蜂毒肽的研究进展.doc

蜂毒肽的研究进展

我国天然蜂毒主要采自意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)，天然蜂毒是具有苦香气味的透明液体，在室温下很快就干燥至原来重量的30％～40％。蜂毒是一种成分十分复杂的混合物，经过各国学者几十年的研究，已知蜂毒含有多种生物活性物质，如蜂毒肽(melittin)、蜂毒明肽(apamin)、MCD肽(mast cell deganulating peptide) 等。蜂毒肽是蜂毒的主成分，其重量占蜂毒干物质45％～50％。蜂毒肽具有很高的生物学作用和药理作用，其半数致死量(LD50)为4.0mg/kg，现代药理研究表明蜂毒肽具有抗炎、镇痛、抑制血小板凝聚和抗肿瘤等作用。本文重点综述了蜂毒肽的抗肿瘤作用，抗菌作用和抗HIV病毒作用的新进展。
1 蜂毒肽的物理化学性质
    蜂毒肽由26个氨基酸组成，分子量为2480，其一级结构为H—Gly—lle—Gly—Ala—Val—Leu—Lys—Val—Leu—Thr—Thr—Gly—Leu-Pro—A1a-Leu—lle—Ser—Try—lle—Lys—Ary—Lys—Ary-Gln-NH2(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ—NH2。
    蜂毒肽是一种不对称的线性多肽，第一位至第20位的氨基酸是疏水基团，第21位至26位的氨基酸是亲水基团。蜂毒肽能降低水的表面张力，蜂毒肽的稀薄溶液作为单体存在，如在溶液中增加离子强度或蜂毒肽的浓度会产生不同程度的凝聚现象，直接生成疏水性四聚物。

    蜂毒肽的螺旋结构(二、三级结构)和聚合作用取决于溶液的PH值、离子强度和蜂毒肽本身的浓度。当浓度的PH值升高后，蜂毒肽能从大部分随机构象转变成。螺旋构象，o螺旋构象含量最高可达80％。当溶液PH处于个性状态时?蜂毒肽至少有三种构象存在。
    蜂毒肽的发现及纯化程度的进一步提高以及人工合成的成功，证明了一类新的有生物活性的肽类结构，为研究多肽与脂质胶粒或细胞膜之间相互作用提供了有效的方法；同时对蜂毒肽的多种生物活性和多种药理作用提供了相关机理的解释。
2 蜂毒肽的生物学活性和药理作用
蜂毒肽是迄今为止人类所致的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是化可的松的100倍，可以抑制20多种革兰氏阳性和阴性细菌的生长和繁殖，还能增强磺胺类和青霉素类药物的抗菌效，对多种真菌，病毒也有毒性。具体研究如下：
2.1 抗肿瘤作用
2.2.1 体外抑瘤作用
    分别选取SMMC—7721、BEI—7402和Hep—3B三种肿瘤细胞系，以四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察蜂毒肽对这三种肿瘤的细胞系的生长抑制作用，并以丝裂霉素、长春新碱、华赡素为对照，结果蜂毒肽的抑瘤作用与剂量呈正相关，抑制率也优于对照药物。得出结论是：蜂毒肽的体外抑瘤作用明显，而且作用发生迅速。

    张晨等闲研究了蜂毒肽对肝癌细胞系SMMC—7721增殖的影响，认为蜂毒肽可抑制肝癌细胞的生长、增殖，PCNAC增殖细胞核抗原阳性细胞表达率随着蜂毒肽剂量的增加而减低，对细胞周期的影响表现为S期细胞增加，G2/M期细胞减少，从而影响细胞周期的比率。肿瘤治疗的中心环节就是干扰肿瘤细胞周期，从而影响细胞的生长、增殖或诱导细胞凋亡的产生达到治疗肿瘤的目的。
     关于蜂毒肽抑瘤作用的量效关系，与蜂毒肽本身的理化性质和在高浓度溶液的自聚有关。在低浓度时，蜂毒肽以单体状态存在，不利于膜上离子通道的形成，虽能插膜，但对肿瘤细胞的破坏较弱；在高浓度时，蜂毒肽多形成四聚体状态，能比单体更有效地与细胞膜结合，形成离子通道，改变了膜的通透性，造成细胞膜的破裂，从而显示出显著的体外杀伤肿瘤的作用。
2.1.2 体内抑瘤作用
    蜂毒肽对多种肿瘤细胞有杀伤作用。文献报道1μmol/L蜂毒肽可阻止肿瘤细胞增殖而不抑制正常细胞的生长和克隆率。大剂量蜂毒肽在体外对多种肿瘤细胞有很强的杀伤作用，小剂量蜂毒肽具有诱导细胞凋亡的作用。蜂毒肽对小鼠皮下H22肝瘤细胞具有明显的抑制作用，同时明显延长了荷瘤小鼠的存活时间。

2.2 抗菌作用
    细菌对目前临床上使用的传统抗菌素有很强的耐药性，人们寻找新的抗菌素已十分紧迫。植物、动物和其他生物体内存在一些特殊的抗菌多肽，是一类既古老而仍很有效的广谱抗菌素，这类多肽含有较多的碱性氨基酸，又称阳离子抗菌肽。由于阳离子多肽与细菌细胞膜结合的特异性不高，细菌不易通过简单的变异或修饰多肽产生耐药性。因此，这类多肽作为抗耐药细菌的新一代抗菌素已引起人们的重视。由26个氨基酸组成的蜂毒肽和人工合成的类似物也是具有高抗菌活性和溶血活性的阳离子广谱抗菌肽。蜂毒肽能抑制2～30种革兰氏阳性和阴性病原微生物的生长繁殖，并能对抗耐药的金黄色葡萄球菌，还能增强磺胺类和青霉素类药物的抗菌能力。
2.3 抗爱滋病毒作用
    德国诺海贝格卫生和环境研究中心的病毒学家巴拉克·维尔纳，在对爱滋病毒的研究中发现，爱滋病毒的化学结构类似于蜂毒肽的结构，认为蜂毒肽通过破坏爱滋病毒促进剂的途径阻止病毒的扩散。该促进剂是沟通基因转录过程的一种物质，它根据基因信息合成活性蛋白质，当促进剂被破坏后，就无法合成携带病毒信息的蛋白质，病毒就无法繁殖扩散。研究证明，蜂毒肽可减少70％～80％的基因转录，使病毒减少99％。维尔纳认为，同其他抗爱滋病药比较，蜂毒肽的优势是直接从内部抑制病毒产生。因此被认为与其他药物结合，可望治愈爱滋病。但目前还存在不同见解，需要进一步研究。

3 蜂毒肽的基因工程
生物工程技术的发展为获得蜂毒肽提供了一条新的途径，Kindas等从处女蜂王的毒腺中提取得到了总mRNA，发现蜂毒肽mRNA含大约400个碱基对和1个短的poly A尾。Vlasak等用mRNA-DNA逆转录的方法，利用质粒pBR322构建了蜂王毒腺的cDNA文库，用蜂王毒腺总mRNA制作探针从此文库中分离得到了蜂毒肽的cDNA，再进一步将其克隆到质粒pUC18上进行DNA序列分析，由DNA的序列分析结果推测出的蜂毒肽序列与实际测得的完全相同。张青文从1991年开始提取了蜂王毒腺的RNA，用于棉铃虫卵中的转译，成功地合成了Promelittin，并对提取的mRNA成分进行了研究，结果发现总RNA在除去rRNA后就可得到高纯度的蜂毒肽mRNA。李继周等于1997年通过mRNA-cDNA反转录的方法合成了蜂毒肽基因，用lgtll 建立了蜂毒肽的cDNA文库，并用抗体探针筛选出了附性克隆。陈仲兵等进一步将蜂毒肽cDNA克隆到大肠杆菌质粒Pucl8上，并进行了序列分析。王关林等从蜜蜂毒腺中提取总RNA，通过RT-PCR方法扩增得到了蜂毒肽前体蛋白的cDNA，再进一步通过定点诱变在蜂毒肽序列前引入了经胺裂解位点，构建了与β-半乳糖昔酶部分序列相融合的蜂毒肽诱变蛋白表达载体，序列分析结果表明，成功地引入了目的密码子，且与

β-半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框，并在大肠杆菌中表达了诱变蛋白。王关林克隆了蜂毒肽前体蛋白的cDNA，并在大肠杆菌中表达了与β-半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽前体蛋白。王秋波等报道通过人工合成含特异性酶切位点的AB两条寡核苦酸片段，在Klenow 酶作用下形成目的基因，用限制型内切酶Hind Ⅲ，Xmn Ⅰ同时酶切目的基因和表达载体Pmalp2质粒，在T4连接酶的作用下构建两者的重组体，通过α-互补筛选出附性克隆，并通过特异性酶切和测序分析进行鉴定，获得重组蜂毒肽的原核表达克隆。
    蜂毒肽的溶血作用限制了它的临床应用。为克服其溶血毒副作用，人们尝试通过改变蜂毒素分子构像，将蜂毒素分子与肿瘤特异性抗体偶联成免疫毒素或制成缓释剂等方法来减轻其不良反应，增强抗肿瘤活性的目的。
    赵亚华等为获得保留有抗菌活性而降低溶血作用的蜂毒素，对蜂毒素的分子结构进行了改造。将第5位的Val变为Arg，第15位Ala变为Arg，删除了第16位的Leu。用PCR技术获得了改造后的蜂毒素基因，将其克隆人酵母表达载体pPICZa-A，获得重组表达质粒PPICZa-A-MEA。该质粒转化毕赤酵母菌GS115，甲醇诱导下表达，发酵上清液经抑菌活性、溶血活性测定及亲和层析纯化，结果表明，蜂毒素基因成功地在毕赤酵母中表达，经改造后表达的蜂毒素保留了抗菌活性且溶血活性显著降低，经纯化后用Bradford法测定表达蜂毒素的含量约为0.29 mg/mL。

    李柏、张晨等应用基因工程，构建携蜂毒素基因及甲胎蛋白(AFP)启动子(rAFP)的重组腺病毒载体，探讨rAFP驱动的蜂毒素基因在体外对肝癌细胞的特异性杀伤作用。结果发现：携蜂毒素基因重组腺病毒载体构建成功，MTr实验证明携蜂毒素基因重组腺病毒转染后，AFP附性肝癌细胞的增殖受到明显抑制，而对AFP阴性肝癌细胞及正常肝细胞无明显影响；无蜂毒素基因的重组腺病毒转染，则对各种细胞增殖均无抑制作用，他们等还发现蜂毒素基因重组腺病毒转染BEL-7402细胞后，肝癌细胞周期受到不同程度的影响，Go/G期细胞增多，细胞增殖核抗原(PCNA)标记指数较对照组明显下降，提示癌细胞较多被阻滞于G期，蜂毒素基因在癌细胞内的表达干扰了其细胞周期，抑制了癌细胞的增殖，而抑制PCNA的合成可能是其作用机制之一。细胞增殖与凋亡的失衡决定了肿瘤的生长速率。凋亡不仅直接影响着机体组织的正常发育、分化与死亡，它在肿瘤治疗中的作用已受到极大的重视。研究证明，蜂毒素具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。经携蜂毒素基因重组腺病毒转染后，倒置相差显微镜下观察到部分肝癌细胞出现凋亡形态学变化，体积变小、变圆，染色质边集等现象。携蜂毒素基因重组腺病毒可有效诱导肝癌细胞凋亡，凋亡率在20％左右，高于不舍蜂毒素基因重组腺病毒和未转染重组腺病毒对照组，提示诱导肿瘤细胞凋亡亦是蜂毒素基因治疗发挥作用的机制之一。

 4 蜂毒肽的分子生物学机制
    至今为止，对于蜂毒素的杀菌及溶血机理仍然很不确定，以往研究认为，抗细菌素类是通过穿孔模型形成膜空洞机制引起杀菌的。但深入研究发现，有些抗细菌素与细胞膜的作用方式与穿孔模型有明显不同，后来便提出了一种新的作用模式--地毯模式。
    目前，抗细菌素侵膜机理占主导地位的观点仍然是穿孔模型和地毯模式机理。根据蜂毒素的这种侵膜机制，赵亚华等通过实验有目的地改造了蜂毒素的氨基酸的一级结构序列以及所要表达的蜂毒素基因。尽量使蜂毒素在与细菌细脑膜相互作用时，主要采取地毯模式侵膜而引起杀菌，同时，由于带电荷数与分子构象的改变，大大降低了它与血细胞膜两亲性作用的几率，从而达到抑制溶血性的目的。改造后的蜂毒素的溶血性与标准样品的溶血活性相比，有较大幅度降低，大约降低了14.3倍。
    蜂毒肽发挥其众多功能的主要机理是因为蜂毒肽可以使细脑膜的透性增加，细胞内容物泄露，细胞裂解所以蜂毒肽与天然或是模型膜的作用成为蜂毒肽研究的热点。Benachir等利用钙黄绿素作为荧光标记物，系统研究了蜂毒肽诱导的膜渗漏。他们认为蜂毒肽与囊泡的结合会非常迅速，因为在蜂毒肽作用几分钟之后，内容物的流出达到最大值，并且停止；而且蜂毒肽诱导的磷脂双分子层的裂解的发生机制是“全或无”，也就是说蜂毒肽作用下，有的囊泡的内容物全部释放，而有的则保持完整，没有渗漏，这与Schwarz 等观察的一致。内容物释放的比例与蜂毒肽/脂质的摩尔比率有关，只有达到一定量的蜂毒肽才可能有内容物渗出。更为特别的是蜂毒肽可以区别出完整的和已经有物质渗出的囊泡，说明这两类脂质双分子层的性质有很大的不同。最近有很多报道认为，微粒表面的负电荷可以抑制蜂毒肽对细胞的裂解作用，Benachir等的工作表明卵磷脂双分子层表面负电荷的存在对蜂毒肽的裂解能力有抑制作用，并且与负电荷的密度成一定比例。这可能是由于静电作用吸附蜂毒肽，而不能更加深入破坏囊泡而形成渗漏。

    蜂毒肽可以作用多种酶及细胞蛋白，在裂解的细胞中蜂毒肽能结合或改变几种蛋白质功能。如蜂毒肽可以抑制蛋白激酶C；与钙调蛋白(calmodulin)具有高度亲极性。Fukushi-ma实验中观察到蜂毒肽抑制小鼠大脑皮质的突触膜上依赖鸟苷酸的腺苷酸环化酶活性；还发现蜂毒肽能明显刺激Gil和Gll活性，但却抑制Gs活性。动力学研究表明蜂毒肽抑制Gs活性是因为抑制GDP的释放，从而增加了鸟苷酸造成的。而激活Gi与抑制Gs很可能与抑制腺苷酸环化酶的活性有关。细胞脂酶的活性产物包括三磷酸肌醇(IP3)、甘油二酯(DG)和脂肪酸(FA)等是细胞生理活动重要的第二信使系统，而有实验表明蜂毒肽可以激活细胞脂酶，包括磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、磷脂酶Az(PLAJ及甘油三酯酶等。磷脂和甘油三酯是细胞内主要的酰化酯(包含脂肪酸)。而甘油三酯的相对含量可占细胞总脂量的5％～60％。

   5 总结
    蜂毒肽由于其具有抗炎、杀菌、抗肿瘤等作用，已在医疗上得到广泛应用，但由于其来源有限，成本过高，且有直接溶血作用，应用受到严重制约。目前还尚未有完善的方法技术来大量生产蜂毒肽。从理论上讲，由于蜂毒肽对生物膜的破坏作用，克隆得到的蜂毒肽cDNA如果直接在原核或真核表达系统中表达对细胞具有致死性，因而现在很多学者都试图通过利用基因工程来改造蜂毒肽的分子结构或构象，或是将其融合到其他细胞基因中，或者表达其前体蛋白，然后经过适当修饰处理获得对正常细胞毒性较小的蜂毒肽。近年来，通过基因工程获得蜂毒肽的方法已经取得一定进展，但仍有许多不足之处，距离大规模生产还有很长的一段路。如何进一步提高基因表达水平，提高基因表达产物的稳定性等，是今后值得深入研究的问题。
参考文献：

［1］ 王金庸，《中医蜂疗学》，沈阳出版社，1997
［2］ 房柱，《百病蜂针疗法》，山西科学技术出版社，1996
［3］ 陈伟《蜂刺疗法》，中南工业大学出版社，1990
［4］ 房柱《中国蜂针疗法》，人民卫生出版社，1993

［5］ 张青文，蜂毒肽的mRNA在棉铃虫卵中的转译［A］.博士后论文集（4），北京大学出版社，1991
［6］ 王关林，李大力，蜂毒肽溶血肽基因的定点诱变及其在大肠杆菌中的表达［J］,遗传学报，2000
［7］ 凌昌全，黄雪强等，蜂毒素缓冲剂瘤内注射毒增效作用的试验研究［J］，第二军医大学学报，2001
［8］ 赵亚华，董竞南，蜂毒素分子的改造及其基因在毕赤酵母中的表达［J］，中国生物工程杂志，2005
［9］ 李柏，凌昌全等，蜂毒素基因重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的作用［J］，中国肝脏病杂志，2004
［10］ GERIGJ T.Structure and Salvution of melittin in 1,1 1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol/water［J］.BioPhy(s).2004
［11］ SARERVAL G NAGARAJ R Cell-lytic and antibacterial Peptides.that act by pexturbing the barrier function of numberanes :faces of their conformational feature-function correlation and numberanes – pexturbing abilities ,1994
［12］ 赵亚华.白云.崔红.廖富(蘋).高向阳 蜂毒素基因的突变与表达及其构效关系研究 [期刊论文] -生命科学研究2006(04)

［13］ 杨志林.柯以铨.徐如祥.彭萍 蜂毒肽对人神经胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用 [期刊论文] -南方医科大学学报2007(11)
［14］ 赵亚华.张微.李日清.钟杨生.郑慧平.林健荣 蜂毒溶血肽对鸡红细胞及膜的生化作用 [期刊论文] -昆虫学报2008(06)
［15］ 郑旭.鲁晓晴.宋卫青.赵巍.闫志勇.钱冬萌.丁守怡.宋旭霞.徐莉莉.李鹏.王斌 蜂毒肽/变构hIL-2融合蛋白的原核表达及其对宿主菌生长的影响 [期刊论文] -中国生物制品学杂志2009(4)
［16］ 李晶华 ，王宗仁 ，邵中军 ，蜂毒肽抗风湿作用及对大鼠脊髓后角Fos表达的影响 神经解剖学杂志   2007 年23卷2期
［17］ 蜂毒肽片段的合成及其在治疗类风湿关节炎中的作用 生物医学工程学杂志,2005年第5期
［18］ 董军奎.鲁晓晴.刘明军.钱冬萌.宋旭霞.闫志勇.丁守怡.王斌 蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白对人卵巢癌细胞SKOV3的抑制作用及对NK细胞的杀伤活性的影响 [期刊论文] -世界肿瘤杂志2008(01)