水泡性口炎病毒在草鱼肾细胞中的复制和病变效应.doc

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水泡性口炎病毒在草鱼肾细胞中的复制和病变效应
摘要：目的 观察水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus ,VSV）感染草鱼肾细胞（CIK细胞）所引起细胞病变效应并检测其在细胞中的复制。方法 用VSV病毒印第安纳（VSV Indiana）株感染CIK细胞，分别在12h、24h、36h观察病变效应。当出现大范围的细胞病变时，提取病毒RNA，通过RT-PCR方法检测病毒在细胞中的复制。结果 受VSV病毒感染后的CIK细胞圆缩、聚集、脱落，形成包涵体，随着时间的延长该现象逐渐加剧。RT-PCR结果显示出现了预期的200 bp左右的条带。结论 VSV病毒引起了CIK细胞的病变，并在CIK细胞中进行了复制。
关键词：VSV病毒，CIK细胞，病变效应，复制
Vesicular Stomatitis Virus in Ctenopharyngodon Idellus Kidney Cells Replication and Cytopathic Effect
06092204 GAO Xia-Ting
(Qiuzhen School of Huzhou Teachers College, Huzhou 313000)
Abstract: Objective We observed cytopathic effect in Ctenopharyngodon idellus kidney cells (CIK cells) induced by Vesicular stomatitis virus (VSV) and detected VSV’s replication in it. Methods CIK cells were infected by VSV Indiana strains. After 12 h, 24 h, 36 h, the cell cytopathic effect was observed. When a wide range of cytopathic effect appeared, the virus’s RNA would be extracted and detected by RT-PCR. Results CIK cells with VSV became round shrinkage, got together, shaded, and formed inclusion body. With the extension of time，it increased. RT-PCR result showed that the expected bands of 200bp were amplified with templates of virus’s RNA. Conclusion Cytopathic effect appeared in CIK cells with VSV. And VSV could reproduce in CIK cells.
Key words: VSV, CIKcells, cytopathic effect, replication
目 录
1 引言………………………………………………………………………………………1
2 实验材料和方法…………………………………………………………………………2
2.1材料…………………………………………………………………………………2
2.1.1 实验细胞
2.1.2 主要化学药品和试剂
2.1.3 主要仪器与设备
2.1.4 试剂配制
2.2 方法与步骤…………………………………………………………………………4
2.2.1草鱼的肾细胞(CIK细胞)培养
2.2.2 VSV病毒的复壮与效价检测
2.2.3 细胞病变效应
2.2.4 病毒RNA提取及RT-PCR测定草鱼肾细胞(CIK细胞)中VSV的复制
2.2.5 空斑实验
3 结果与分析………………………………………………………………………………10
3.1 正常草鱼的肾细胞（CIK细胞）培养特征…………………………………………11
3.2 水泡性口炎病毒（VSV病毒）的复壮……………………………………………11
3.3 VSV病毒感染草鱼肾细胞（CIK细胞）不同时间后产生的细胞病变效应……11
3.4 RT-PCR检测VSV病毒在CIK细胞中的复制…………………………………12
3.5空斑试验……………………………………………………………………………13
4 讨论………………………………………………………………………………………13
4.1 VSV病毒对不同细胞系引起病变效应……………………………………………13
4.2 VSV病毒对Vero细胞、3T3细胞、CIK细胞的空斑实验结果的比较…………14
4.3 VSV病毒的检测方法………………………………………………………………15
5 总结与展望………………………………………………………………………………15
参考文献………………………………………………………………………………16
致 谢………………………………………………………………………………17
1. 引言
VSV病毒为弹状病毒科（Rhabdoviridae）,水泡病毒属（vesiculovirus）成员。其有两个血清型即水泡性口炎病毒印第安纳（VSV Indiana）株和新泽西（VSV-New Jersey）株[1]。以节肢动物为媒介传播，可以感染啮齿类动物及牛、猪、马等多种动物，也可以感染人类[2]。
VSV病毒引起的水泡性口炎（Vesicular stomatitis, VS）是一种急性高度接触性传染疾病，以马、牛、猪等动物较易感染，绵羊和山羊也可感染。临床上以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要特征，还有糜烂及溃疡[3]，其症状与口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SVD)相似[4]。人也有感染VS，引起流感样症状。本病被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病。在我国VS为外来动物病，国家进出境动物检疫对象中将VS列为二类疫病。随着经济发展的国际化，动物及动物产品的国际贸易量逐渐增加，外来动物病传入我国的风险日益加大。为防止国外动物疫病入境，保护我国畜牧业及水产业的健康发展，对该病进行充分的了解和研究具有特别重要的意义，尤其是对病原——VSV病毒的研究。
VSV病毒几乎可在所有常用的实验室培养细胞内生长，包括鸡胚细胞以及牛、猪、恒河猴、豚鼠以及其它动物的原代肾细胞，可以很快引起明显的细胞病变效应（CPE）, 18-24 h即可引起细胞快速圆缩、聚合、脱落，可在动物的原代肾细胞单层上产生不同大小的蚀斑,而感染昆虫细胞则引起持续性感染，无细胞病变。
VSV病毒的诊断方法较多，包括病毒的分离培养、电镜观察、琼脂免疫扩散、免疫电泳、酶联免疫吸附试验(ELISA)、补体结合(CF)试验、中和试验(VN)、聚合酶链式反应(PCR)等。OIE推荐夹心ELISA (IS-ELISA)、CF用于鉴定病毒抗原，液相阻断ELISA (LP-ELISA)、VN、CF则用于血清学试验。而PCR法则是近年来发展起来是一种快速、高敏感、准确的诊断技术[5]。该法全部试验可在1d内完成，能够达到快速诊断的目的，并且具有很好的特异性与重复性，国内外都有相关的研究报道。
目前，国内外有关关鱼类病毒的研究包括鲑草梅病毒(TSD)、淋巴囊肿病毒(LCDV)、系统性虹彩病毒(SU)、斑点叉匙回病毒病(CCDV)、银大麻哈鱼疙疹病毒(SaHV-2)传染性胰坏死病毒病(IPNV)、鰤鱼腹水病(YAV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、春季鲤病毒(SVCV)、白斑狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)、草鱼出血病病毒(GCHV)等。但是关于VSV病毒对鱼类影响方面的报道并不多，因此研究该病毒对鱼类的影响成为了一个迫不及待的课题。
本实验用VSV Indiana株侵染CIK细胞单层，分别于12 h、24 h、36 h后用倒置显微镜观察细胞病变效应并拍照记录比较不同时段的特征，发现VSV病毒不能在CIK细胞单层上产生蚀斑，同时用RT-PCR方法检测VSV病毒在CIK细胞中的复制。为VSV病毒的进一步研究奠定了基础。
2. 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病毒和细胞
VSV病毒、CIK细胞均由湖州师范学院细胞研究所实验室提供。
2.1.2 主要化学药品和试剂
表 2-1 主要化学药品和试剂
名称
纯度
来源
DEPC
生化试剂(BR)
SERVA
EDTA
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
NaOH
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
无水乙醇
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
异戊醇
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
氯仿
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
异丙醇
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
RNase A
生化试剂(BR)
生工生物工程有限公司
溴化乙锭（EB）
生化试剂(BR)
SIGMA
Agarose
生化试剂(BR)
Bio Basic Inc
DNA marker DL2000
生化试剂(BR)
Bio Teke 生物公司
Taq酶
生化试剂(BR)
TaKaRa公司
M-Mulv
生化试剂(BR)
Fermentas公司
dNTP混合物、引物
生化试剂(BR)
invitrogen bio-technology公司
NaHCO3
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
丙酮酸钠
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
高糖DMEM

生化试剂(BR)
Gibco
小牛血清
生化试剂(BR)
杭州四季青
胰蛋白酶
生化试剂(BR)
Amresco
青霉素
生化试剂(BR)
美国Sigma试剂公司
链霉素
生化试剂(BR)
美国Sigma试剂公司
L-谷氨酰胺
生化试剂(BR)
国药集团化学试剂有限公司
KCl
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
Na2HPO4
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
KH2PO4
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
NaCl
分析纯(AR)
国药集团化学试剂有限公司
2.1.3 主要仪器与设备
表 2-2 主要仪器与设备
仪器名称
型号
厂家
梯度PCR仪
Eppendorf AG22331
Eppendorf
核酸扩增仪
EPS-100
上海天能
核酸扩增仪
M.J.Research PTC-200
M.J.Research
凝胶成像系统
Dolphin-DOC
WEALTEC
制冰机
YBX70KS
GRANT
可调移液器
0.5-10µl
芬兰Lab system
可调移液器
20-200µl
芬兰Lab system
可调移液器
100-1000µl
芬兰Lab system
超低温冰箱
MDF-4086S
日本三洋
高温恒温培养箱

MIR-162
日本三洋
超级恒温水浴锅
DKB-501A
浙江省科学器材进出口公司
干式恒温机
K308
杭州蓝焰科技有限公司
台式离心机
TGL-16G
上海安亭科学仪器厂
台式高速离心机
Biofuge　Primor
德国Heraeus
多功能旋涡混合器
WH-966
太仓科教器材厂
1/10000电子天平
AL104
上海安亭科学仪器厂
CO2培养箱
RC03000T-5-VBC
上海博迅
倒置显微镜
MoticAE20
Motic
荧光倒置显微镜
090-134.010-000
德国莱卡
超净工作台
SW-CJ-2FD
苏州净化设备有限公司
液氮罐
YDS-30
成都金凤液氮容器有限公司
超纯水机
Ultrapure-Ⅱ
KELOW
微电脑自动高压消毒锅
MLS-3750
日本三洋
2.1.4 试剂配制
⑴ PBS：8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.2 g Na2HPO4、0.12 g KH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4 ℃保存。
⑵ 胰蛋白酶(Trypsin)消化液：使用浓度0.25%，即0.8 g NaCl、0.02 g KCl、0.02 g KH2PO4、0.115 g NaHCO3、0.1 g牛胰蛋白酶(1:250)、一起溶于100 mL双蒸水，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌。分装，冻存。
⑶ 0.5 M的EDTA：70 mL水中加入18.61 g EDTA-Na·2H2O，用10 M NaOH调节pH至8.0，定容至100 mL，高压灭菌备用。
⑷ 抗生素液：双抗（青霉素、链霉素）各1 g，溶于100 mL纯水，过滤除菌，分装，4℃冰箱保存,使用前1:100稀释。
⑸ 胰蛋白酶-EDTA溶液：用无钙、镁PBS配制，胰蛋白酶的浓度为0.05％，EDTA的浓度为0.02％，胰蛋白酶与EDTA溶液按1:1混合，-20℃贮存。
⑹ 50×TAE缓冲液：242 g Tris，57.1 mL冰醋酸，37.2 g Na2EDTA·2H2O，定容1 L。
⑺ 0.5 mg/mL EB贮存液：戴手套称取EB 50 mg，加入100 mL水，溶解，转移到棕色瓶中，置4℃保存。
⑻ 6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，40％蔗糖，10 mmol·dm-3 EDTA（pH 8.0），4℃保存。
⑼ DMEM培养液：1袋1 L粉状DMEM，3.7 g NaHCO3，1 mmoL∕L丙酮酸钠（即0.11 g∕L）。加青霉素及链霉素，不锈钢过滤器过滤除菌，4℃保存备用。
⑽ DEPC水（配制RNA电泳用缓冲液）：1 mL DEPC加入1000 mL双蒸水中，盖紧塞子振摇，静置过夜，再加上塑料袋封紧瓶口，高压灭菌30 min，以出去残留的DEPC。
⑾ DEPC水溶液（用来浸泡枪头、离心管等）：1000 mL双蒸水中加入1 mL DEPC，盖紧塞子振摇5 min，静置4 h，倒入盛有枪头和离心管的容器内，用保鲜膜封住容器口以防止DEPC挥发，室温静置过夜，即可将物品取出，高压灭菌30 min，以出去残留的DEPC。
⑿ 生理盐水的配制：称取0.8 g NaCl溶于100 mL双蒸水中，用玻璃棒使之溶解。
⒀ 0.5%鸡血红细胞：抽取鸡静脉血5 mL，立即加入95 mL的生理盐水中，并振摇混匀。
2.2 方法与步骤
2.2.1 草鱼肾细胞的培养
⑴ 细胞培养的准备及注意事项
① 配制DMEM培养液、磷酸缓冲液(PBS)、EDTA-胰蛋白酶、双抗（青霉素、链霉素）。
② 培养瓶、巴氏滴管、无刻度试管、离心管等玻璃器皿用洗衣粉清洗刷干净后，自来水清洗10遍，置于烘箱中干燥；再浸酸性洗液中过夜，从酸性洗液捞出后自来水冲洗10~15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，置于烘箱中烘干；包装高压蒸汽灭菌(121℃、30 min)，烘干，备用。胶塞等用自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
③ 超净台里常备75％酒精棉球，用于手和一些金属器械或操作台面的消毒。
④ 细胞房的缓冲间应常备盛有0.1％新洁尔灭溶液的容器及纱布，主要用于手和前臂的清洗。
⑤ 超净工作台的消毒：超净工作台在使用前可用75％酒精纱布将其内部揩擦一遍进行初步消毒，然后打开工作台内的紫外线灯照射消毒20~30 min。照射杀菌完毕后关闭紫外线灯并同时打开风机，由于进人工作台内的空气是经过工作台上的除菌滤板过滤的，故工作台内是一个相对无菌的环境。
⑥ 操作过程中的消毒：在超净工作台中开始操作时首先应点燃酒精灯，此后的一切操作如打开或加盖瓶塞、安装吸管皮头、使用吸管、使用各种金属器械等均要经酒精灯的火焰灼烧或在火焰旁进行操作。培养操作时，动作要准确敏捷，不能用手触及器皿的消毒部分，如不慎触及，要用火焰消毒或更换，开盖的培养液或培养用瓶应尽量保持斜位放置或平放，以避免瓶口长时间直立而增加细菌污染的机会。吸取不同液体时应分别使用不同的吸管，不可混用以防扩大污染。
⑵ CIK细胞复苏：
① 从液氮中取出所需的冻存管，迅速投入盛有37℃水的水浴锅中，同时用镊子夹住冻存管快速摇晃，使其中的细胞悬液能够快速的融化，整个融化的过程要求在20~60 s中完成，这样可以保护细胞免受损害，使其快速的通过最危险的-50℃~0℃温区；
② 将冻存管从水浴锅中取出，用干净的擦纸吸干管壁上的水分，之后用75%的酒精消毒后放入超净台中，无菌操作将冻存管中的细胞悬液移入离心管，5 min内用培养液稀释至原体积的10倍以上（加入9 mL的培养液），用移液器反复吹吸混匀；
③ 将离心管放入离心机，以1000 r／min离心5 min，使细胞沉淀，然后倾去含二甲亚砜的上清液；
④ 再向离心管中加入2 mL的新鲜培养液，形成细胞悬液，然后转入无菌的培养瓶中；
⑤ 往培养瓶中再添加2 mL培养基，盖上瓶盖，轻轻混匀后置27℃、0% CO2浓度、饱和湿度的恒温箱中培养。
⑶ 细胞传代培养：
① 观察复苏后的细胞的生长情况，当细胞铺满培养瓶底部时（约2 d），即可进行传代；
② 用75%的酒精擦拭培养瓶的表面后放入超净台，点燃酒精灯，弃去原培养液，然后用PBS清洗细胞2~3次，尽量除去残余的血清；
③ 加入0.2 mL的消化液（胰蛋白酶-EDTA），轻轻摇晃培养瓶，使消化液覆盖整个细胞层，置于室温下2~3 min；
④ 在倒置显微镜下观察，细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形时即可终止消化；
⑤ 消化终止：在培养瓶中加入4 mL含小牛血清的培养液，用吸管吸取瓶中的培养液反复冲击瓶壁上的细胞，直至全部细胞脱离瓶壁，轻轻混匀制成细胞悬液；
⑥ 收集细胞悬液，移入无菌的离心管中，放入离心机1000 rpm离心5 min，去上清；
⑦ 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和密度，根据结果将细胞浓度调整至5×105个/mL（该步骤省略）；
⑧ 取1 mL细胞悬液接种到新培养瓶中，于27℃、饱和湿度条件下培养；
⑨ 传代1 h后对培养的细胞进行观察，观察细胞的贴壁情况，之后每天观察细胞的生长状态，若细胞贴壁存活则称为传了一代，若培养液变酸发黄要及时更换。
⑶ 细胞冻存
① 配制冻存液，即基本培养液、PBS、DMSO体积比为6:3:1的混合液；
② 选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天换液；
③ 将培养瓶中的原培养液弃去，用0.25%胰蛋白酶进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；
④ 加入适量的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；
⑤ 收集细胞悬液,1000 rpm离心5 min,去上清；
⑥ 加入适量的冻存液,重新悬浮细胞,并计算细胞密度,以3×106 ~1×107 个/mL之间,分装于1.0 mL冻存管中；
⑦ 在冻存管上标好细胞名称和日期，于4℃冰箱放置1 h，再移至-80℃冰箱过夜，次日转入液氮中。
2.2.2 VSV病毒的复壮与效价检测
⑴ VSV病毒的复壮
① 取9~12日龄胚蛋，用照蛋灯照射鸡蛋观察，找出气室和胚位，做好标记，并在胚胎旁避开大血管处标好注射点；
②打开超净台，点燃酒精灯，准备好器械（无菌小锥、酒精棉、1mL注射器、封口膜），以及VSV病毒原液(须置于冰上)；
③ 将胚蛋横置于蛋架上，使标记的注射点向上，放入超净台，消毒注射点附近的蛋壳，用无菌小锥在注射点锥一小孔；
④ 注射器吸取病毒液500 μl，将针头与蛋壳成30°角的方向倾斜刺入，进针约2 cm时，注入病毒液；
⑤ 用封口膜封口，置38℃培养箱中培养,弃去24 h内死亡的胚蛋，余者培养2~3 d后收获；
⑥ 对气室处的蛋壳进行消毒，无菌操作去蛋壳，轻轻撕破壳膜与绒毛膜，用无菌毛细吸管吸取尿囊液（透明、清亮、无血），测定病毒的血凝效价后，进行分装保存。
⑵ VSV病毒血凝效价测定
① 准备：配制0.9%生理盐水100 mL备用，洁净的锥形瓶，鸡血；
② 制备鸡血红细胞悬液，使用前用生理盐水洗3次，然后配成0.5%的悬液；
③ 取一96孔微量反应板，顺序编号；
④ 自左向右在各孔中加入50 µl生理盐水；
⑤ 于第1孔加入50 µl混匀的病毒液；
⑥ 另取一吸管将其混匀后吸取50 µl指第2孔，混匀后吸取50 µl至第3孔，以此类推，直到第11孔，，从第11孔中吸取50 µl弃去，第12孔为红细胞对照孔；
⑦ 每孔加入50 µl，0.5%鸡红细胞悬液，立即摇匀，置室温30~45 min后观察。
⑧ 结果以“+”表示血凝程度。具体判断如下：
—：无凝集现象，红细胞于孔底形成小圆点，边缘整齐光滑；
+：红细胞于孔底形成小团，但边缘不光滑，四周有小凝集块；
++：红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块；
+++：一层红细胞均匀地铺于孔底，边缘不整齐，有下垂趋向；
++++：一层红细胞均匀地铺于孔底；
以出现“++”的最高稀释度为血凝效价，即一个血凝单位。
2.2.3 细胞病变效应
⑴ 细胞铺板：
将对数生长期的CIK细胞，经活力与密度的计算后，以5×105个/mL密度接种到25 mL培养瓶中，轻轻摇匀，于27℃、0% CO2浓度、饱和湿度条件下培养，待细胞生长至70%~80%时即可进行攻毒。
⑵ 攻毒
① 将已生长形成70%~80%单层细胞的培养瓶从培养箱中取出，经75%酒精轻轻擦拭后放入超净工作台；
② 点燃酒精灯，在酒精灯旁原培养液弃入烧杯中，用PBS洗细胞3次；
③ 吸取20 µl的病毒液，加入含有980 µl的高糖DMEM培养液（不含双抗、不含胎牛血清）中混匀，注入培养瓶中，轻轻摇晃，使培养液铺满整个细胞层表面；
④ 盖上瓶盖后将培养瓶小心放入27 ℃、0%CO2浓度、饱和湿度条件下培养,攻毒1.5 h；
⑤ 1.5 h后，弃去混合液，然后用PBS清洗细胞3次，尽量洗去未感染细胞的病毒。
⑥ 取1.5 mL含2%小牛血清的培养液，加入培养瓶，使其铺满整个细胞层表面，于27℃、0% CO2浓度、饱和湿度条件下培养；
⑦ 分别在培养12 h、24 h、36 h后，用荧光倒置显微镜进行用明视野拍照记录。拍照后，细胞用于总RNA的提取及RT-PCR。
2.2.4 VSV病毒RNA的提取及RT-PCR测定CIK细胞中VSV病毒的复制
⑴ 引物设计：
上游引物：5’-CATGCTTCCAAATGGGTCAC-3’；
下游引物：5’-GGACAATCACTGCTTCGGC-3’；
⑵ VSV病毒RNA 的提取
① 用VSV病毒感染25 mL培养瓶中铺满瓶壁80%~90%的细胞；
② 观察细胞形态，若大部分细胞已经脱落，即可进行病毒RNA的提取；
③ 从含病毒感染后细胞的25 mL培养瓶中，吸取500 µl的上清液，在1.5 mL的反应管中，再加入TRIzol LS 500 µl,充分混匀，室温放置10 min；
④ 加入200 µl的氯仿，盖紧离心管盖子，用力震荡离心管，使溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象；
⑤ 于4℃冰箱放置10 min；
⑥ 离心4℃、13000 r/min、15 min，取上层液相600 µl移入另一管，切忌吸动白色中间相；
⑦ 加入等体积的4℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，4 ℃冰箱放置10 min；
⑧ 离心4℃、13000 r/min、15 min，仔细看管壁，在靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物，用枪小心吸去所有上清；
⑨ 1mL75%乙醇洗一遍，离心4℃、8000 r/min、10 min，用枪小心吸取所有上清，在超净台中干燥5 min，加入65℃预热的10 µl DEPC水，助溶10 min，立即做RT。
⑶ 逆转录反应
① 取一个PCR反应管，添加以下各种成分：
试剂
体积
模板RNA(VSV病毒)
10 µl
上游引物
0.5 µl
下游引物
0.5 µl
② 在振荡器上混匀，稍离心，放入70℃金属浴中，保温5 min；
③ 将反应管立即插入冰中进行冰浴，再稍离心；
④ 于反应管中，再添加以下各种成分：
试剂
体积
M-MLV Buffer
4 µl
dNTP
3 µl
Rasin
0.5 µl
M-MLV Revers
1.5 µl
⑤ 在振荡器上混匀，稍离心后放入42℃恒温水浴锅，保温60 min；
⑥ 将反应管放入95℃金属浴中，10 min，将反应管立即插入冰中进行冰浴，再稍离心，于4 ℃保存。
⑷ 基因的扩增（PCR）
① 取三个反应管，添加以下各种成分：
表2-1 PCR试剂添加量
试剂
实验组
阴性对照组
阳性对照组
DEPC水
2.5 µl
12.5 µl
12.0 µl
模板DNA
10.0 µl
0 µl
0.5 µl
上游引物
0.5 µl
0.5 µl
0.5 µl
下游引物
0.5 µl
0.5 µl
0.5 µl
dNTP
4.0 µl
4 .0µl
4.0 µl
10×PCR缓冲液(含Mg2+)
2.0 µl
2.0 µl
2.0 µl
Taq酶
0.5 µl
0.5 µl
0.5 µl
总体积
20.0 µl
20.0 µl
20 .0 µl
② 在振荡器上混匀，稍离心；
③ 将三个反应管放入95℃金属浴中，5 min；
④ 将三个反应管立即插入冰中进行冰浴，稍离心，将反应管放入PCR仪中；
⑤ 设定反应程序：
预变性 94℃ 5 min
变性 94℃ 30 s
退火 56℃ 30 s 31 cycles
延伸 72℃ 30 s
最后在72 ℃条件进行延伸10 min。
⑸ 凝胶电泳检测PCR产物
① 称取1.5 g琼脂糖(agarose)，放入一三角瓶中，加入100 mL的1×TAE，在微波炉上加热，使其溶化；
② 等凝胶温度降至大约55℃以下（手持瓶子不烫手，即感觉热但能握得住）时，加入100 µl的0.5 mg/L溴化乙锭(EB)；
③ 制胶：将移胶板放入胶室中，并将梳子垂直安插在移胶板上方，将凝胶倒入放有移胶板的胶室中；
④ 等凝胶完全冷却凝固后变成乳白色不透明状（约30 min），将梳子轻轻地拔出；
⑤ 用拇指和食指轻抓移胶板两侧，将凝胶放入加有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，并使电泳缓冲液高出凝胶；
⑥ 取1.6 µl上样缓冲液滴在封口膜上，与8.4 µl样品混合均匀后，一同加入到凝胶孔中，此外加入5 µl的DNA分子量标准物；
⑦ 盖好电泳槽盖子，选择200 V的电泳电压进行电泳；
⑧ 待前面色素接近胶的先端（达到胶的2/3处），切断电流，停止电泳，打开槽盖；
⑨ 取出样品，在紫外灯下观察，摄像。
2.2.5 空斑实验
⑴ 细胞铺板：取一24孔板在超净工作台内每孔中加入等量的细胞悬液及培养液（不含抗生素），铺匀后置27℃、0% CO2浓度、饱和湿度的恒温箱中培养，待细胞生长至70%~80%时即可进行攻毒。
⑵ 空斑实验
① 将VSV病毒浓度进行梯度稀释，弃去24孔板中的原培养基，用PBS洗3次；
② 将病毒稀释液分别加入相应的孔中，盖上盖子，轻轻摇匀；
③ 将培养瓶小心放入27℃培养箱培养,使病毒感染细胞1.5 h；
④ 弃去病毒液，加入含1.5%小牛血清的甲基纤维素，使其覆盖整个细胞表面；
⑤ 将培养瓶小心放入27℃、0% CO2浓度、饱和湿度条件下培养3 d；
⑥ 弃去甲基纤维素，用0.1%的结晶紫染色1 min，漂洗，风干，观察空斑和计数。
3. 结果
3.1 正常CIK细胞的培养特征
CIK细胞经复苏在27℃、包和湿度的条件下的培养大约36 h后，于倒置显微镜下观察，细胞贴壁生长，呈扁平不规则多边形，细胞之间彼此相连紧密，呈单层生长状态（图3-1）。
A

图3-1 正常培养的CIK细胞
A. 显微镜下正常细胞形态图（200×）
B. A图中黑色方框内照片放大

B

3.2 VSV病毒的复壮
在9个12日胚龄的鸡胚的尿囊腔中分别注入500 µl的VSV病毒原液， 孵育60 h后成功获得复壮的VSV病毒液,其中有两个鸡蛋因受感染而弃去。然后每个鸡蛋中提取的VSV病毒液用血凝实验检测病毒效价，结果显示各病毒液的效价存在差异。
1号鸡蛋中提取的病毒液的效价为4号孔1/16；
2号鸡蛋中提取的病毒液的效价为6号孔1/64；
3号鸡蛋中提取的病毒液的效价为7号孔1/128；
4号鸡蛋中提取的病毒液的效价为8号孔1/356；
5号鸡蛋中提取的病毒液的效价为7号孔1/128；
6号鸡蛋中提取的病毒液的效价为7号孔1/128；
7号鸡蛋中提取的病毒液的效价为9号孔1/512。
3.3 VSV病毒感染CIK细胞不同时间后产生的细胞病变效应
将正处于对数生长期的并铺满整个培养瓶表面70%~80%的CIK细胞用，体积分数为1/50的VSV病毒液感染，随着培育时间的延长细胞出现了不同程度的细胞病变效应，分别于12 h、24 h、36 h在显微镜下观察细胞形态并拍照记录（图3-2）。图3-2中，A为VSV病毒感染细胞12 h后细胞形态图，一小部分细胞开始融合，且有脱落迹象。B为VSV病毒感染细胞24 h后细胞形态图，大面积细胞融合、圆缩，脱落现象加剧并出现少量空斑。C为VSV病毒感染细胞36 h后细胞形态图，细胞圆缩加剧，并高度融合，有合胞体生成，大面积脱落，细胞崩解凋亡。
图3-2 VSV病毒感染CIK细胞不同时间段形态
A. VSV病毒感染12 h细胞形态
B. VSV病毒感染24 h细胞形态
C. VSV病毒感染36 h细胞形态

B
A

C

3.4 RT-PCR检测VSV病毒在CIK细胞中的复制
用体积分数为1/50的VSV病毒原液感染25 mL培养瓶中的CIK细胞单层，当细胞大部分脱落时（36 h），用TRIzol LS提取病毒RNA，可见离心管底部有微量的白色沉淀，加入预热后的DEPC水至10 µl，立即进行RT-PCR，并设置阳性及空白对照组。结果显示（图3-4），1号管在200 bp左右扩增出了明亮条带，与预期结果相符。2号管为空白对照组，没有出现任何条带，证明了在实验操作过程中不存在干扰因素。3号管为阳性对照组，在200 bp左右出现了明亮的条带。结果证明了VSV病毒在CIK细胞中进行了复制。
图3-4 RT-PCR检测VSV病毒在CIK细胞中的复制
M. DNA marker DL2000
1. VSV病毒感染CIK细胞复制后VSV病毒引物RT-PCR结果
2. 空白对照
3. 阳性对照

3.5 空斑试验
CIK细胞铺于24孔板，接种10倍系列稀释和5倍系列稀释的VSV病毒第4天，去除甲基纤维素覆盖物，用0.1%结晶紫染色，没有出现空斑，但是对照孔与实验孔有着明显的区别。空白对照孔颜色均匀紧致，而实验孔随着VSV病毒稀释度的增加，颜色逐渐淡化（图3-3）。由此证明，VSV病毒不能引起CIK细胞单层形成空斑。
有甲无毒
图3-3 VSV病毒空斑试验
A:10倍系列稀释空斑试验图
有甲无毒:有甲基纤维素没有病毒
有毒无甲:无甲基纤维素有病毒
对照:无甲基纤维素亦无病毒
A

有毒无甲 对照 10-4 10-3 10-2 10-1
有毒无甲
B
B:5倍系列稀释空斑试验图
有甲无毒:有甲基纤维素没有病毒
有毒无甲:无甲基纤维素有病毒
对照:无甲基纤维素亦无病毒

5-1 5-2 5-3 对照 5-4 有甲无毒
4. 讨论
4.1 VSV病毒对不同细胞系引起病变效应
病毒是严格的细胞内寄生物，大多数病毒可以在体外培养的细胞中繁殖。细胞感染病毒后，感染的单层细胞逐渐出现细胞损坏的组织学指征，这些变化称作细胞病变效应。这是由于病毒在特定的细胞内，借助细胞的翻译机制和能量得到复制，在其复制的过程中造成宿主细胞的病理效应，包括细胞的肿胀、凋亡和死亡裂解,以利于病毒的释放和扩散[6]。这些现象在未固定、未染色的细胞培养中用倒置显微镜可以观察到。刘翠艳[7]在研究兽医中药免疫增强剂时，发现VSV病毒感染小鼠成纤维细胞系（L929）后引起明显的病变效应。感染初始，L929细胞单层呈现出多数贴壁细胞变成圆细胞，现象较为严重。并随着时间的延长，培养瓶中全为圆细胞和轮廓不清的破碎细胞，细胞单层不复存在。褚秀玲等[8]做了有关VSV病毒人工感染小白鼠的免疫病理学研究，发现免疫后3 d小鼠肝细胞（IAR20）发生肿胀，胞浆内可见大量粉红色颗粒,感染后4-5 d，肝细胞呈重度颗粒变胜和水泡变性。同时，证明了仓鼠肾细胞（BHK-21细胞）在VSV病毒攻毒后8 h,可见细胞圆缩,间隙增大折光性减弱。攻毒后16 h,可见到染色质固缩于核膜旁,呈界限分明的半月状、颗粒状或环状. 24 h后,几乎大部分细胞都发生凋亡,核浓缩,染色质浓染凝集于核膜旁,核膜凹陷,形成凋亡小体，表现为凋亡细胞典型的“出泡”状[9]。Éva Gallyas等[10]研究表明，WK细胞系（the Wong–Kilbourne derivative of the Chang conjunctival cell line）对VSV病毒具有高度的敏感性。当WK细胞单层被VSV病毒感染10 h后，细胞开始圆缩，脱离，24 h加剧，48 h后细胞全部凋亡。由此证明，VSV病毒亦可引起WK细胞系的病变效应。
本实验则用VSV病毒感染CIK细胞单层，观察其病变效应。发现，攻毒后12 h，细胞开始融合聚集，少量脱落。24 h后，细胞圆缩，大范围融合，脱落现象加剧，并有空斑出现。36 h后细胞高度融合，并伴有包涵体与空泡生成，而且大部分崩解凋亡。由此可见，VSV病毒可引起多种细胞系产生病变效应，且现象大同小异，这对该病毒检测方法的研究奠定了基础。
4.2 VSV病毒对Vero细胞、3T3细胞、CIK细胞的空斑实验结果的比较
空斑是细胞病变的一种特殊形式[11] 。可引起细胞病变的病毒，在某些培养的单层细胞中能形成肉眼可见的空斑。空斑技术首先是由Dulbecco 在1952年发明的[12]。测定空斑形成的数量可准确地了解病毒的感染性，获得比50% 细胞培养感染滴度(TCID50)更精确的结果。目前该技术还可用于疫苗效价的检测，李明才[13]等人创造性地用空斑技术测定口服脊髓灰质炎三价疫苗的效价，用甲基纤维素营养液覆盖代替了经典的琼脂覆盖方法，测得的结果与标准方法《微量细胞培养病变法》检测结果一致。由此可见空斑技术在生物技术中发挥了越来越大的作用。
资料表示， VSV病毒几乎可以在所有常用的实验室培养细胞内生长，包括鸡胚细胞以及牛、猪、恒河猴、豚鼠以及其它动物的原代肾细胞，迅速引起细胞病变，且在肾细胞单层上可产生不同大小的蚀斑。孟继鸿等[14]在用非洲绿猴肾细胞(Vero)对VSV病毒进行速成单