第七章--生产菌种的扩大培养与保藏.ppt

第七章第七章 生产菌生产菌种的扩大培养与种的扩大培养与保藏保藏1 第一节第一节 种子扩大培养的概述种子扩大培养的概述v种子扩大培养种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。2发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：v（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；v（2）生理状况稳定,个体与群体都要满足同一生长要求；v（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；v（4）无杂菌污染；v（5）保持稳定的生产能力。3种子扩培的目的:q 接种量的需要q 菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平4工业微生物菌种培养的类型：v工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两大类型。v静置培养法即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行发酵，又称为嫌气性发酵。5v通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。v在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养和固体培养两大类型，其中每一类型又有表面培养与深层培养之分。6主要培养方法及特点：（1）表面培养法 包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。（2）固体培养法 包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。7（3）液体培养法 包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。摇瓶通气量大小与摇瓶机型式、转数、振程(或偏心距)、三角瓶容量、装料量有关。（4）载体培养法 以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体。8（1）表面培养v表面培养是一种好氧静置培养方法v针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。v相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液(气固)界面向培养基内传递，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。9v这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度也越快。v氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。v优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。10v固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。（2）固体培养11v固体培养具有以下优点：固体培养具有以下优点：原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。12通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。缺点缺点是劳动强度大13（3）液体深层培养 v用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法深层培养法。v特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。14 深层培养基本操作的3个控制点 灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。15温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。16通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH而使加入的酸和碱均匀分散等。17几种深层培养法：放大法两步法控制培养法 分批发酵法(间歇发酵法)连续培养法补料分批培养法(流加法)18放大法放大法v将微生物在摇瓶基础上逐级放大以实现大规模生产。v在厌气发酵时问题归结为如何从大型发酵罐中除除去去发发酵酵热热。除去发酵热的方法主要是利用冷却水，另外还可考虑如何利用发酵时生成的二氧化碳引起的液体流动和辅助搅拌，以提高冷却效率。19在好氧培养中，大多以氧的供给为基准进行放大。一般从实验室规模到工厂生产要经过35级放大步骤。放大过程中应考虑：a氧传递速度相等。b比较不同级时搅拌桨叶顶端速度。c比较不同级时单位液量所需的搅拌动力。d混合时间相同。e雷诺准数相同。f通过反馈控制尽量能使重要环境因子一致。20两步法两步法 酶制剂生产和氨基酸生产 酶制剂生产两步法的特点是将菌体生长条件(营养期)与产酶条件(自我繁殖期)区分开来。菌种先在丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物得到充分利用。21 在氨基酸的两步法液体深层培养中，每一步菌种和培养基均不相同。第一步属有机酸发酵或氨基酸发酵。第二步是在微生物产生的某种酶作用下把第一步的产物转化为所需的氨基酸，这种生产方法又称为酶转化法。两步法工艺繁杂，但仍有实用价值。22控制培养法 了解发酵罐内部的变化情况，掌握短暂时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物生成的最优培养条件。23用测定状态变量的传感器取得数据，经电子计算机进行综合分析，再将其结果作为反馈调节的信号，将环境(培养条件)控制于给定的基准内。这就叫做电子计算机控制发酵。目前已大量用于露天大罐啤酒发酵。24分批发酵法（间歇发酵法）先先将将空空罐罐杀杀菌菌，培培养养基基装装入入发发酵酵罐罐，接接种种之之后后进进行行培培养养，在在培培养养过过程程中中，培培养养基基成成分分减减少少，微微生生物物增增殖殖。微微生生物物周周围围的的环环境随时间而变化，是一种非稳态操作法。境随时间而变化，是一种非稳态操作法。此此法法不不易易染染菌菌，但但很很难难采采用用控控制制基基质质浓浓度度的的方方法法来来增增大大发发酵酵生生产能力。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。产能力。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。25 连续培养法连续培养法 在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续放出，叫做连续培养法。其特点是能使微生物处于恒定不变的环境中进行长期持续的培养，该系统的稳态被叫做恒化器。同时包含了流入和流出，属开放系统，故变异菌株和杂菌污染随时间的延长而增大。从技术上也很难保证流入和流出速度的一致。连续培养用于废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。26补料分批培养法（流加法）补料分批培养法（流加法）在分批培养时，不断地供给培养基，但所需产物不到一定时刻不放出的方法，称为补料分批培养法。用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。27（4 4）载体培养）载体培养 载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又能允许空气流通。28第二节第二节 种子的制备过程种子的制备过程v种子制备的过程大致可分为两个阶段：v（1）实验室种子制备阶段v（2）生产车间种子制备阶段2930一、实验室种子的制备一、实验室种子的制备v（一）孢子的制备v1.细菌芽孢的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37。不产芽孢的细菌培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养时间为510天。31v2.霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基，培养温度为2528，培养时间为414天。v3.放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等，培养温度为28，培养时间为514天。32v（二）液体种子制备 产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种 v1.好氧培养 灰色链霉菌、卡那链霉菌 其过程如下：试管斜面三角瓶摇床种子罐33v2.厌氧培养 对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）其种子的制备过程如下：试管三角瓶卡式罐种子罐34二、生产车间种子制备二、生产车间种子制备v1.种子罐的作用 v2.种子罐级数的确定 种子罐级数种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数。取决于：（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度。（2）所采用发酵罐的容积。35v例如：v细菌：二级发酵,茄子瓶种子罐发酵罐v霉菌：三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27,40h孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（27，1024h，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐v放线菌：四级发酵v酵母：一级种子36v3.确定种子罐级数需注意的问题v（1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会。v（2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。v（3）种子罐级数由产物的品种及生产规模而定，也与所选用工艺条件有关。37第三节第三节 种子质量的控制种子质量的控制v一、影响孢子质量的因素及控制一、影响孢子质量的因素及控制v1.培养基 解决措施：（1）所用原料要经过发酵试验合格才可使用；（2）严格控制灭菌后培养基的质量；（3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；（4）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。38v2.培养条件（1）温度 一般各生产单位都严格控制孢子斜面的培养温度。（2）湿度 孢子在干燥条件下容易形成。39v3.培养时间和冷藏时间（1）培养时间 解决措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟的阶段终止培养。（2）冷藏时间 斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响40v4.接种量 影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。41二、影响种子质量的因素及控制二、影响种子质量的因素及控制 v1.培养基 种子培养基要满足以下要求：（1）营养成分适合种子培养的需要（2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基（3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用（4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高（5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近42v2.培养条件（1）温度（2）通气量 通气量充足可以提高种子质量v3.种龄 种龄种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。43例如：嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 44v4.接种量 接种量接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。一般采用较大的接种量45 通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%。46三、种子质量的控制措施三、种子质量的控制措施v种子质量的最终指标种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。v1.菌种稳定性的检查v2.无杂菌检查47 四、种子质量标准四、种子质量标准v1.细胞或菌体v菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）v单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；v霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。48v2.生化指标 种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化v3.产物生成量 在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟度。v4.酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。49 五、种子异常分析五、种子异常分析 菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁50第四节第四节 实例实例v一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养 斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵罐v1.斜面菌种的培养（1）斜面培养基组成 葡萄糖 0.1%、蛋白陈 1.0%、牛肉膏 1.0%、氯化钠 0.5%、琼脂 2.02.5%、pH 7.07.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）（2）培养条件 3334、培养1824h51v2.一级种子培养（1）培养基组成 葡萄糖 2.5%、尿素 0.5%、硫酸镁 0.04%、磷酸氢二钾 0.1%、玉米浆 2.53.5%(按质增减)、硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm、pH7.0（2）培养条件 频率96次/min、振荡培养12h、培养温度3334 52（3）一级种子质量要求 种龄：12h pH值：6.40.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5以下 无菌检查：（-）噬菌体检查：（-）镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应53 3.二级种子培养（1）培养基组成培养基组成（%）T6-13B9T738AS1.299水解糖玉米浆磷酸氢二钾硫酸镁尿素Fe+（ppm）Mn+（ppm）pH2.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.20.050.5227.02.52.50.10.040.5226.5-6.854（2）培养条件 接种量：0.81.0 培养温度：3234 培养时间：78h 通风量：50L种子罐搅拌转速340r min；250L种子罐搅拌转速300r/min；500L种子罐搅拌转速230r min。55（3）二级种子的质量要求 种龄：78h pH：7.2左右 OD值净增：0.5左右 无菌检查：（-）噬菌体检查：（-）56 二、啤酒酵母的扩大培养二、啤酒酵母的扩大培养v1.实验室扩大培养57 2.车间扩大培养58第五节第五节 生产发酵罐的无菌接种生产发酵罐的无菌接种v1.从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种5960 2.从种子罐接种61第六节第六节 菌种的保藏与复壮菌种的保藏与复壮v一、菌种的保藏一、菌种的保藏v1.菌种保藏的意义v2.菌种保藏的原理 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。62v3.菌种保藏的方法（1）斜面低温保藏法（2）石蜡油封保藏法（3）砂土管保藏法（4）冷冻干燥法（5）超低温保藏法63 二、发酵工业微生物菌种的衰退与复壮二、发酵工业微生物菌种的衰退与复壮v（一）微生物菌种的衰退 菌种退化菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。64常见的菌种衰退：v（1）形态上 分生孢子的减少，或菌落颜色的改变。v（2）生理上 菌种发酵能力的降低，有些菌种的抗噬菌体能力下降。65v菌种的真正退化必须与由于环境原因变化而引起菌种形态和生理上的变异区别开来。66引起菌种退化的原因主要有：1.基因突变 有关基因的负突变（产量、孢子生成）在发酵生产中常用营养缺陷型突变株 2.变异菌株性状分离67不同剂量紫外线处理裂殖酵母时不纯菌落百分数剂量（以存活率计，%）菌落总数突变菌落数突变频率（突变菌落/103）不纯菌落（%）纯不纯100（对照）801006080206012012165120608553492298841134665195122017280.0822716.722.64330211368 3、连续传代v 菌种退化的直接原因v 个别细胞性状改变不足69产腺苷的黄嘌呤缺陷型菌株在接种传代过程中产量和回复子数量间的关系实验移接代数每代斜面保存时间（天）回复子比数腺苷产量（g/L）1234560267912147133，1447，3，9，3，71，1447，3，9，3，13，58，1447，3，9，3，13，8，3，47，447，3，9，3，13，8，3，4，14，6，6，311/4.51061/2.41061/2.21051/3.51051/5.31031/1.010313.514.910.713.18.17.470v4.其它因素 如温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变。在保藏菌种中基因突变率随温度降低而减少71（二）防止菌种衰退和退化菌种的复壮v1.防止菌种衰退 防止菌种衰退的方法有：（1）控制传代次数 基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，繁殖越颇繁，复制的次数越多，基因发生变化的机会也就越多。72（2）选择合适的培养条件 培养条件对菌种衰退有一定的影响，选择一个适合原种生长的条件可以防止菌种衰退。另外，生产上应避免使用陈旧的斜面菌种。73（3）利用不同类型的细胞进行传代 在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含有许多核，甚至是异核体，因此用菌丝接种时就会出现衰退和不纯的子代。而孢子一般是单核的，利用孢子来接种，可以达到防止衰退的目的。74（4）选择合适的保藏方法 采用有效的菌种保藏方法也可以防止菌种的衰退。75v2.退化菌种的复壮使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性，称为复壮复壮。常用的方法:（1）对已退化菌株用一定培养条件进行单细胞分离纯化。（2）选择一种对退化型菌株细胞核具有更大杀伤力的诱变剂亦可使原菌株得到复壮。76(3)用遗传方法选育不易退化的稳定菌株或采用双缺、三缺菌株及减少传代次数等方法，都可防止菌种退化，保存稳定菌株。77