分子生物学复制省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

基因信息传递地球生命传奇第1页生命简史生命简史u The Big Bang 150200亿年u Milky Way galaxy 136亿年 u solar system 46亿年第2页第3页第4页The Life Story 40亿年u 古细菌、真细菌、真核原生生物第5页The Life Story 40亿年u寒武纪生命大爆炸寒武纪生命大爆炸 5 56 6亿年亿年 多细胞生物多细胞生物u植物登陆植物登陆 4 4亿年亿年u动物登陆动物登陆 3.6 3.6亿年亿年u哺乳动物诞生哺乳动物诞生 2.3 2.3亿年亿年u灵长类动物诞生灵长类动物诞生 5500 5500万万 8000 8000万万 年年u人类直系祖先诞生人类直系祖先诞生 700 700万万 500 500 万万u当代人诞生当代人诞生 5 51010万年万年u人类文明史人类文明史 1 1万年万年第6页科学家复原“杜马伊”形象第7页学科简史u 1859 1859 年年 Charles Robert Darwin Charles Robert Darwin 第8页u 1865 1865年年 Mendels Pea Mendels Peau 1941 1941年年 One Gene,One Enzyme One Gene,One Enzymeu 1953 1953年年 DNA double helix DNA double helixu 1966 1966年年 Genetic Code Cracked Genetic Code Cracked u 1972 1972年年 First recombinant DNA First recombinant DNAu 1982 1982年年 First transgenic mice First transgenic miceu 人类基因组测序基本完成人类基因组测序基本完成 第9页分子生物学发展阶段u 准备和酝酿阶段准备和酝酿阶段 蛋白质是生命主要基础物质蛋白质是生命主要基础物质 生物遗传物质基础是生物遗传物质基础是DNA DNA u当代分子生物学建立和发展阶段当代分子生物学建立和发展阶段遗传信息传递遗传信息传递中心法则建立中心法则建立第10页分子生物学发展阶段u初步认识生命本质及改造生命深入发展阶段初步认识生命本质及改造生命深入发展阶段重组重组DNADNA技术建立和发展技术建立和发展 基因组研究发展基因组研究发展 单克隆抗体及基因工程抗体建立和发展单克隆抗体及基因工程抗体建立和发展 基因表示调控机理基因表示调控机理 细胞信号转导机理研究成为新前沿领域细胞信号转导机理研究成为新前沿领域第11页第12页第13页第14页第15页第十章第十章 DNA DNA生物合成生物合成 Biosynthesis of DNABiosynthesis of DNA复制过程复制过程起始、延伸、终止起始、延伸、终止损伤修复损伤修复光、切除、重组、光、切除、重组、SOS修复修复复制条件复制条件其它蛋白其它蛋白酶酶聚合酶聚合酶引物酶引物酶引发体引发体连接酶连接酶复制特点复制特点半保留复制半保留复制半不连续合成半不连续合成冈崎片断冈崎片断第16页u复制复制DNADNA遗传信息遗传信息 亲代亲代子代；子代；u转录和翻译转录和翻译基因表示基因表示基本三类基本三类RNARNA制造蛋白质，决定生物表现型制造蛋白质，决定生物表现型中心法则中心法则the central dogma第17页中心法则补充中心法则补充uRNA病毒复制RNA遗传信息 亲代子代逆转录RNA DNA第18页DNA dependent DNA polymerase DDDPDNA dependent RNA polymerase DDRPRNA dependent RNA polymerase RDRPRNA dependent DNA polymerase RDDP第19页第一节第一节 复制基本规律复制基本规律 复制特点复制特点 一、半保留复制 semiconservative replication u亲代DNA链为模板，合成子代DNA链u子代DNA双链中含一条亲代DNA链 第20页DNA复制机制三种假说第21页使子代使子代DNA与亲代与亲代DNA不一不一样样第22页u1958年 M.Messelson 和 F.Stahl u15N培养基14N培养基 u提取DNA，作密度梯度离心 复制基本方式证实第23页第24页说明半保留复制意义u 从标准上确保了遗传相对保守性从标准上确保了遗传相对保守性u 奠定了奠定了DNADNA是遗传物质地位是遗传物质地位第25页二、复制起始点 originuDNA复制从特定位点起始（复制子）富含ATu原核生物 一个u真核生物 多个 第26页三、双向复制三、双向复制bidirectional replicationbidirectional replicationu复制起始点为中心，向两个方向同时进行复制u微生物中，也可进行单向复制如滚环复制第27页第28页第29页四、需要引物 primer u DNA Polymerase不能从头开始只能延伸已经有核酸链u 引物酶 Primase合成一小段RNA链(引物)提供3端自由羟基（3-OH）u 引物大小原核生物:50100个核苷酸真核生物：约为10个核苷酸 第30页第31页五、半不连续复制uDNA聚合酶合成方向 5 3 uDNA双链逆向平行uDNA解链和复制同时进行第32页55端端3端端CGA第33页5 5 33u ATATu TTTTTATATu ATATTTTTT第34页第35页第36页u领头链(leading strand)连续u随从链(lagging strand)不连续冈崎片断(Okazaki fragment)原核生物 1K2K真核生物 100 第37页第38页第39页第二节第二节 酶学和拓扑学改变酶学和拓扑学改变 DNADNA复制条件复制条件 u 底物&模板u 解旋解链u DNA聚合酶u DNA连接酶第40页底物底物 substrate substrate 模板模板templatetemplateudATP，dGTP，dCTP，dTTPuDNA复制是模板依赖性(dNMP)n+1+PPi(dNMP)n+dNTPDNA第41页解链及拓扑学改变解链及拓扑学改变第42页u解螺旋酶（unwinding enzyme）解链酶 或 rep蛋白解开DNA双链2ATP/bp base pair 解螺旋酶解螺旋酶第43页第44页引发体和引发体和RNARNA引物引物u引发体:引发前体+引物酶u引发前体:由若干蛋白因子聚合而成DnaA蛋白识别复制起始点，并含有ATPase活性。u引物酶 特殊DDRP第45页单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白u单链DNA结合蛋白（single strand binding protein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）稳定ssDNA，便于复制 保护ssDNA，免受核酸酶降解第46页第47页拓扑异构拓扑异构酶酶(topoisomerase)(topoisomerase)u拓扑异构酶切断DNA双链中一条链松开双螺旋后再将DNA链连接起来防止出现链缠绕。u拓扑异构酶可切断DNA双链使DNA超螺旋松解后，再将其连接起来。第48页解链过程中正超螺旋形成解链过程中正超螺旋形成第49页第50页第51页第52页第53页DNADNA聚合聚合酶酶(DDDP)（一）种类和生理功效：u原核生物 DNA聚合酶（pol）1958年 A.KornbergDNA聚合酶（pol）DNA聚合酶（pol）主力第54页upol 由十种亚基组成全酶关键部分（关键酶）、和三种亚基组成亚基 5 3聚合活性亚基 3 5外切活性 确保DNA复制准确性/保真性upol 无 5 3外切活性第55页外切酶活性方向uATTAGCACC AMP+TTAGCACC CMP+ATTAGCAC第56页第57页 亚基与模板结合亚基与模板结合第58页 亚基形成一个围绕亚基形成一个围绕DNA环状钳环状钳第59页upol 单一肽链可被一些蛋白酶水解为两个片段大片段称为Klenow fragment惯用工具酶第60页323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是试验室合成片段是试验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中惯用工具酶。分子生物学研究中惯用工具酶。第61页 原核生物中三种DNA聚合酶第62页u真核生物 五种pol、pol、pol、pol、polpol 含有引物酶活性pol 主力Pol 参加线粒体DNA复制Pol 损伤修复、校读和填补缺口pol 低保真参加应急修复 第63页碱基配对碱基配对碱基选择碱基选择及时校读及时校读DNA复制保真性复制保真性第67页DNADNA连接酶连接酶uDNA连接酶(DNA ligase)催化DNA片段之间磷酸二酯键形成第68页uDNA连接酶催化条件是：3-OH，5-P未封闭缺口位于双链DNA中（局部）消耗能量原核生物中由NAD+供能真核生物中由ATP供能。第69页HO5335DNA连接酶连接酶ATPADP5353第70页DNA连接酶在复制中起接合缺口作用连接酶在复制中起接合缺口作用在在DNA修复、重组及剪接中起一样作用修复、重组及剪接中起一样作用基因工程主要工具酶基因工程主要工具酶DNA聚合酶、DNA连接酶、拓扑酶都形成磷酸二酯键区分？第71页小结u 基本特征基本特征 origin semiconservative semi-discontinuous Primeru 主要酶 Dna B，ssb，topo Primase DNA Polymerase DNA ligase第72页一、复制起始u预引发：DnaA+DnaB+DnaC+SSB解旋解链，形成复制叉：组装引发体：u引发引物酶合成引物DnaG拓扑酶解旋第三节第三节 DNA DNA生物合成过程生物合成过程 第73页oriC结构特征u 含三组串连重复序列富含ATu 2对反向重复序列两个相同次序互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成 复制起始识别区 第74页第75页第76页第77页第78页二、复制延长二、复制延长（一）聚合子代DNA：uDNA聚合酶沿模板链35方向滑动，在53方向聚合子代DNA链第80页（二）引发体移动：u引发体向前移动，解开新局部双螺旋，形成新复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链延长。第81页第82页第83页三、复制终止三、复制终止（一）去除引物，填补缺口：uDNA聚合酶 53 外切酶活性 53 聚合酶活性 第85页第86页（二）连接冈崎片段：u在DNA连接酶催化下，形成最终一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整DNA长链。第87页第88页（三）真核生物端粒形成：u端粒（telomere）真核生物染色体末端结构通常膨大成粒状富含G、T短重复序列组成末端因为引物RNA水解而可能缩短第90页第91页u端粒酶端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端 粒 酶 协 同 蛋 白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)第92页端粒端粒酶酶(telomerase)(telomerase)作用机制作用机制第93页第四节第四节 逆转录和其它复制方式逆转录和其它复制方式自学自学u 逆转录病毒逆转录病毒 逆转录酶逆转录酶u cDNA cDNA文库文库u 其它复制方式其它复制方式 滚环复制滚环复制 噬菌体噬菌体DNADNA D D环复制环复制 线粒体线粒体DNADNA第94页第五节第五节 DNA DNA损伤与修复损伤与修复u DNA损伤突变 mutation 突变意义 突变类型 突变效应u 损伤修复 直接修复 取代修复包括DNA合成第95页第五节第五节 DNA DNA损伤与修复损伤与修复 uDNA一级结构任何改变称为突变 mutationu常见形式碱基脱落碱基修饰/去修饰交联链断裂重组 第96页一、突变意义一、突变意义u 突变是演化分子基础 横向 自然界生命多样性 纵向 生命复杂性u 突变是一些疾病发病基础第97页二、引发突变原因二、引发突变原因自发原因：u 自发脱碱基：糖苷键自发断裂，引发碱基脱落u 自发脱氨基C-UA-Hu 复制错配 第98页第99页 物理原因：u紫外线、电离辐射、X射线X射线和电离辐射常引发DNA链断裂紫外线常引发嘧啶二聚体形成 TT，TC，CC等二聚体 引发复制障碍。第100页化学原因化学原因u脱氨剂：亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C生成U，A生成Hu烷基化剂uDNA加合剂苯并芘u碱基类似物u断链剂过氧化物，巯基化合物第101页三、三、DNADNA突变类型突变类型u点突变转换 同类型碱基取代颠换 不一样类型碱基取代 镰形红细胞贫血链第6位氨基酸突变 CTC -CAC 插入 增加一碱基对 缺失 降低一碱基对第102页碱基转换碱基转换第103页三、三、DNADNA突变类型突变类型u复突变插入 增加一段次序缺失 降低一段次序倒位 一段碱基次序发生颠倒移位 一段碱基次序位置发生改变重排 一段碱基次序与另一段碱基次序发生交换第104页DNADNA突变效应突变效应u同义突变 有时引发翻译效率下降u误义突变 氨基酸次序改变u无义突变 多肽链提前终止u移码突变(框移突变)第105页四、四、DNADNA损伤修复损伤修复 uDNA损伤修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。第106页（一）直接修复：1光复活：（light repairing）：u修复嘧啶二聚体损伤u修复过程光复活酶（photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物300600nm可见光取得能量将嘧啶二聚体丁酰环打开光复活酶从DNA上解离。第107页 2转甲基作用u转甲基酶u去除修饰甲基 3直接连接uDNA连接酶 第108页（二）取代修复：1切除修复(excision repairing)：u广泛存在修复机制，可适合用于各种DNA损伤修复u核酸内切酶；DNA糖苷酶。第109页切除修复过程切除修复过程u DNA DNA糖苷酶切除碱基形成AP位点 无碱基片断u 核酸内切酶u Polu DNA连接酶第110页第111页着色性干皮病着色性干皮病(xeroderma pigmentosisxeroderma pigmentosis，XPXP)u 切除修复缺点性遗传病u 不能修复紫外线照射引发DNA损伤，易发生皮肤癌。第112页 2重组修复(recombination repairing)：u这是DNA复制过程中所采取一个有差错倾向修复方式。u重组蛋白RecA、B、C 等催化等催化第113页 3SOS修复：uDNA复制过程中出现u DNA分子受到长片段高密度损伤u特异性较低DNA聚合酶u重组酶等 第114页小结u DNA DNA复制复制 特点特点 origin origin 条件条件 primer primer 方向方向 过程过程 真核生物端粒真核生物端粒第115页