云南省教育厅科研基金一般项目申请书.doc

受理编号 云南省教育厅科学研究基金项目申请书项 目 名 称：通过全反式维甲酸治疗获得成熟树突状细胞治疗早幼粒细胞白血病的作用及机制 项 目 类 别： 一般项目 所属学科及代码： 320.2430 项 目 负 责 人： 朱键 所 在 学 校： 大理学院 申 请 日 期： 2011年11月26日 云南省教育厅 制填 报 说 明 一、请按云南省教育厅科学研究基金项目检查、评价实施办法及云南省教育厅科研经费管理办法的有关规定，如实填写各项内容。申请项目必须符合基金资助范围；各项内容要实事求是，逐条认真填写。二、申请书填写一律采用WORD软件、电脑打印，纸质材料要求A3纸双面印刷，中缝装订。三、部分栏目填写要求： 项目名称应确切反映研究内容，最多不超过25个汉字。 研究类别根据研究内容分为人文社科和科学技术。 项目性质根据研究类别而定，如研究类别为人文社科，其项目性质选基础研究、应用研究、实验与发展中一种，如研究类别为科学技术，其项目性质选基础研究、应用研究、实验与发展、R#D成果应用、其他科技服务中的一种。 所属学科及代码以学科代码表（国表）为准。 研究时间开始时间填“2009年6月”；完成时间不超过2012年6月。 一、项目基本情况项目负责人信息姓 名朱键性 别男出生年月1987.3民族汉学 历研究生学 位硕士专业技术职称无联系电话[phone]E-mailNowzhu通讯地址大理学院荷花校区华鑫公寓2栋邮政编码670001项目基本信息研究类别科学技术项目性质应用研究所属学科临床医学学科代码320起止年月2011年11 月 2012 年6 月申请资助5000元自筹经费0元合作单位信息单位名称昆明市儿童医院联系人吴茜联系电话[phone]项目摘要目前在白血病的研究中发现如何获得临床上需要的有功能的LDc，在白血病细胞免疫研究和临床治疗中有重要的理论和实践意义，所以本项目通过采用全反式维甲酸(ATRA)的治疗，在项目中设定实验组和对照组，对实验组采用新的治疗方式，验证急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞在ATRA的作用下转化为成熟的树突状细胞后对APL的治疗及解决微小残留病（MRD）及复发的问题。二、项目组情况序号姓名出生年月性别职称/学位从事专业所在单位课题分工投入时间（月）签名1朱键1987.3男硕士儿科学大理学院联系实验材料的来源62陆磊1989.2男硕士外科学大理学院负责项目的实验过程63代金灿1987.12男硕士外科学大理学院负责实验结果的统计整理64邓东佳1986.11女硕士儿科学大理学院负责查阅相关文献65总人数4高级中级初级博士生硕士生4本科生注：1、项目组人员不得超过5人，其中包括项目负责人。2、签名不得使用打印或印刷体。三、研究依据及意义按以下主要提纲逐项填写：（1）研究的意义；（2）国内外研究现状、水平和发展趋势；（3）立论依据。树突状细胞(dendritic cel，DC)和NKT细胞是自身免疫系统的两种独特成分，在免疫调节和适应性免疫反应的建立过程中起关键性作用。树突状细胞(DC)是体内最重要的抗原提呈细胞。它不但参与了天然免疫，而且一直被认为是启动获得性免疫的关键因素。DC识别病原体并向适应性免疫系统发出警报。树突状细胞(dendritic cell，Dc)是目前已知唯一能激活未致敏T细胞(naive T cell s)的抗原呈递细胞(antigen presenting cells，APC)。白血病源性Dc(L-Dc)既带有白血病抗原，同时又是抗原提呈细胞，来源于患者本人，不存在MHC限制。能有效地激活特异的肿瘤免疫，有可能在白血病的免疫治疗中发挥重要作用。但L-Dc与正常人CDl4+或CD34+前体细胞来源的CD83的Dc相比具有相对不成熟性。而DC的免疫刺激特征有赖于成熟状态。因此，如何获得临床上需要的有功能的L-Dc，在白血病细胞免疫研究和临床治疗中有重要的理论和实践意义。国内外也有大量的文献报道。用常规Dc诱导的方法(GM-CSF+IL 4+TNF-)使APL细胞分化为DC。Koski等用钙离子载体(calcium ionophore，CI)处理早幼粒细胞白血病细胞株(HL-60)。也获得DC的形态特征。而且新表达共刺激分子、CD83、CD40和CDla。国内也有学者报导A23187(CI)可诱导HL一60分化成具有一定活性的DC。尽管如此，L-DC通常都是相对不成熟的，其临床应用有许多问题待解决。为解决这一难题，人们尝试使用各种因子诱导DCS成熟。19世纪80年代开始了用全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗APL，并取得巨大成功。Naeem M等于2006年报道一例急性早幼粒细胞白血病病例，用ATRA诱导分化治疗后，APL细胞在体内分化为单核细胞，并论证了在体内诱导APL细胞向单核细胞方向分化的可能。基于以上研究，并且我们先前的研究提供了成熟的体外培养DC技术，为了进一步探讨ATRA诱导APL细胞为DC的可能性，我们准备利用GM-CSF、IL-4、TNFa等细胞因子及与ATRA的组合进行APL细胞培养，观察培养细胞的形态、HLA-DR、CD80、CD86和CD83的表达以及IL-12等细胞因子浓度的测定，并进一步观察ATRA-APL-DC的功能。注：此页可自行加页，但不得影响申请书中其他页面的版式。四、研究内容按以下主要提纲逐项填写：（1）具体研究内容和重点解决的关键技术问题；（2）创新点；（3）研究目标。a.具体研究内容 利用ATRA组合观察其是否可以成功地诱导急性早幼粒细胞白血病细胞为树突状细胞，并且通过细胞表型检测看是否为成熟DC，观察其介导的MLR及CTL效应与非ATRA组合所诱导的DC进行对比。这样可以提示DC途径是否能作为ATRA治疗APL有效的新机制，如果能作为新机制，以ATRA-APL-DCS为基础的肿瘤疫苗有可能在解决APL的MRD等问题上发挥强大的治疗作用，为APL的治疗研究提供了一个新的思路和策略。由HL-60细胞源性DC介导的淋巴细胞增殖效应得强弱，可以判断是否存在种属MHC的限制性。另外，可以通过实验结果观察ATRA组合诱导的树突状细胞CDld表达是否增高，推测有没有NKT细胞激活的可能，但具体机制可以进一步研究。b.创新点 利用GM-CSF、IL-4、TNF-a等细胞因子及与ATRA的组合进行APL细胞培养，观察培养细胞的形态、HLA-DR、CD80、CD86和CD83的表达以及IL-12等细胞因子浓度的测定，并进一步观察了ATRA-APL-DC的功能。c.研究目标 白血病源性DC(L-DC)既带有白血病抗原，同时又是抗原提呈细胞。应用全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)取得巨大成功，使APL成为治疗效果较好的白血病之一，但仍无法解决微小残留病(MRD)及复发问题。ATRA能否诱导APL细胞为成熟DC，作为肿瘤疫苗治疗APL及解决MRD和复发问题是本实验目的所在。注：此页可自行加页，但不得影响申请书中其他页面的版式。五、研究方案按以下主要提纲逐项填写：（1）研究方法和技术路线；（2）方案的可行性论证；（3）总体研究进度计划；（4）预计将遇到的难题。a.研究方法和技术路线 采集有特征性染色体异常：t(15；17)(q22；q21)APL初治患者骨髓单个核细胞以及应用急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞株分别在完全培养基中培养，并以ATRA处理。实验组利用ATRA+GM-CSF+IL-4因子组合分别对APL细胞和HL-60细胞进行诱导培养；对照组则用无水乙醇+6H-CSF+IL-4组合及GM-CSF+IL-4组合；所有组别于培养第8天加入TKF-。加入TNF-24或72小时后，流式细胞仪检测DC免疫表型、应用酶联免疫吸附法(ELISA)进行上清夜IL-12水平测定，并以们T法观察L-DCs刺激T淋巴细胞增殖能力(MLR)及针对白血病细胞的细胞毒作用(CTL效应)。b.方案的可行性论证 1、实验研究人员都对该课题有兴趣，并且有条件进行相关的实验。 2、申请单位已具备完成课题所需的绝大部分仪器设备 3、DC对体内两种不同的抗原，其加工提里途径也不同，一类是在细胞内合成的抗原，另一类为外源性抗原。在细胞内合成的抗原通常来源于胞内蛋白、核蛋白和病毒蛋白、冻融及凋亡的肿瘤细胞抗原，简称内源性抗原(endogenouslysynthesized antigen)，它首先被ATP依赖的蛋白酶(ATP-dependent Proteasomes)降解为大分子肽，然后这种降解产物在异二聚肽载体(hetercdimeric pep tide transporer)-TAPl和TAP2介导下穿过内质网膜转位到内质网(ER)中，经加工修饰后使之成为适合于MHC类分子重链(I a)结合的抗原肽。树突状细胞(DC)调控、维持机体免疫反应包括：(1)通过激活静息型T细胞，诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyt CTL)产生：(2)通过直接或间接方式影响B细胞的增殖，活化体液免疫应答；(3)通过与记忆T细胞相互作用，诱发再次免疫应答；(4)通过与NK细胞及NKT细胞作用，促进机体建立非特异性、天然免疫应答等。ATRA作用于维甲酸受体，其通过多种途径诱导APL细胞分化，但最终要归为细胞基因的改变。APL细胞至少有169个基因受ATRA调节，ATRA作用后，其中有100个基因上调，69个基因下调，抑制细胞增殖及周期的基因上调，有利于DNA合成及修复、以及G1-SG2-M的转换基因如c-myc、c-myb、GATA2、cyclinA和cyclinBl等基因下调，两者相互协调，促使APL细胞分化。APL细胞具有特征性染色体异常t(15；17)(q22；q21)，该染色体异常常形成PMLRAR融合基因。PMLRAR或PLZFRAR能形成同二聚体或与RXR形成异二聚体，与转录辅助激活因子(N-CoR)的结合更牢固。在药理浓度的RA(10-7-lO-6mmolL)下能使N-CoR复合物与PMLRAR分离，释放转录抑制作用，使早幼粒细胞重新分化。尽管如此，由于MRD的客观存在，病人往往还会复发并导致难治或死亡。如何解决复发是所有临床学家必须面对的一个问题。如果ATRA具有诱导APL细胞成为DC的作用，相信这一途径的Dc肿瘤疫苗，将在APL生物免疫治疗中发挥很大的作用。C.总体研究进度计划 本项目计划6个月完成，自2011年12月-2012年6月。2011.12-2012.1 负责联系实验仪器和材料；2012.1-2012.4 完成实验中的大部分步骤并记录实验数据；2012.4-2012.5 将实验中记录的数据和资料进行整理分析；2012.5-2012.6 阅读文献并着手进行写作。d.预计将要遇到的困难 1）组中的研究人员以前并没有相关的研究经验，只能在老师的指导下进行完成，中途可能会出现一些难以预计的困难。 2）研究仪器的使用中可能会出现某些误差，在操作的过程中必须要小心谨慎，尽量减少误差，减少假阴性和假阳性结果。 3)在试验后得到结果后，在获取该方向最前沿的知识是会有些干扰原来的实验设计的方向。注：此页可自行加页，但不得影响申请书中其他页面的版式。六、预期研究成果及应用前景按以下主要提纲逐项填写：（1）预期研究成果及提供形式；（2）应用前景。a.预期研究成果及提供形式 成果以论文形式发表并组织鉴定 1)形态学观察：结果可以应用光学显微镜观察各组DCs形态。2)应用流式细胞仪检测OCs表型(COla、COld、CD83、C080、C086和HLA-DR)。3)应用酶联免疫分析IL-12分泌水平，得到它的分泌的高低。4)染色体：应用R带显色技术观察培养前后细胞遗传学特点5)MTT法测定混合淋巴细胞反应(MLR)及细胞毒作用(cTL效应)b.应用前景 本项目如果利用ATRA成功诱导出APL-DCs，并且所得DC的成熟表型增加，并且分泌IL-12的水平也增加，对自体淋巴细胞有较强的刺激增殖的能力及特异性白血病细胞杀伤效应。提示ATRA治疗APL的机制除针对RAR受体外，还有可能通过DC途径使APL患者受益。以ARTA-APL-DCs为基础的肿瘤疫苗有可能在解决APL的MDR等问题上发挥强大的治疗作用，为APL的治疗研究提供了一个新的思路和策略。另外，经ATRA组合诱导的树突状细胞CDld表达明显增高，推测有NKT细胞激活的可能，但需进一步研究证实。注：此页可自行加页，但不得影响申请书中其他页面的版式。七、研究工作基础和条件按以下主要提纲逐项填写：（1）项目组人员科研概况；（2）项目前期研究基础及阶段性成果（附证明材料）；（3）实验室仪器设备条件（人文社科类不需填写）。a.项目组人员科研概况 项目组人员均为大理学院2011届研究生，都阅读过相关文献，并时刻关注着该课题所涉及的学科的最新学科动态。b. 项目前期研究基础及阶段性成果 项目组成员对该课题相关的知识都有过涉及，并且能够联系到相关的实验仪器和材料。c.实验室仪器设备条件BB5060BBl6 C如孵箱(Heraeus)超净工作台(江苏南通农业科学仪器厂)离心机(北京医用离心机厂)Olympus倒置显微镜Wellscan MK3酶标仪(Labsystems Dragon公司)AGl35电子天平(Mett ler Toledo公司)FAcSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司)微量加样器，微孔滤膜(022um)lOml、5ml培养瓶，lOml、50ml离心管24孔、96孔培养板(Caster公司)注：此页可自行加页，但不得影响申请书中其他页面的版式。八、研究主要参考文献按文献目录的相关标准逐项填写，限15篇。1Steinman RM，Cohn Z AIdentification of a novel cell type inperipheral lymphoid organs of miceIMorphology，quantitation，tissuedi Stri buti 0nJ ExP Med1 973 MaY 1：137(5)：1142-622Jacques JNCell biology of antigen P rosentation inJCurr opinImunol，1993，5(1)：273Anderson NS，Milier JInvariant chain can function as chaperoneprotein for class major histocompatibility comp lex moleculesJProlNatl Acad Sic USA，t998，89(20)：22824Okada HTahara H，Shurin懈et a1Bone marrowderived den2driticcellS pulsed with a tumor。specifie pep tide elicit effective anti。tumorimuni ty against intracranial neop lasmsJ】Int J Cancer，2000,78(2)：196-2015Toungouz M，Libin M。et a1Transient expansion of peptidespecificlymphocytes producing IFNgamma after vaccination With dendritic eel is pulsed with MAGE peptides in patients with mage-AlA3-positive tumorsJ Leukoc Biol 2001。69：9379436Patrick ABurch，Jami KBreen，et a1Priming TissuespecificCellular Inlnunity in a Phase I Trial of Autologous Dendritic CelIs forProstate CancerC1in Cancer Res 20006：2175-21827Rieser C，Ramoner R，et a1Mature dendritic cells induce T-helperType-1。dominant imune responses in patients with metastatic renal cellcarcinomaUr01Int，1999，63：151159 8Fuji i S-I，Shimizu K，Fujimoto K，et a1Analysi s of a chronicmyelogenous leukemia patient vaccinated with leukemic dendriti c cells following autologous peripheral blood stem cell transplantationJpn J Cancer Res1999，90：111711299Geiger J，Hutchinson R，et a1Treatment of solid tumours in childrenwith tumourlysatepulsed dendritic celIsLancet2000，356：1163116510Van den 8roeke LT，Oaschbach E，et a1Dendritic cel linducedactivation of adaptive and innate antitumor imunityJ Immun012003 Dee1：171(1 1)：584252Erratum in：J Immun012004 Jul 1：173(1)：69511Shibolet 0，Alper R，Zlotogarov L，et a1NKT and CD8 lymphocytesmediate suppression of hepatocellular carcinoma growth via tumorantigenpulsed dendritic cellsInt J Cancer2003 Aug 20；106(2)：2364312Tatsumi T，Takehara T，et a1871(CDSO)一gene transfer combined withinterleukin12 administration elicits protective and therapeuticintmunity against mouse hepatocellular carcinoma Hepatology。1999 Aug；30(2)：42242913Zoll B，Lefterova P，Csipai Met a16eneration of cytokineinducedkiller cells using exogenous interleukin 2，7 or 12Cancer Imunol Imunother 1998：47：22122614Volker L，Reichardt，Peter Brossart，et a1Blood Reiews，2004，18：235-24315Choudhury A，Liang jc，Thomas EK，et a1Dendritic cells derived invitro from acute myelogenous leukemia cells stimulate autologous，ant i leukemic T-cel l responsesBlood，1999：93(3)：78016Harrison BD，A dam s JA，BriggsM，et a1St imulation of autologousprol i ferat ire and cytotoxic T-cel 1 resp(mses by“leukemic dendriticcelIs”derived from blast cells in acute myeloid leukemiaBlood，200197(6)：276417Schwarz FS，Coppock DL，Alexander A，et a1Identification of amalignant counterpart of the monocytedendritic cell progenitor in anacute myeloid leukemiaJBlood，1994，84(9)：3054-306218Choudhury A，Gajewski JL，LiangK，et a1Use of leukemia dedriticcells for the generation of antileukemic cellular cytotoxicity gainstPhiladelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemiaJBlood，199789(4)：11331142注：此页可自行加页，但不得影响申请书中其他页面的版式。九、经费预算 单位：万元支出科目金额计算依据或使用说明仪器设备费0.1仪器可以进行申请使用，但要支付使用费实验材料费0.2材料需要到相关公司进行购买，价格都可以查询到科研业务费0.025进行科研的经费调研及差旅费0.05在研究过程中要进行差旅和调研论文版面费0.05发表到相关的杂志上需要支付版面费图书资料费0.05有些书籍需要进行购买管理费0.025管理的成本也是要支付的合 计0.5将上面的各种费用进行相加经费总额申请资助经费自筹经费5000元5000元0元说明：经费使用主要有以下科目1.仪器设备费：指资助项目专用的简易仪器设备的购置和运杂等费，自制设备的材料及加工费。2.实验材料费：指科研用消耗性材料、试剂、药品等购置费，标本、样品采集加工和运杂费。3.科研业务费：包括动力设备和燃料试验所需的动力、燃料费，实验用动、植物购置、养殖费，计算机上网费、测试、分析费（使用本单位设备应不收或只收消耗费）。4.调研及差旅费：本项目必需的调查研究、出席或参加学术会议费用和外出的相关差旅费用。5.论文版面费：发表论文或出版学术刊物等所需缴纳的相关费用。6.图书资料费：查询或购买项目相关图书或资料的费用。7.管理费：由各学校统一掌握，但不超过申请经费的5%。未签订协议的协作费以及资助项目批准前已发生的支出，不得列入。十、申请者承诺我保证申请书内容的真实性。如果获得基金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守云南省教育厅科学研究基金的有关规定，认真开展研究工作，切实保证各项任务的完成，并按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。签名：十一、专家组评审意见 专家组组长： 2011年 月 日十二、所在学校意见2011年 月 日十三、省高校学术委员会意见 2011年 月 日十四、云南省教育厅意见 （公章） 2011年 月 日