期高滤过状态。本研究利用该模型观察 DKD 早期在高滤过状态下，应用近端肾小管分离技术，观察近端肾小管内局部 RAS 的变化以及对肾脏整体结构和功能的影响。我们的研究结果显示Agt主要分布在近端小管，且在糖尿病状态下Agt蛋白水平和mRNA水平均显著升高，说明高糖可以刺激肾小管内 Agt的自身合成，这与文献报道的研究结果一致17-18，24-26。但是需Figure 3.Angiotensinogen（Agt）expression in kidneys from the 2 types of spontaneously diabetic mice was assessed by immunohistochemical staining，and Agt mRNA expression in isolated proximal tubular cells was assessed by RT-qPCR.A：immunohistochemical staining of Agt（scale bar=50 m）；B：semiquantitative analysis of Agt expression by ImageJ software（n=6）；C：Agt mRNA expression in isolated proximal tubular cells（n=9）.MeanSD.*P0.01 vs WT group；#P0.01 vs db/m group.图32种自发性糖尿病小鼠中肾脏Agt的免疫组化染色观察及近端肾小管中Agt mRNA表达变化1378要注意的是，肾小管中Agt蛋白的增加并不单纯来源于近端小管 S3段自身合成产生的 Agt，还来源于肾小管重吸收血液循环中的Agt。循环系统中主要由肝脏合成产生的Agt被分泌入血液循环后，通过肾小球的滤过作用，被排泄至尿液，尿液中的Agt被近端小管以 megalin 蛋白依赖性方式27或细胞内吞方Figure 4.The expression of ACE and ACE2 in kidneys from the 2 types of spontaneously diabetic mice was assessed by immunohistochemical staining，and the protein expression of ACE and ACE2 in isolated proximal tubular cells was assessed by Western blot.A：immunohistochemical staining of ACE and ACE2（scale bar=50 m）；B：semiquantitative analysis of ACE and ACE2 expression by ImageJ software（n=6）；C：ACE and ACE2 protein expression in isolated proximal tubular cells of type 1 diabetic mice and type 2 diabetic mice（n=4）；D：the ratio of ACE2-to-ACE protein expression in the proximal tubule（n=4）.MeanSD.*P0.05，*P0.01 vs WT group；#P0.05，#P0.01 vs db/m group.图42种自发性糖尿病小鼠中肾脏ACE和ACE2的免疫组化染色观察及近端肾小管中ACE和ACE2蛋白表达变化1379式28重吸收至肾小管内。虽然，在肾脏组织的免疫组化染色中无法区分Agt是来源于肝脏还是来源于肾脏，但是也有研究显示，Agt在Akita和db/db鼠血浆中的含量与非糖尿病鼠相比没有差异17，29，这提示血液循环中的Agt在糖尿病或非糖尿病状态下并无差异，同时也说明，肝脏产生的Agt在糖尿病或非糖尿病状态下含量无显著差异。但是，也有研究显示，在ZDF 2型糖尿病肥胖大鼠血浆中Agt含量低于ZDF瘦大鼠，但是尿Agt含量在ZDF 2型糖尿病肥胖大鼠中确显著升高30，该研究结果说明，糖尿病状态并没有增加肝脏Agt的合成，但增加了肾脏Agt的产生。我们的研究也表明，糖尿病状态下Agt在近端肾小管表达增加，虽然无法区分Agt来源，但分离的近端小管中Agt mRNA增加，仍可说明糖尿病状态使肾小管Agt的合成增加。ACE和ACE2共同表达于小鼠近端小管的刷状缘。但也有研究报道ACE2主要表达在肾小球足细胞，少量存在于肾小球系膜细胞；ACE局限存在于肾小球血管内皮细胞31-32。ACE 和 ACE2的平衡维持着肾内 RAS 的稳态，ACE/ACE2 之间的相对平衡决定着Ang II和Ang（1-7）的生成量33-34。本研究结果显示，DKD小鼠近端小管中ACE表达降低，但ACE2表达增加。通过分析PAS染色结果，糖尿病小鼠肾小管虽有扩张，但大部分肾小管刷状缘完整，因此，我们认为ACE降低的原因并不是因为肾小管完整性被破坏。虽然本研究结果显示，在糖尿病状态下ACE表达减少，ACE2/ACE比值增加，但尿Ang II增加，似乎与DKD状态下ACE-Ang II-AT1轴被激活相Figure 5.The levels of urinary Ang II and Ang（1-7）in the 2 types of spontaneously diabetic mice were assessed by ELISA，and renal MasR protein and mRNA expression levels were assessed by immunohistochemical staining and RT-qPCR，respectively.A：urinary Ang II/creatinine ratio（n=7）；B：urinary Ang（1-7）/creatinine ratio（n=7）；C：immunohistochemical staining of MasR in the kidney（scale bar=50 m）；D：semiquantitative analysis of MasR expression in the kidney by ImageJ software（n=6）；E：Mas1（the gene that encodes MasR）mRNA expression in the proximal tubule cells（n=9）.MeanSD.*P0.01 vs WT group；#P0.01 vs db/m group.图52种自发性糖尿病小鼠尿Ang II和Ang（1-7）含量变化及肾脏MasR蛋白和mRNA表达变化1380矛盾。但是，我们的结果与Ye等358周db/db小鼠和Ander 等29在 20 周 db/db 小鼠中的研究结果一致。Ye等35研究显示，db/db鼠肾脏和血清中的 ACE 酶活性均降低，而肾脏ACE2酶活性与db/m比较无统计学差异，但血清ACE2酶活性却在db/db鼠中明显升高。其可能的解释为：在 DKD 高滤过期 ACE 降低、ACE2的升高可能是一种早期肾脏为了对抗Ang II升高的一种代偿作用，即通过限制Ang II的聚集和促进Ang（1-7）的合成产生，来制衡肾内RAS系统的激活29，35。随后，通过测定RAS系统的活性成分，我们发现糖尿病小鼠尿液中 Ang II 含量升高，而 Ang（1-7）含量低，且Ang（1-7）的受体MasR表达也下降，说明DKD中RAS系统激活，Ang II增多是导致DKD走向终末期的最终结局。虽然ACE2表达增加，但由升高的ACE2裂解生成的Ang（1-7）含量增加并不足以对抗Ang II所导致肾脏损伤的最终结局。在糖尿病患者肾活检组织中ACE和ACE2的表达也与我们的研究结果不一致。Reich等36在人肾活检组织中观察到，2型DKD患者ACE2 mRNA和蛋白在肾小球和近端小管表达均减少，而ACE mRNA和蛋白在肾小球和近端小管表达均增加。该研究中这些糖尿病肾活检患者的 eGFR 的中位值为 29 mL/（min 1.73 m2），蛋白尿中位值为 2.12 g/24 h，即患者已处于临床DKD期（Mogensen分期期），所以我们认为在临床 DKD期或终末期，肾小管功能失代偿，ACE表达增加、ACE2 表达下降，ACE-Ang II-AT1 轴激活，使Ang II形成增加，加速了DKD的进展。综上所述，在自发性糖尿病小鼠中，DKD高滤过期，近端肾小管Agt合成增加，尿Ang II含量增加，尿Ang（1-7）含量减少，表现出肾脏局部RAS激活；而近端小管的ACE2表达升高和ACE降低则是为了制衡肾内局部RAS的激活。参考文献1Chawla T，Sharma D，Singh A.Role of the renin angiotensin system in diabetic nephropathy J.Wor