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研究蛋白质凝聚凝胶的技术进展
摘　要　由于蛋白质形成的凝胶会影响食品的质构和品质,所以研究蛋白质凝胶对于食品科学有极其重要的意义。然而,蛋白质形成凝胶的机理过于复杂,需要更先进的技术来研究。介绍了用于蛋白质凝胶研究的最新技术进展,如原子力显微镜(AFM),共聚焦激光显微镜(CSLM)和漫射波光谱(DWS)。与传统研究凝胶的方法如动态流变仪和扫描电子显微镜(SEM)相比,这些新方法简化了样品的预解决,有实现在线测定的也许。由于样品处在天然状态,所以反映的信息更具有真实性,加上高分辨率,可以实现蛋白形成凝胶过程分子水平的可视化。因此,采用以上的新技术可认为研究蛋白凝胶的形成提供更多的信息。
　 凝聚和凝胶过程对食品加工起着重要的作用,它们能形成食品所需要的质构,也会带来不需要的沉淀或是分层现象。因此,研究胶体形成的特性对于稳定和形成食品所需结构十分重要,并且通过控制凝胶反映优化食品加工过程,提高食品品质。对于食品体系的凝胶和凝聚已有了进一步的研究,但凝聚凝胶现象还鲜有报道。由于研究凝胶过程有以下困难:一方面,蛋白和多糖是大分子,三维结构描述和定量困难。另一方面,凝胶过程是一个复杂的反映体系[1]。例如,球蛋白的凝胶过程,通常分为蛋白分子展开,解聚和聚合,凝聚[2]的环节。在热变性的过程中,天然蛋白分子伸展,暴露出功能性基团(如巯基和疏水基团)。随后,为了减少体系的能量,蛋白通过形成二硫键或疏水互相作用发生凝聚[3-4]。
当蛋白浓度高于形成凝胶的临界点时,凝聚继续发展形成凝胶结构。在整个反映过程中,最终的凝胶和凝聚体的结构受环境因素影响(蛋白浓度、pH、离子强度、温度等)很大。食品是个复杂的体系,一些成分会影响蛋白凝聚凝胶的过程如蛋白—蛋白的互相作用,通过改变二硫键形成、疏水互相作用、氢键或是范德华力,改变形成凝胶体的凝胶特性[5]。
此外,采用传统的分析手段难以获得更加进一步真实的凝胶形成信息。尽管采用动态流变仪、显微镜和动态光散射技术可以分析凝胶形成过程,但是这些方法重要通过度析凝聚发生过程时粒子尺寸或是弹性模量G′的变化来进行研究[6-9],通常需要复杂繁琐的样品前解决过程,如稀释、机械变形、干燥、冻干等,这些解决会破坏易破碎的弱凝胶,影响亚稳定体系。因此,保持体系接近原始天然状态对于考察物理化学因素对于凝胶最终质构的影响十分重要。抱负的分析方法应当是非破坏性的、非干扰性的技术,可以让样品处在天然状态下测定,从而获得处在软凝胶状态下,凝胶互相作用的信息[10]。随着科技的发展,一些新的非破坏性的技术应用于蛋白质凝胶和凝聚的研究中。文章论述了原子
力显微镜(AFM),激光共聚焦显微镜(CSLM)和散射光波谱(DWS)用于食品蛋白质凝聚凝胶的研究。在我国,虽然原子力显微镜已经广泛用于多糖结构的研究[11-13],但是用于蛋白质凝胶和凝聚的研究报道还很少。
1　AFM用于蛋白质凝聚凝胶
AFM起源于隧道扫描显微镜技术,它广泛应用于生物、物质结构、分子生物学等领域。AFM用于食品科学中以下六个方面[14]:AFM可以定性描述食品大分子的结构;通过AFM成像提供的结构参数描述食品加工和储存过程中定量分析分子结构变化;显
示不同分子之间的互相作用;为操控食品大分子提供条件;描述食品表面因物理特性变化而带来的细微变化;加工纳米食品的工具。
1. 1　AFM的原理
AFM的成像是通过“感觉”而非“观测”样品。在AFM观测样品时,一个安装在悬臂上的尖端扫描样品表面,通过记录悬臂的偏斜,通过激光二极管发出的激光照射在悬臂的末端,通过镜面反射把激光发射到光电二极管检测器上,得到悬臂偏斜的信号。当扫描样品时,样品表面的拓扑结构通过尖端和样品力的变化使悬臂发生偏斜。通过电脑解决悬臂偏斜变化形成样品表面三维结构[15]。
AFM的观测模式有三种:接触、非接触和轻敲。在接触模式中,尖端始终与样品表面接触,而非接触模式中,悬于空气中的尖端仅于样品表面吸附水层接触而不与样品接触。轻敲模式中,尖端与样品间歇接触,通常每秒接触300 000次,减少接触模式中产生的剪切力对于样品的破坏,这种模式通常适宜那些质地偏软的食品和生物样品。
1. 2　AFM的特点
与传统的电子和普通光学显微镜相比,AFM具有以下优点[14, 16]。
①具有高分辨率和大的放大倍数。AFM没有透镜,因此不受衍射极限或者球面像差的限制,对于某些样品可以实现原子级别的分辨率。
②简化样品解决的过程。AFM是非破坏的分析方法,不需要染色或是覆膜解决,也不用高能量的粒子流,不需要导电衬底,不受样品稠度的影响,观测时样品可以处在溶液中,基本达成在天然状态下或是近似天然状态下观测样品。
③可同时得到样品的二维和三维成像。
④可以连续的观测样品变化,所以可以直接观测正在进行的反映过程。如酶反映的过程。
⑤为操控大分子和调查大分子之间的互相作用提供了也许。
然而,目前AFM也有以下缺陷:相对较小的扫描面积,较慢的扫描速度,对于过于软的样品成像困难等
1. 3　AFM在蛋白凝聚和凝胶上的应用
AFM能有效地提供凝胶结构信息,进而补充流变仪或化学分析蛋白凝聚结构信息。AFM可以成功的反映乳清蛋白热凝聚现象,研究发现乳清蛋白凝聚体显示了同β-乳球蛋白凝聚体相似的微观结构[17]。在pH 7时,无论NaCl浓度如何变化,乳清蛋白凝聚体重要由椭球形微粒构成。以上研究结果对于理解不同条件下得到的热导致乳清蛋白凝胶特性差异提供了基础。
采用轻敲模式AFM观测到加热后β-乳球蛋白,发现它形成一种有规律的纤维结构,长度约25nm,厚度是1或2个蛋白单体[14]。这证明在低pH低离子强度下,形成的热导致β-乳球蛋白纤维体需要进行两步以上的反映。
Iwasaki等[14]采用AFM分析加热对于肌浆球蛋白丝形态的影响,发现在70℃时本来的串珠结构变成绳子结构,但是少量蛋白丝的结构没有明显变化。
Yang等[18]使用AFM观测鲶鱼凝胶结构,发现鲶鱼凝胶中具有平均直径为118 nm的环形孔洞球形凝聚体的平均直径为267 nm。他们认为球状凝聚体和环形孔洞的形成与水和离子渗透过正在水解胶原质时的方式有关。
AFM能从分子水平上解释食品流变学特性的差异,从力学的角度揭示蛋白凝聚特性。Iwasaki等[19]报道了采用AFM分析由热导致和压力导致的细丝状肌浆球蛋白凝胶中的串珠结构和弹性之间的关系。近期出现的阶段成像,力调制模式等新技术,使AFM可以定量测定物质弹性。
AFM也应用于分析蛋白凝聚动力学。Yay等[20]使用AFM分析采用GDL导致不同大豆蛋白凝聚的过程。将11S、7S、2S在100℃加热10 min后,加入GDL,采用AFM观测它们形成不同的凝聚曲线。单位时间内, 11S形成体积最大的凝聚团, 2S形成的凝聚团另一方面, 7S的凝聚团最小,所以可以推测11S的凝聚速度最快, 7S最小。
虽然AFM已经成功地运用于食品蛋白凝胶领域,但是对于观测高度复杂的真实食品体系,还存在局限性,有太多其他组分和组分间互相作用会干扰对调核对象的分析。但是随着技术的发展,AFM必然会广泛的应用于真实的食品体系。
2　CSLM用于蛋白凝聚凝胶
与传统的荧光显微镜相比,由于采用自动的显微镜技术、荧光探针技术、高容量和高强度的图片解决软件等先进技术,CSLM具有很高的放大倍数和高的分辨率。CSLM已经广泛的应用于分子生物学[21]、免疫学、药剂学[22]、基因学、生理学[23]等领域。
2. 1　CSLM的原理
运用激光束通过光栅针孔形成点光源,在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描,采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT) ,再通过信号解决,在计算机监视屏上形成图像。CLSM采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了1个带有小孔的挡板,平面以外的杂散光被挡住,消除了球差,并进一步消除了色差,且可将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成1个平面的或立体的图像[24-25]。
2. 2　CSLM的特点
CSLM已经逐渐用于食品微结构的研究,有如下特点[26]:避免固定或者脱水操作,避免破坏样品,因此减少了样品制备的时间和对样品性质的改变;荧光探针的使用可以特定观测食品的某种成分,提高检测的灵敏性和特异性;食品结构的变化可以连续的监测;“光切片”技术可以保证不破坏微观结构的条件下,观测表面以下不同深度切面的微观结构。虽然CSLM有诸多优点,但是CSLM尚有以下缺陷:受衍射极限的限制, CSLM观测某些蛋白和酪蛋白胶束的分辨率最高达成0. 2μm以上;同时某些与样品采用共价键结合的荧光探针会改变样品结构的影响[27]。此外,荧光信号逐渐减弱,会影响测定结果;扫描速度慢,并且目前CSLM不能检测静止的食品体系。
2. 3　CSLM在蛋白凝聚凝胶中的应用
由于CSLM适宜观测处在天然状态下食品体系[28],所以CSLM已经用于分析食品胶体,如蛋白-多糖相分离,蛋白凝胶结构,乳化和泡沫稳定性[29-34]。
CSLM可以用于测定胶体形成动态过程[26]。CSLM已经观测了采用凝乳酶导致全脂牛奶和低脂牛奶形成凝胶的过程。起初,酪蛋白呈现出粒径小于0. 5μm细微分散的小颗粒, 15 min后,酪蛋白颗粒开始发生凝聚,最终凝胶形成三维网络结构。从CSLM分析发现除了在低脂牛奶中脂肪球个数远少于全脂牛奶和凝胶速度低于全脂牛奶以外,低脂牛奶和全脂牛奶凝胶过程相似。采用CSLM观测GDL导致的凝胶过程时,发现在加入GDL后1-20 min(pH 6. 51~5. 64),一些粒径小于1μm蛋白微粒在各个方向上随机快速运动, 30 min后, pH下降到5. 58时,粒径小于2μm牛奶蛋白的凝聚体成为体系
的主体。开始发生凝胶化并形成可见的蛋白网络是在pH 5. 4,而此时蛋白已经完全静止。
CSLM可以清楚的描述在凝聚凝胶过程中大分子之间的互相作用,如多糖—蛋白、蛋白—蛋白。Sittikijyothin等[35]使用CSLM研究由β-乳球蛋白和他拉胶形成的混合胶。单纯的β-乳球蛋白凝胶呈现均质性,而混合胶具有两个相。β-乳球蛋白发生凝聚后,形成富含蛋白的连续相,他拉胶构成分散相。他拉胶浓度显著影响混合胶的微观结构,当增长他拉胶浓度时,会产生更具有开放性和不均匀的混合胶结构。GonCalves等[36]研究由β-乳球蛋白和刺槐豆胶形成混合胶也具有相似的结构[36]。Schmitt等[37]采用CSLM研究发现:总浓度为1%的β-乳球蛋白和阿拉伯胶,与总浓度1%的全溶β-乳球蛋白和阿拉伯树胶形成的凝胶完全不同。球状混合聚集物的沉淀平衡系数受构成聚集层的两种物质比例的影响。当蛋白浓度上升时,产生尺寸巨大、数量众多沉淀,这些沉淀由阿拉伯树胶包围的蛋白质凝聚团组成。而凝聚团由具有单个小泡颗粒(气泡表观直径4~10μm)和具有泡沫颗粒(气泡大小相对均一,直径在2~4μm)构成。在全溶β-乳球蛋白和阿拉伯树胶形成分散体系中重要是具有单个气泡的颗粒团。产生不同微粒的因素是:β-乳球蛋白和全溶β-乳球蛋白的分散性不同导致的。CSLM提供了加热乳清蛋白和β-乳球蛋白可
以形成复杂的凝胶网络的证据。疏水互相作用和氢键诱导β-乳球蛋白分子吸附到乳清蛋白上[39]。这一点在CSLM的照片上可以清楚地看到两者的荧光信号重合在相同的区域。此外,CSLM还显示β-乳球蛋白对于乳清蛋白凝胶结构的影响,当减少β-乳球蛋白的含量时,形成的混合凝胶网络更均匀。动态CSLM也成功地用于分析环境因素如离子
强度、pH、时间等对于凝胶结构的影响。采用动态CSLM可以清楚地观测到离子强度和pH对蛋白网络结构的影响。在低离子强度和高pH条件下, CSLM观测到酪蛋白形成带有大孔洞的粗糙网络结构,而在高的离子强度和低的pH条件下,形成蛋白网络比较均匀,孔洞尺寸较小[39]。这是由于酪蛋白在高离子强度下的去稳定化要慢于低离子强度,并且需要更低的pH条件来减少胶束表面的电荷,所以形成凝胶的速度较慢,容易形成结构精细的凝胶网络结构。
3　DWS用于蛋白凝聚凝胶
DWS起源于传统的激光散射技术。由于多散射光子叠加,使传统的静态或是动态激光散射技术都不能用于高浓度的胶体体系,只能分析稀释的悬浊体系,其浓度大约0. 01%。而凝胶化、相分离和絮凝现象发生的浓度,都高于激光散射测量的浓度范围[40]。但DWS却可以用于混浊的胶体体系,因此,DWS可以用于研究乳化剂、胶体、化妆品等领域。
3. 1　DWS的原理
当激光照射到组成胶体的颗粒上时,导致发生共振和散射,并且散射光受颗粒运动状态的影响[41]。DWS测定的是在颗粒间发生多次散射光子,这时光子的运动途径可以看作随机运动或是散布运动。因此,随时间变化的散射光强度直接与样品中颗粒运动状态有关,测定散射光变化,即可推出颗粒运动状态,进而得出凝聚的状态。
DWS有两种构造类型:同侧型和穿透型,同侧型,收集器和检测器与激光发射源在同一侧;穿透型收集器和检测器与激光发射源在异侧,所以散射激光必须穿过整个悬浊样品,散射激光的强度较高。同侧型的缺陷是有时收集的散射光没有发生足够散射,但是它具有激光能量低并且易于安装设备的优点,因此用于食品凝聚凝胶化的研究。
3. 2　DWS的特点
DWS可以在线测定未稀释或是未预解决过样品,得到凝聚颗粒的尺寸、空间相关性的信息。但缺陷是:DWS不能用于已经完全形成的凝胶,由于此时颗粒已经完全静止,体系中没有微粒移动,就不能用复杂的相关函数来推导凝胶的信息。目前没有商业
化DWS设备,只是一些实验室自制的DWS设备。因此,DWS的发展受软件和硬件的限制。
3. 3　DWS在蛋白质凝胶凝聚中的应用
目前,DWS重要用于研究初始状态下的食品凝聚凝胶化过程,如通过添加凝乳酶或酸化导致牛奶凝胶化过程,并测定凝胶网络的黏弹性[42-44]。研究表白,DWS可以准确测定凝结时间,并且能找到散射光强度变化和形成结构弹性之间的联系。DWS通过测定光子运动平均自由行程(l*)的变化,发现使用凝乳酶和酸凝固的酪蛋白凝胶差异明显。参数l*是穿透性DWS特有的表征微观结构发展变化和不同类型凝胶形成机理的指标。凝胶化过程中,l*的变化要早于颗粒凝聚尺寸变化和流变学变化。在酸化和凝乳酶诱导的凝胶体系中,随时间变化,两者的l*不同,所以证明在两种凝胶化过程中蛋白质间不同的互相作用类型[45]。
即使在发生凝结之前,DWS显示在光子平均自由行程上加热和未加热的牛奶有明显的差别[46]。在加热后的牛奶体系中,从加入酸化剂到pH下降到5. 5时,酪蛋白胶束表观半径逐渐呈现线性下降了20 nm。当pH到达5. 4时,颗粒的表观半径开始逐渐缓慢上升,直到pH到达5后,颗粒的表观半径爆炸性增长。而在未加热牛奶中在pH 5. 4就已有相称大的增长,而此时颗粒尺寸并没有较大的变化,这就意味着在这个体系中,颗粒间存在力的互相作用早于形成凝聚。这种互相作用在加热后的牛奶中表现更为明显,当开始酸化pH为6. 0以上,颗粒的尺寸没有变化时,颗粒间的互相作用就已经表现
出来了。以上结果表白加热牛奶中的酪蛋白胶束在未发生凝聚时,已经被乳清蛋白和κ-酪蛋白形成的薄弱的凝胶网络限制了移动,并最终发生凝聚。这一假设通过使用改变牛奶中酪蛋白胶束和乳清蛋白比例,得以验证[47]。
采用DWS研究酪蛋白胶束表白,只有当凝乳酶水解掉90%以上的κ-酪蛋白后,酪蛋白胶束才开始凝聚[48]。只要有少量“毛发”κ-酪蛋白存在,以及体系中残留乳清蛋白的存在,就能阻止酪蛋白胶束的凝聚。DWS研究发现:转谷氨酰胺酶解决过的酪蛋白胶束通过度子内部的互相作用,也能阻止凝乳酶导致的凝聚发生[49]。
4　结论
概括了AFM、CSLM和DWS在食品蛋白质凝聚凝胶研究中的应用。这些技术简化样品预解决过程,甚至不需要预解决就可以分析蛋白凝聚凝胶的动力学,用于发现不同加工条件对于形成的凝胶特性的影响。但是现在仍然不能直接用于真实的复杂的食品体系,伴着随仪器设备的发展,它们必将为人类提供更多有关食品蛋白质凝聚凝胶化的有用信息。