利用荧光显微技术研究生物单分子市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

利用荧光显微技术硕士物单分子利用荧光显微技术硕士物单分子陈浩25023 分析化学专业第1页光学单分子方法进展光学单分子方法进展近20 年来,光学探测方法有了长足进步。在80 年代出现并逐步成熟起来近场显微术为超衍射极限分辨成像提供了基本伎俩,同时也使光学显微术进入了纳米科学领域。而共焦显微术不但突破传统光学衍射极限,而且为光学探测引入了第三维空间信息,使光学探测含有了层析能力,实现了真正空间三维成像。超短脉冲激光技术直接造成了多光子荧光显微术成功。尤其是飞秒激光激发荧光显微术,对于提取时间分辨信息是有力工具。这种荧光单分子探测及单分子光谱探测与其数据处理方法组合,形成了荧光共振能量转移探测方法。经过该方法能够取得1.5 纳米 8 纳米空间分辨率构像信息,到达光学方法上最高分辨率。以上近场、共焦、荧光显微术和荧光共振能量转移四种基本技术组成了当前活跃生物单分子探测光学平台。第2页Myosin V 分子结构肌球蛋白是包含18个不一样子类一大类蛋白分子马达，但构型上都属于二聚体，有两个显著伸出“头”，用于附着在肌球蛋白丝上，这里我们干脆称之为“腿”。第3页Myosin V 两种运动模型(1)在Hand-over-hand模型中，后腿向前移动了74nm，而前腿没有移动。分子本身移动了37nm，染料移动了372xnm，(假如MyosinV结构是不对称，x为染料到轴平均距离)。(2)在inchworm模型中，myosin 分子全部部份都向前移动37nm，而且有一个头一直与肌球蛋白丝结合在一起。第4页单分子荧光技术检测运动模型把一个荧光分子标识在myosin V 一条腿上，再用荧光显微镜来对标识荧光分子进行检测。据此来研究myosin V迈步过程。详细检测技术：全内反射荧光显微共聚焦荧光显微第5页远场和近场光学检测主动或被动发光原因是物体受激发之后,内部电偶极跃迁引发电磁场辐射,电磁波从物体表面向自由空间传输。物体表面以外场分布能够划分为两个区域:距物体表面仅几个波长内区域,这一区域称为近场区域;近场区域以外到无穷远是远场区。常规激发和搜集均处于远场区域。在远场区域只存在能够向无穷远传输远场波(也称为辐射波)。近场区域光场包含了限于表面仅几个波长内存在成份,即近场波(也称为非辐射波);又包含远场波。近场波也被称为衰逝波,(隐失波),其强度随离开表面距离指数衰减,不能在自由空间存在。近场波表达了光在传输过程中,碰到空间光学性质不连续时,光波空间瞬态改变,这种改变很快在空间衰减,它反应了空间光学性质不连续性。第6页全内反射显微光在光密介质中传输,假如它以大于临界角角度入射到另一个折射率较小介质上,光就会发生全反射。实际上,即使当角度 Hc,依然会有一小部分能量以隐失波形式穿透到液体介质中,在“近场”情况下,光沿平行界面传输。由全内反射产生近场激发照明之后,利用共焦或宽场去取像,即组成荧光标识全内反射荧光显微镜。全内反射显微术经典垂直照明深度全内反射显微术经典垂直照明深度100nm100nm。这么薄光学层析层切片意味着。这么薄光学层析层切片意味着信噪比比共焦系统好得多信噪比比共焦系统好得多,细胞光损伤和光漂白也很小。其图像是经过细胞光损伤和光漂白也很小。其图像是经过CCD CCD 相机来捕捉。这种仪器很灵敏或成像速度很快相机来捕捉。这种仪器很灵敏或成像速度很快(但极少有但极少有CCD CCD 相机兼有以上相机兼有以上两个优点两个优点),),当前可到达量子产率已到当前可到达量子产率已到 80%,80%,成像速率成像速率200200帧帧/秒。秒。第7页共聚焦显微在光学成像系统中利用两个焦点来生成物体象。一个焦点为使用显微镜物镜把入射激光在物体表面或内部形成。这个焦点便是一个象点，也是一个点光源。它能够是反射光，也能够是物体受激发发出荧光。这一象点再经过另一个物镜成像在针孔孔径上，则生成了第二个焦点。这两个焦点是共轭（共焦）。经过沿x或y方向一点点地生成象点，综合成平面图像，再调整z方向生成象点，经过计算机合成三维图像。所以共焦显微镜含有对细胞和光漂白区域进行深度三维成像能力。第8页Hand-over-hand VS inchworm纳米精度荧光成像技术FIONA Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy inchworm模型预测每步长度应该是37nm，分子本身移动也是37nm；而hand-over-hand模型观察长度应该是分子本身移动位移两倍也就是74nm。为了测试这两个运动模型，科学家开发了一个单荧光分子成像技术来定位，误差能够小于1.5nm，并含有0.5秒时间分辨率。同时能够拍摄几分钟影像来观察。全全内内反射反射荧光光显微微(TIRF)用来激发多个单个荧光分子，并使用CCD来拍摄帧逐帧连续图像（不存在帧间失效时间）。单纳米准确荧光成像(FIONA)技术比使用其它方法在常温下对单荧光分子定位准确度提升了20倍，在成像能力上提升了10倍。Probes:RB or Cy3第9页在myosin V光链区用一个RB或Cy3荧光分子来标识。被标识myosin V分子被加到肌动蛋白丝，并用TIRF来观察。荧光图像使用0.5s时间来搜集。大约每40m*40m区域内有20个点能够被观察到。每个FWHM 280nm，大约每个光斑在每张照片上有5000到10000个光子被搜集到，这使我们能够对中心区进行定位，偏差小于3nm，比较亮点，偏差小于1.5nm。有些染料闪烁造成亮度改变能够被观察到。第10页怎样检测单分子生物单分子尺度在1 纳米10 纳米,当前荧光标识单分子团在100 纳米左右。传统光学方法(远场显微镜)到达最好分辨率是250 纳米,共焦显微镜分辨率仅提升了1.4倍 2 倍,荧光显微术能够再提升2 倍 4 倍,不过仍不能到达单分子级。所以当前利用荧光远场成像方法所揭示大部分是荧光团行为。在分析了大量图像之后，发觉大多数光斑都显示单个熄灭，表示这是单个分子。测出步距只是单个被标识myosin分子。第11页在没有ATP存在时，荧光光斑不移动。加入300nm ATP之后可识别到有移动，且ATP浓度越大，平均移动率越高。总说来，我们观察到49个不一样标识上BRmyosin V分子并检测到总共552步。我们观察了三个不一样群体myosin V分子群，显示出几个不一样步长，有74nm，也是52/23之间变动，或者42/33之间变动，但没有发觉37nm长。第12页Myosin V步距统计检测了38个myosin V分子365步，每一步都是迈出74nm。其中32个分子足够亮，能够产生一个大于10信噪比SNR，在总共231步中。这些步柱状图显示平均步距为73.85.3nm(5.3nm为平均标准偏差)，这与正态分布有非常好地拟合(r 2=0.994,X2 r=1.67)。同时也检测到了6个按52/23nm交替前进分子，和6个按42/33交替前进分子。假如是inchworm模型，每一步长度应该都是37nm左右。第13页结论myosin V 运动是遵照hand-over-hand模型，两个头部交替附着在肌球蛋白丝上向前运动。以上是一个完整利用单分子荧光技术来检测生物大分子例子。第14页Animation:Myosin V walking along an actin filament电子扫描成像显微术及各类非光学探针扫描成像显微术均含有比光学显微镜更高空间分辨能力。但它们在不一样程度上存在着系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻及样品处理繁琐等困难。而且它们均不能取得样品主要光学信息(比如:光反射率、折射率、偏振态及光谱等信息),尤其是不能进行无损伤性生物活体探测,因而无法完全取代光学显微成像地位。第15页荧光共振能量转移荧光共振能量转移该技术能够从探测到荧光强度随时间改变来取得分子之间距离和方位信息。它原理以下:两个被不一样荧光染料标识分子或细胞两部分,当它们相距在10-100 埃时,能量开始从给体荧光团传递到受体荧光团,即产生能量共振现象,使该受主辐射光子。探测此能量转换方法能够利用共焦显微术结合全内反射显微术方法。第16页展望展望1.1.即使光学方法对于探测单发光团分子是足够灵敏即使光学方法对于探测单发光团分子是足够灵敏,但它不可能局但它不可能局部化这个探测点小到能够与一个分子尺度相比程度。为了改进分部化这个探测点小到能够与一个分子尺度相比程度。为了改进分辨率缩小光孔尺寸辨率缩小光孔尺寸,需使原来很弱光衰减得更弱。最终要求在探需使原来很弱光衰减得更弱。最终要求在探测中不不过探测到单分子荧光团存在测中不不过探测到单分子荧光团存在,而且要探测到单分子结构而且要探测到单分子结构形状和行为。处理该问题路径之一是使光学显微镜荧光高灵敏探形状和行为。处理该问题路径之一是使光学显微镜荧光高灵敏探测与原子力显微术相结合。还能够借助于光钳进行单分子操作技测与原子力显微术相结合。还能够借助于光钳进行单分子操作技术术,而且合并光谱信息探测。而且合并光谱信息探测。2.2.在促进我们对生物大分子行为及其功效关系了解方面在促进我们对生物大分子行为及其功效关系了解方面,单分子荧单分子荧光探测和光谱给人们以很大希望。其最大挑战是掌握研究活细胞光探测和光谱给人们以很大希望。其最大挑战是掌握研究活细胞中个别和稀有生物过程。当前染料荧光技术还不能完全应付这种中个别和稀有生物过程。当前染料荧光技术还不能完全应付这种挑战。不过对于适合用于半导体激光荧光染料技术研制已经起步挑战。不过对于适合用于半导体激光荧光染料技术研制已经起步 ,发展其它利用特殊光物理性质新荧光探针也是必要。发展其它利用特殊光物理性质新荧光探针也是必要。第17页Thank you!第18页