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1、 第 42 卷 第 6 期 2013 年 浙 江 大 学 学 报 （ 医 学 版 ） JOUＲNAL OF ZHEJIANG UNIVEＲSITY （ MEDICAL SCIENCES） Vol 42 No 6 2013 http： ∥www． journals． zju． edu． cn / med DOI： 10． 3785 / j． issn． 1008-9292． 2013． 06． 019 噬菌体治疗细菌感染的研究进展 裴景亮1，付玉荣2综述 （ 1． 潍坊医学院医学检验学系、附属医院检验科、 山东省临
2、床检验诊断学高校重点实验室，山东 潍坊 261031； 2． 潍坊医学院基础医学院病原生物学教研室，山东 潍坊 261053） ［摘 要］ 噬菌体是一种细菌依赖性病毒，在治疗细菌特别是耐药性细菌感染方面，与传统的抗 生素比较具有独特的优势，其代谢动力学及给药途径是目前的研究热点。噬菌体裂解酶作为一种 新的治疗手段，具有比活性噬菌体制剂更多的优点。文中就噬菌体在细菌感染治疗方面的作用机 理、给药途径和基因工程的应用，及噬菌体裂解素的研究进展进行综述，对噬菌体治疗细菌感染提 出展望。 ［关键词］ 细菌噬菌体； 裂解酶； 给药途径； 细菌感染 /治疗 ［中图分类号］ Ｒ 37
3、8 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1008-9292（ 2013） 06-0700-05 Ｒesearch advance on bacteriophage therapy in bacterial infection PEI Jingliang1，FU Yurong2（ 1． Affiliated Hospital of Weifang Medical University，Key Laboratory of Clinical Diagnosis in Universities of Shandong，Weifang 261031； 2． Department of Mic
4、robiology，Weifang Medical University，Weifang 261053） ［Abstract］ Bacteriophage is a bacterium dependent virus． It has unique advantages in the treatment of bacterial infection，especially infection caused by drug-resistant bacteria． Its metabolic kinetics and route of administration are the curr
5、ent research focus． Bacteriophage lytic enzyme，as a new therapeutic method， has more advantages than active bacteriophage． This review is focused on the recent progress in bacteriophage research，including the mechanism of bacteria lysis，the route of administration，the application of genetic engin
6、eering，etc． ［Key words］ Bacteriophages； Lytic enzymes； Ｒoute of administration； Bacterial infection / therapy ［ J Zhejiang Univ （ Medical Sci） ，2013，42 （ 6） ： 700-704． ］ 耐药菌特别是多重耐药菌的出现对人类健 收稿日期： 2012-09-03 修回日期： 2013-01-30 康构成了极大威胁，这类细菌感染的疾病面临 无药可用的境地。寻找新的有效的抗菌制剂已 经成为刻不容缓的问题。噬菌体
7、制剂作为新型 的治疗方法，受到越来越广泛的关注。 噬菌体（ bacteriophage，phage） 是一类特异 性感染细菌、真菌、放线菌等微生物的病毒，广 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （ 81100006 ） ； 山东省自然科学基金资助项目（ ZＲ2010HM073） ． 作者简介： 裴景亮（ 1979 － ） ，男，硕士，主管技师，从事 临床微生物学研究工作． 通讯作者： 付玉荣（ 1973 － ） ，女，博士，副教授，硕导，从 事病原微生物学研究； E-mail： yifuyurong@ 163． com 第 6 期
8、 裴景亮，等． 噬菌体治疗细菌感染的研究进展 ·701· 泛存在于水、土壤、植物、动物和人体中，其遗传 物质和结构都非常简单，必须寄生于细菌、真菌 等宿主体内，借助宿主菌的酶系统及其他条件 才能进行复制。 1 噬菌体裂解细菌的机制与代谢动力学 根据噬菌体与宿主菌的关系，一般认为烈 性噬菌体更适合作为细菌感染治疗的工具。噬 菌体在宿主菌体内具有自我复制功能，因此很 难构建一个数学模型来揭示噬菌体的代谢动力 学，以及采取何种给药途径进行治疗也没有严 格的标准。在体内噬菌体发挥杀菌作用还与机 体的免疫状况密切相关。Birendra 等［
9、1］在中性 粒细胞减少的绿脓杆菌感染的小鼠模型中发 现，PA1Φ 不能保护中性粒细胞减少的小鼠的 绿脓杆菌感染，研究证实： 噬菌体与中性粒细胞 联合作用会起到更好的作用。噬菌体控制细菌 感染有 2 种方式： 被动治疗与主动治疗。 被动 治疗则指最初的噬菌体剂量足以在数量上大大 超过细菌，细菌一次吸附了大量的噬菌体颗粒， 细菌被裂解。主动治疗指噬菌体侵染细菌后在 细菌体内增殖再次攻 击 细 菌 发 挥 裂 解 作 用。 Birendra 等［1］的实验证明，噬菌体在体内 72 h 即可被机体的免疫系统清除，噬菌体的这种动 力学特性决定了其给药途径与传统的抗生素截 然不同
10、 噬菌体对宿主菌的溶解是由噬菌体自身蛋 白介导的溶解系统完成的。缺乏溶壁酶的小基 因组噬菌体利用多肽在不同阶段抑制宿主菌的 胞壁质合成酶，从而在不同阶段溶解宿主菌。 目前研究比较清楚的大肠杆菌 λ 噬菌体，其裂 解基因包括 S、Ｒ 和 ＲZ3 个基因［2］。Ｒ 基因和 ＲZ 基因的产物分别降解细胞壁的肽聚糖和切 割肽聚糖寡糖间的交联，而 S 基因的产物作用 于细胞膜上形成孔洞，使 Ｒ 基因和 ＲZ 基因产 生的酶到达细胞壁，从而降解细胞壁的肽聚糖。 2 全菌噬菌体制剂治疗细菌感染的应用 2． 1 全菌治疗的应用 近几年，研究人员对噬 菌体的筛选、分离纯化、治疗前
11、的处理、药物动 力学等进行了大量的研究［3］，实验证明，噬菌 体治疗细菌感染具有很高的有效性和安全性， 尤其是耐药菌的感染。耐甲氧西林的金黄色葡 萄球菌（ MＲSA） 的治疗是临床上面临的棘手的 问 题，Capparelli 等［4］ 人 利 用 噬 菌 体 来 控 制 MＲSA 的感染，取得了良好的效果，其研究结果 显示 MＲSA 的噬菌体在体内和体外都可以杀 灭巨噬细胞内部的 MＲSA。噬菌体的指数增殖 能力是噬菌体治疗的突出优势，只需少量的噬 菌体就可以完成裂解细菌的工作。噬菌体具有 高度特异性，不会影响到其他的菌群，不会破坏 体内微生态的平衡、导致其他耐受
12、性致病菌的 生长，也很少引起胃肠道反应、过敏反应等［5］。 Birendra 等［1］观察了一种新型绿脓杆菌噬菌体 PA1Φ 在小鼠绿脓杆菌感染模型中的作用，发 现噬菌体能有效地治疗致死剂量的绿脓杆菌引 起的感染，小鼠的存活率可达 80% ～ 100% 。 噬菌体治疗小鼠没有产生败血症任何迹象，而 未经处理的小鼠表现出垂死的状态，最后死于 败血症。随后的研究也证实了 PA1Φ 噬菌体在 体内有很强大的杀菌功效［6-7］。感染肺炎克雷 伯菌的烧伤小鼠模型注射噬菌体，可使小鼠成 活率达 73． 33% ［8］，显著高于常规药物治疗组。 2． 2 全菌的给药途径 噬菌体的给药
13、途径是 目前的一个研究热点，与噬菌体治疗的成效密 切相关，目前最常用的是口服和注射两种途径。 口服噬菌体制剂在治疗胃肠道感染时被认为是 最有效的给药方式。口服后噬菌体制剂要在胃 液的高酸性环境中保持活性，必须采取一定的 措施，有报道采用聚合物的胶囊可以保护噬菌 体，从而提高疗效［9］。 Oliveira 等［10］的研究证 实一些口服的噬菌体有被吸收进入全身循环的 能力，研究结果证明某些噬菌体可能不仅驻留 在肠腔而且还通过肠壁，这个过程类似于细菌 的移位定值，这个过程可能与噬菌体的浓度、噬 菌体与肠道免疫细胞的相互作用、噬菌体的特 定序列有关。动物实验证明，注射是一个
14、最常 用也最成功的噬菌体治疗给药途径，因为噬菌 体能迅速分布到全身，迅速到达感染部位。然 而最近的研究表明，不同的注射方式，如肌肉注 射、皮下注射、腹腔内注射疗效却不一致，但都 表 明 噬 菌 体 的 浓 度 越 大，其 抗 菌 效 果 越 好［11-13］。雾化吸入噬菌体用于肺部细菌感染 是现在的一个重要突破，有研究证实噬菌体制 ·702· 浙江大学学报（ 医学版） 第 42 卷 成干粉后在 4℃ ～ 22℃ 的情况下可保持稳定性 达三个月，可以作为治疗肺部细菌感染的一个 重要方式［14-15］
15、 另外噬菌体制剂局部外用以 及医疗设备的杀菌都有成功的例子［16-18］。 2． 3 全菌治疗遇到的问题 活噬菌体制剂宿 主特异性太强，宿主谱太窄是目前的主要问题。 自然分离的噬菌体都具有高度专一的宿主选择 性，往往只能感染单一的细菌分离株，为了解决 这一问题，有研究采用鸡尾酒疗法，不同菌株的 噬菌体混在一起，拓宽噬菌体的裂解谱，结果表 明混合噬菌体在很多时候优于单一的噬菌体制 剂［19-20］。利用分子生物学技术，拓展噬菌体的 宿主谱，为噬菌体制剂的应用提供了一个新的 思路。Mahichi 等［21］利用同源重组技术，用宽 宿主谱噬菌体 IP008 的 g37 和
16、g38 替代 T2 噬 菌体的相应基因，得到的重组噬菌体获得了与 IP008 相同的宿主谱，并保持了其裂解活性。 这些研究表明，通过遗传改造噬菌体的宿主识 别基因可以人为改变噬菌体的宿主谱。 机体免疫系统对噬菌体的清除也是噬菌体 治疗中必须解决的一个重要问题。此外，机体 免疫系统产生针对噬菌体的中和抗体，引起噬 菌体失活，为了避免出现这一情况，需要找到降 低噬菌体免疫原性的方法。 噬菌体会将某些毒力基因水平转移至细菌 中。对于那些由噬菌体传播的毒性基因和耐药 性基因，解决的办法是选择合适的噬菌体，避免 使用具有转导作用的噬菌体，以及构建遗传学 突变的噬菌体。噬
17、菌体治疗的药代动力学可能 会比常规药物更为复杂。 其机制还需进一步 研究。 3 噬菌体裂解酶制剂的应用 为了克服活性噬菌体制剂的局限性，人们 设想提纯活性噬菌体的特异性裂解酶作为抗菌 制剂治疗细菌感染。这种特异性裂解酶是一类 细胞壁裂解酶类，它与细菌细胞壁的糖基特异 性结合，发挥作用； 而这种细胞壁糖基具有种属 特异性。纯化的噬菌体裂解酶可以用于细菌感 染的治疗和预防是 Nelson 等 2001 年证实的。 这种胞壁质裂解酶在噬菌体感染革兰阳性菌和 革兰阴性细菌时发挥重要作用，研究表明，纯化 的噬菌体裂解酶 Cpl-1 在肺炎链球菌引起的心 内膜炎和细菌性脑膜
18、炎的试验中，显示出了良 好的抗菌活性［22］。全菌噬菌体和噬菌体裂解 酶制剂治疗细菌感染的优缺点见表 1。 表 1 全菌噬菌体和噬菌体裂解酶制剂治疗细菌感染的优缺点 Table 1 The advantages and disadvantages of bacteriophage and lytic enzymes 特 点 化学成分 活病毒 全菌噬菌体制剂 噬菌体裂解酶制剂 蛋白质（ 病毒的成分） 来源途径 抗菌谱 在宿主菌内能自我复制，获取方便、价格 低廉 特异性很强，杀菌谱窄 利用分子生物学技术，易于定向操作
19、获得， 便于基因修饰 特异性强，可通过遗传改造，拓宽杀菌谱 安全性 高，但能潜在传播毒性基因和耐药基因 很高，不能传播毒性基因和耐药基因 杀菌（ 包括耐药菌） 效能 高效快速 高效快速 抗药性 体内稳定性 给药途径 药代动力学 应用前景 易产生抗药性 具有强免疫原型，刺激机体产生中和抗 体，易被机体清除 口服、注射、吸入、局部外用 尚未明确 较高 不易产生抗药性 分子量小，不易刺激机体产生中和抗体，稳 定性较高 尚未明确 高 内溶素作为一种裂解酶制剂受到越来越多 的的关注，Bokyung［2
20、3］首次报道 LysB4 噬菌体 内溶素具有很强的抗菌作用，而且噬菌体内溶 素具有较宽的抗菌谱，在革兰阳性及革兰阴性 菌种都表现出了抗菌作用； 研究还发现 LysB4 噬菌体内溶素最适 pH8． 0 ～ 10． 0，活性需要二 第 6 期 裴景亮，等． 噬菌体治疗细菌感染的研究进展 ·703· 价金属，特别是 Zn 离子的参与。 葡萄球菌属细菌引起的感染在人和动物都 很常见，而且能通过多种途径获得耐药性，现在 治疗此类感染变得非常困难。噬菌体编码的内 溶素不仅能高效的杀灭耐药菌而，且在体内
21、无 残留。Hirofumi 等［24］从污水中分离了 P-27 / HP 噬菌体，并纯化了其内溶素。在 SDS-PAGE 电 泳中 P-27 / HP 内溶素分为 33． 5 kDa、48． 6 kDa 与 62． 2 kDa 三个片段。体外实验证明，在 37℃ ～ 40℃ ，pH 为 7． 0，内溶素具有最大杀菌活性； 动物实验也证实了 P-27 / HP 内溶素强大的杀 菌作用。 有些裂解酶在裂解细菌细胞壁时，因为缺 少信号肽而需要 Holin 蛋白的协助。Holin 蛋 白是一种疏水性跨膜蛋白，在噬菌体复制晚期， 于宿主菌细胞膜上形成非特异性的孔洞或损 伤，促使细
22、胞壁水解酶接近它的肽聚糖靶点，以 此控制裂解酶在体内裂解细菌的时间。Holin / 裂解酶共同作用的模型在肺炎球菌、金黄色葡 萄球菌和乳酸菌中普遍存在［25］。 噬菌体裂解酶作为一种新型抗菌剂与活性 噬菌体比较，最大的优点就是不能自我复制，易 于定向操作，不产生抗药性； 同时还具有高效快 速、安全性高、基因修饰简单、应用前景好等优 点。到目前为止，噬菌体裂解酶还处于实验室 研究和临床实验阶段，裂解酶细胞壁识别位点 的分子和基础结构了解得很少，而这是了解裂 解酶如何降解细菌外膜的关键。Horgan 等［26］ 对裂解素的功能区域进行了进一步的研究，发 现小的功能单位仍具
23、有活性。 与活性噬菌体制剂一样，噬菌体裂解酶的 应用同样受限于其特异性，因此扩大噬菌体裂 解酶的杀菌谱仍然是一个需要解决的问题。噬 菌体裂解酶由两个独立的结构域组成，N 端的 催化结构域相对保守，C 端的细胞壁结合结构 域决定其宿主特异性，通过不同噬菌体裂解酶 之间结构域的交换重组可以改变裂解酶的宿主 特异性或（ 和） 裂解能力，可以基因工程技术交 换重组裂解酶的不同结构域改变其作用范围或 （ 和） 提高其裂解活性。造成严重临床感染的很 多致病菌是革兰阴性菌，如何对噬菌体裂解酶进 行修饰，使其穿过外膜裂解肽聚糖，是利用裂解 酶控制革兰阴性菌感染必须要解决的问题。
24、使 用裂解酶治疗细菌感染时，酶的耐药性和机体对 酶的免疫应答反应也是目前面临的问题。 4 展 望 多重耐药细菌的出现和蔓延，正使人类面 临无抗生素可用的危险境地，迫切需要研究新 的抗菌制剂，噬菌体制剂对此提供了一种新的 思路。噬菌体治疗细菌感染特别是多重耐药菌 感染具有许多独特的优势，前景广阔。但噬菌 体及其制剂真正广泛地应用于临床还面临诸多 问题，如杀菌谱窄、全菌噬菌体的免疫原性、药 代动力学、给药途径与剂量等等。为了噬菌体 治疗细菌感染的安全性和有效性，我们需要对 噬菌体在体内的药代动力学做更多的研究； 可 以利用分子生物学技术在分子水平上改造噬菌 体，扩
25、大其杀菌谱，敲除其毒性基因和耐药基 因，使其应用更加广泛。在近年研究基础上，有 理由坚信，使用噬菌体及其裂解酶在抗感染治 疗方面将会取得更大的成功。 Ｒeferences： ［1］ BIＲENDＲA Ｒ，TIWAＲI K，SHUKHO K，et al． Antibacterial efficacy of lytic pseudomonas bacteriophage in normal and neutropenic mice models ［J］． Microbiology，2011，49（ 6） ： 994-999． ［2］ QIAN Zhen-wen，YUE Q
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