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生物技术药物的药代动力学研究进展摘要：本文介绍了生物技术药物药代动力学的特点和基本机制，概述了生物技术药物药代动力学的研究方法。关键词：生物技术药物 药代动力学 方法学1简介近年来，生物技术药物飞速发展，为了正确评价各种生物制品在人体内的疗效及安全性,必须研究生物因子在动物体内和人体内的吸收、分布、代谢和排泄的规律。而与传统的药物相比生物技术药物具有种族特异性、免疫原性和非预期的多向活性等特点,使得其在体内的药代动力学的研究受到诸多因素的限制。蛋白多肽类药物因其生理活性强、疗效高,而日益受到人们的重视。对于蛋白质类药物来说,最重要的一个特性是,这类药物蛋白质与内源性的蛋白质结构相似,由共同的氨基酸组成,微量的需要被测定的生物因子及蛋白质存在于大量的内源性蛋白质中。蛋白多肽类药物的药动学有其特征，吸收方面来看，一般而言，小分子肽的吸收是由被动扩散或载体转运完成的，脂溶性多肽可通过膜脂扩散,高度亲脂性的药物则能通过淋巴系统被吸收;水溶性分子则可通过水合孔和/或细胞间隙扩散,通过内吞或胞饮过程摄取入细胞，还有一些细胞转运肽(cell penetrating peptide)可通过非耗能途径穿过真核细胞的质膜,这些多肽已被成功地用于在细胞内转运比自身的相对分子质量大许多倍的大分子物质。由于大多数蛋白多肽类药物具有相对分子质量大和水溶性的特点,若无主动的转运或消除机制,它们大多保留在细胞间隙。蛋白多肽类药物的主要代谢途径是体内广泛存在的蛋白多肽酶使其失活。不同的给药途径、给药方案、体内蛋白结合、种属特异性、内源性物质等对蛋白多肽类药物的体内药物动力学有至关重要的影响。因此, 设计合适的实验方案、选择正确的药代动力学研究方法和可靠的测定方法至关重要。2药代动力学的研究方法 21 同位素示踪法 同位素示踪法是通过目标蛋白质多肽上标记同位素,从而鉴别目标蛋白质和内源性多肽的方法。所使用的同位素有3、14、32、125等,125其因比放射性高、半衰期适宜、标记制备简单而最为常用。标记方法有两种,一是内标法,即把含有同位素的氨基酸加入生长细胞或合成体系,该法对生物活性的影响可能较小,但由于制备复杂而限制了其广泛应用;二是外标法,常用的化学方法如氯胺或Lodogen法将125连接于大分子上,其标记的样品比放射性高，制备容易半衰期短，成为现在最常用的生物技术药物标记物。姚文兵等运用同位素示踪法 125标记来研究聚已二醇修饰干扰素2的药代动力学,赵宁等用碘标法研究重组人肿瘤坏死因子在小鼠体内药代动力学和组织分布,都证明了同位素示踪法的灵敏度高,省时省力的特点,特别是对研究基因工程产品在动物体内的组织分布具有与其它方法相比有不可比的优越性。关于标记位点的选择,理论上任何部位均可被标记,但需考虑是否存在标记氨基酸被机体再利用合成新的蛋白质而影响检测结果的问题。当然,如果生物技术药物含有非天然氨基酸(如 氨基酸),标记位点的选择就不必再担心这样的问题了。在生物技术药物研究中放射性标记法是一个有效方法,但该方法存在标记同位素的脱离、标记氨基酸的生物再利用等问题,研究者应该在实验设计阶段给予充分注意并采取有效措施以避免这些问题的出现。大量资料表明药理剂量的外源性标记生物技术药物注射后由于在体内迅速降解或被机体重新利用,导致样品的总放射性并不代表原形标记物的浓度,因此用总放射性表示药代动力学过程往往是不恰当的。为了准确分析生物技术药物必须分离并分别测定血浆或尿中标记的原形物和其降解物、代谢产物的放射活性。可选择的用来分离标记生物技术药物的方法有:分子筛高效液相色谱法、反相高效液相色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和酸沉淀法等。常用的酸沉淀和免疫技术只是能够粗略地区分标记重组蛋白质药物与小片段蛋白质或游离标记核素。因此,酸沉淀后测得的放射性只是被用来近似代表原形重组蛋白质药物。但是,如果标记核素被重利用而合成别的蛋白质或产生分子量大(13)的蛋白质片段或代谢产物,酸沉淀法的准确性将降低。对标记不均匀的重组蛋白质药物来说,不含有标记氨基酸的任何降解产物将不能被检测到。由于存在这些问题,所以生物技术药物药代动力学特征的描述不能仅仅依赖于放射性标记法的研究结果,还应该结合其它分析方法的实验结果综合分析。 22 免疫学方法 免疫学方法是利用生物技术药物抗原决定簇部位的单克隆抗体特异性的识别被检测药物,再以放射计数,比色等方法予以定量。即将特异性的抗原抗体反应配以灵敏度检测的方法。常用的有三种。 221 放射免疫法（RIA） 该法是最敏感的免疫标记分析方法,精确度高且易规格化和自动化,也经常被用于生物技术药物的测定。其基本原理是用已知的标记抗原与标本中可能存在的抗原竞争一定量的已知抗体,分别形成标记的和无标记的抗原抗体结合物。再经某种途径分离结合的()与游离的()标记物,并根据测得的放射性强度,算出结合率 (+),此与标本中抗原的量成反比。Venturini等用单克隆和多克隆抗体两种方法测定51名志愿者体内的黄体生成素(luteinizinghormone),对两种方法测定值的比较表明,单克隆方法测定的激素值更接近临床结果。 222 免疫放射定量法(RMA)该法中被测药物依然是抗原,它先与固定相上的抗体形成抗原抗体复合物,再与标记抗体结合,形成:夹心状。由于需要有两个来识别,这就大大增加了方法的特异性,是一灵敏而低变异的方法,只是对标记抗体的纯度要求很高。试验时受检抗原与过量的标记抗体反应,然后加入固相的抗原免疫吸附剂,以结合游离的标记抗体,经离心后测定上清液中放射性强度,从而推算出标本中抗原的含量。 223 酶联免疫法（ELISA） 法是最常用的免疫分析方法,主要是因为它具有高灵敏度、重复性较好、自动化、非放射性、高效性和适合批量测定等优点。双抗体夹心法能够选用单克隆或多克隆抗体,甚至两者可以同时使用。等用法研究了滤过性毒菌白介素 6(viralinterleukin6,vIL6)的受体结合特性,曾衍霖等用ELISA法对重组新型人白细胞介素 2(125la)进行了大鼠药代动力学研究,White等首次用ELISA双抗体夹心法测定了20名健康志愿者血浆和血清中内源性杀菌 渗透-增强蛋白(bactericidal permeability increasing protein, BPI)的正常水平。刘秀文等用ELISA法研究猴静脉推注加滴注重组人碱性成纤维细胞生长因子后的药代动力学,取得成功,得到药物代谢的基本数据。陈琨等制备和纯化聚甘古酯(911)单克隆抗体,用还原胺化法,制备911BSA和911HSA复合物,间接ELISA法检测抗体生成,为911药代动力学的免疫学方法的建立提供依据。免疫方法的缺点在于它测定的是蛋白质多肽的免疫活性而不是生物活性,不能同时测定代谢物,具有抗原决定簇的代谢片断可能增加结果误差。不同来源的抗体与相同蛋白多肽反应可能有较大的差别,还可能受到内源物质的干扰。近来柴彪新等研究免疫学方法可部分反映生物学活性。 23 生物检定法 依据生物技术药物具有生物活性如抗菌、抗肿瘤、降压、凝血等药理学作用,就可将其作为生物分析法的观察指标用于药代动力学研究。生物检定法的基本原理是在体内和体外组织或细胞对被测生物技术药物的某种特异反应,通过剂量(或浓度)效应曲线对目标生物技术药物定量分析(绝对量或比活性单位)。整体生物分析法测定过程对实验条件的要求较严格,操作程序较多,如体内实验要建立动物模型,对设定的观察指标需建立相应的检查方法,耗时数周才能完成,价格昂贵又费时,增加了研究费用,并且观察终点受主观因素影响。细胞生物分析法常以细胞增值、变异和细胞毒为观察终点。汤仲明等曾在重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)的药代动力学研究中,采用TNF敏感细胞株929测定给药后血清中rhTNF浓度随时间的变化,并证实了该重组因子的抗肿瘤作用。汤仲明认为该法的特异性、重复性和精密度较差,观察终点易受主观因素的影响。与免疫分析法相似,生物分析法也受到活性代谢产物、生物基质、血清中抑制因子的干扰以及种属特异性的限制,也不能提供关于分析药物体内降解过程的信息。应用生物分析法进行药代动力学研究时应对上述情况的发生严格加以控制。 24 色谱和质谱法 色谱法对混合物分离鉴定的良好性能在生物技术药物的药代动力学研究中显示出至关重要的作用。其优势在于高度的特异性、精确的定量以及能够同时测定多种受试分析药等方面。色谱法主要有高效液相色谱法(HPLC),其原理是在经典液相色谱法的基础上,引入气相色谱的理论和实验方法,采用了高效固定相,高压输送流动相和在线检测技术发展而成的分离分析方法。HPLC法具有分离效率高、分离速度快、应用范围广,可对生物技术药物进行有效的分离鉴定而不影响受试物的分子结构和生物活性等优点。因此我国新药审批实验指导中明确规定:新药在进行临床前药代动力学实验时分析方法应首选高效液相色谱法。王玉万等用荧光高效液相色谱检测血浆中的阿维菌素(AVM)检测结果显示本方法灵敏度高,干扰少,重复性好。另外还有高效毛细管电泳(HPCE),它是以离子或电荷粒子为电场驱动力,在毛细管中按其浓度和分配系数不同进行高效,快速分离的新技术,它以高分辨率,高灵敏度,分析时间短,样品量少及操作简单等诸多优点而成为蛋白质多肽生物分子分离分析的重要手段。质谱分析对生物技术药物的鉴定起到决定性的作用。然而生物制品的处理过程和生物样品中分析物的含量太少已经很大程度上限制了它的应用和普及。质谱最新的改进使它能够分析分子量大于100kDa的蛋白质,甚至更复杂的混合物。液相色谱-质谱联用技术在选择性、灵敏度、分子量测定和提供结构信息等方面具有明显的优势,能够同时获得可靠的定性定量结果。因而已经被广泛应用于药物在生物体内的吸收、分布和代谢的研究。(包括代谢物的结构确定及定量)。如Ferraiolo等在给实验对象大剂量(0.51.0mg/kg)静脉注射松弛激素后,用单克隆抗体亲和层析分离得到外源性人松弛激素后再用快速原子轰击质谱进行分析。LC-MS已逐渐成为新药研究必不可少的手段之一。 25 电泳法 电泳技术在药代动力学研究中常和其它方法如放射性标记法、整体自显影法或免疫印迹法联合应用于生物技术药物的分离、鉴定和定量分析。广泛应用的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳( poly acryl amide gel electrophoresis PAGE)。本法的分析能力和灵敏度都很高。例如Ferraiolo等用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或整体自显影法测定血浆样品中125标记的重组人干扰素 17。最近几年迅速崛起的高新技术-蛋白芯片(protein chip)技术也有望应用于生物技术药物药代动力学的研究,其基本原理是将待测药品的抗体作为探针固定于固相支持物上,制成芯片;然后取待测药品与芯片进行反应,反应信号用扫描仪来检测,扫描结果再经计算机显示、分析。3结论 综上所述,生物样品中生物技术药物药代动力学研究的分析方法应该根据具体情况来选择。在某种程度上,可应用的分析方法依赖于生物技术药物的物理化学性质和生物特性。一般来说,没有哪一种分析方法能够解决研究中可能遇到的所有分析问题如原形物、复合物和代谢物的定量,生物活性的评价等。故几种分析方法联用,取长补短,来进行生物技术药物的药代动力学研究工作,将会取得令人满意的结果。 参考文献：1 鄢永胜. 蛋白多肽类药物的药代动力学. 咸宁学院学报, 2004, 24 (3): 100-104.2 琚志昌. 生物技术药物药代动力学研究的分析方法. 卫生研究,2002,31(2):133-1353 汪小凤、郑青. 生物技术药物药代动力学研究的方法学和实验设计. 中国生物工程杂志,2004,24(2):80-874 孙学惠，郭涛等. 药物检测新技术在药代动力学中的应用. 中国药房,2002,13(9):566-5675 赵宁,张英起,王增禄,等.新型重组人肿瘤坏死因子在小鼠体内的药代动力学研究.第四军医大学学报,2002,23(12):106510676 刘秀文,汤仲明,宋海峰,等.猕猴静脉推注加滴注重组人碱性成纤维细胞生长因子后的药代动力学.中国药理学与毒理学杂志,2002,16(3):220222789