神经生物学实验.doc

实验一 反射时的测定及反射弧的分析
[目的]
1．学习测定反射时的方法。
2．了解反射弧的组成。通过实验证明任何一个反射，只有当实现该反射的反射弧存在，并保证其完整的情况下才能出现。
[原理]
机体在中枢神经系统参与之下，对刺激所发生的反应叫做反射；反射弧是反射的解剖学基础(反射弧一般包括感受器、传入神经、中枢、传出神经、效应器等五个部分)。要引起反射，首要条件是反射弧必须完整。反射弧的任何一部分受到破坏，反射即不出现。
[实验动物]
蛙或蟾蜍
[器材及药品]
蛙类常用手术器械、支柱台、蛙嘴夹、蛙板、蛙腿夹、小烧杯、大烧杯、培养皿玻璃 (2个)、小滤纸片、棉花、秒表、纱布、0.5％及1％硫酸溶液、水。
[方法与步骤]
一、脊蟾蜍的反射
1．制备脊蛙（或脊蟾蜍）：利用毁髓针从枕骨大孔处捣毁脑，保留脊髓制备脊蛙，用蛙嘴夹夹住蛙的下颌，挂在支柱台上
2. 屈曲反射
正常反射活动的观察及反射时的测定：用培养皿盛0. 5％硫酸溶液，将蛙右后肢的最长趾浸入0.5%硫酸溶液中2～3mm ( 浸入时间最长不超过10s )，立即记下时间（以秒计算）。当出现屈腿反射时，则停止计时，此为屈腿反射时（即从浸入时起至后肢发生屈曲时所需要的时间）。立即用清水冲洗受刺激的皮肤，并用纱布擦干。重复三次，求出平均值作为右后肢最长趾的反射时。用同样方法测定左后肢最长趾的反射时。
3. 搔扒反射
用浸有1%硫酸的滤纸片刺激脊蟾蜍一侧胸腹部或背部皮肤，引起同侧或双侧后肢运动，扒掉滤纸片。二、反射弧
1、反射弧模式图

2、屈曲反射的反射弧
最长趾感受器→传入神经纤维→脊髓→传出神经纤维→下肢屈肌
3、搔扒反射的反射弧
腹部感受器→传入神经纤维→脊髓→传出神经纤维→下肢肌
三、反射弧完整才能发生反射
1、破坏感受器
手术剪自右后肢最长趾基部环切皮肤，然后再用手术镊剥净长趾上的皮肤。用硫酸刺激去皮的长趾，记录结果。
2、麻醉传入和传出神经纤维
沿右后肢的股二头肌沟剪开皮肤，分离出坐骨神经。在神经下穿细棉线后，在细棉条上滴几滴2％普鲁卡因溶液，每隔2min重复刺激 (记录加药时间)。当屈反射刚刚不能出现时(记录时间)，大约五分钟后，用浸有1%硫酸的滤纸片刺激脊蟾蜍一侧胸腹部皮肤，观察搔扒反射。然后15分钟后，再用滤纸片刺激胸腹部皮肤，观察搔扒反射。
3、破坏效应器
将蟾蜍一侧皮肤从根部环切，剥离后浸入含20%的甘油任氏液中，大约经过三十分钟后，该侧肢体不能发生搔扒反射
4. 破坏脊髓中枢
用细探针插入髓管内，上下抽动破坏中枢——脊髓，蛙四肢松弛。重复实验，记录结果。
四、小结
1、反射是机体通过神经系统对内外环境的刺激所发生的反应
2、反射弧是反射的结构基础，由感受器、传入神经纤维传出神经纤维、效应器组成。
3、反射的完成依赖反射弧的完整性。
[讨论]
1. 说明屈腿反射的具体过程。
2. 以实验结果为根据，以严密的逻辑推理方式说明反射弧的几个组成部分。
[注意事项]
1、 每次实验时，要使皮肤接触硫酸面积不变，以保持相同的刺激强度
刺激后要立即洗去硫酸，以免损伤皮肤。

实验二 坐骨神经腓肠肌标本制备
【实验原理与目的】
蛙类的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体组织所需的生活条件比较简单，易于控制和掌握。因此在实验中常用蟾蜍或蛙的坐骨神经腓肠肌标本来观察兴奋和兴奋性、刺激与肌肉收缩等基本生理现象和过程。所制备坐骨神经腓肠肌标本是生理学实验中必须掌握的一项基本技能。

本实验目的在于学习破坏蛙类脑脊髓法，掌握坐骨神经腓肠肌标本的制备技术、并获得兴奋性良好的标本，为以后有关实验打下基础。
【实验对象】
蛙或蟾蜍。
【实验器材和药品】
 1．器械 蛙类动物手术器械一套，包括普通剪刀、小手术剪刀、镊子、探针、锌铜弓、玻璃分针、蛙板、玻璃板、固定针等。
2．药品 任氏液。
3．其它 瓷盘、培养皿、小烧杯、棉花、棉线、纱布、滴管等。
【实验步骤和观察指标】
1.破坏脑和脊髓 取蟾蜍一只，用布包裹蟾蜍四肢躯干露出头部，用左手握住蟾蜍，并用食指按压头部前端，拇指按压背部，使头部前俯；右手持金属探针由头前端沿中线向尾方划触、触及凹陷处即枕骨大孔的所在。将探针由凹陷处垂直刺入，刺破皮肤即入枕骨大孔，这时将探针尖端转向头方，向前探入颅腔内，然后向各方搅动探针，以捣毁脑组织。如探针确在颅腔内，术者可感觉出针在四面皆壁的腔内。脑组织捣毁后，将探针退出；再由枕骨大孔刺入，并转向尾方，与脊髓平行刺入脊管，以破坏脊髓。脑和脊髓是否完全破坏，可检查动物四肢肌肉的紧张性是否完全消失。拔出探针后，同一干棉球压迫针孔，以止其出血（见图3-1-1-1）。另一方法是去脑后再捣毁脊髓。
2.剪除躯干上部及内脏 在骶髂关节水平以上0.5~1cm处剪断脊柱。左手握止蟾蜍后肢、用拇指压止骶骨，使蟾蜍头与内脏自然下垂，右手持粗剪刀（非手术剪），沿脊柱两侧剪除一切内脏及头胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及紧贴于脊柱两侧的坐骨神经。剪除过程中注意勿损伤坐骨神经。
3.剥皮 左手握紧脊柱断端（注意不要握住或压迫神经），右手捏住其上的皮肤边缘、用力向下剥掉全部后肢的皮肤（见图3-1-1-2 ）。把标本放在盛有任氏液的培养皿中。将手及用过的剪刀、镊子等全部手术器械洗净，再继续下面步骤。4.分离两腿 用镊子夹住脊柱标本提起，背面朝上，剪去向上突起的尾骨（注意勿损伤坐骨神经）。然后沿正中线用剪刀将脊柱和耻骨联合中央辟开两侧大腿，并完全分离。将两条腿浸入盛有任氏液的培养皿中。
5.制作坐骨神经腓肠肌标本
（1）分离坐骨神经 取一条腿放置在蛙板上的玻璃片上，用一固定针将粗制标本的脊柱固定在蛙板上（腹面朝上），将下肢拉直并向外旋转趾蹼朝上，用固定针在跖? 骨部固定在蛙板上，用玻璃分针沿脊柱旁游离坐骨神经至尾骨处、再循坐骨神经沟（股二头肌和半膜肌之间的裂逢处），找出坐骨神经的大腿段，用玻璃分针仔细剥离，剪断坐骨神经的所有分支，并将神经分离直至膝关节处。

（2）分离腓肠肌 用玻璃分针或镊子将腓肠肌跟腱分离，并穿线结扎。在结扎远端用粗剪刀剪断跟腱，左手执线提起腓肠肌，以手术剪刀剪去其周围联系的组织，但保留腓肠肌起始点与骨的联系，唯须注意勿损伤支配该肌的神经分支。
（3）游离坐骨神经腓肠肌标本 将该后肢股部所有肌肉从膝关节起沿股骨剥离并剪去，以粗剪刀在股骨上中1/3处剪断股骨，剪下一小段与神经相连的脊柱（约1~2个脊椎骨）在膝关节下将小腿剪掉，留下的即为坐骨神经腓肠肌标本。（4）检查标本的兴奋性 用经任氏溶液润湿的锌铜弓轻轻接触一下坐骨神经，如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，则表明标本的兴奋性良好，即可将标本放在盛有任氏液的培养皿中，以备实验用。若无锌铜弓，亦可用中等强度单个电刺激作上述试验。
【注意事项】
1.沿脊柱中央把下半身剪为左右两大半时，要正中，否则会损伤坐骨神经。
     2.神经分离需用玻璃分针，分离过程中操作必须精细，避免用金属器械碰夹神经，以免损伤。同时要注意持针分离方向应由中心向外周，以免将神经上段撕伤。坐骨神经
周围的组织和神经的小分枝，可用分针纯性分离或用剪刀逐步剪掉。
3.所用的器械要洁净，接触蛙皮肤，特别是蟾蜍皮肤的用具必须洗净后使用。
4.应经常用任氏液湿润标本，防止干燥。
【思考题】
1.你制备的坐骨神经腓肠肌标本的兴奋性如何？
2.根据个人体会，总结制备新鲜完整的坐骨神经标本过程中的注意事项和体会
实验三 刺激强度与骨骼肌收缩反应的关系
[学习目的]：
1、学习肌肉实验的电刺激方法及肌肉收缩的记录方法。
2、观察刺激强度与肌肉收缩反应的关系。
[基本原理]：
腓肠肌由许多肌纤维组成，刺激腓肠肌时，不同刺激强度会引起肌肉的不同反应。当刺激强度过小时，不引起肌肉发生收缩反应，此时的刺激为阈下刺激。当全部肌纤维同时收缩时，则出现最大的收缩反应。这时，即使在增大刺激强度，肌肉收缩的力量也不再随之加大。可以引起肌肉发生最大收缩反应的最小刺激强度为最适刺激强度。

[动物与器械]
蟾蜍（或蛙）的腓肠肌标本、常用手术器械、BL—420E 、张力传感器、刺激电极、支架、双凹夹、肌槽、不锈钢盘、滴管、任氏液、棉线。
[方法与步骤]
1、破坏脑脊髓：
（1）取蟾蜍一只，用自来水冲洗干净。左手握住蟾蜍，用食指按其头部使之略向前屈，拇指按住其背部，其余三指则握住蟾蜍的四肢和腹部（2）用右手持金属探针，在头颅后缘，自枕骨大孔与脊椎管之间刺入椎管，先左右摆动，
离断脊髓；再向前插入颅腔，向左右摆动数次，捣毁全部脑组织，如探针确已插入颅腔，则向各方向摆动时，即有触及颅骨的感觉。
（3）将探针撤回至枕骨大孔，但不拔出皮肤，直接向后插入脊椎管，直达骶部，轻轻转动探针，以破坏脊髓。如探针确已在脊椎管中，则不能左右摆动，探针不得穿透脊椎管，以免损伤内脏。最后拔出探针，用小棉球堵塞创口以止血。
脑脊髓破坏完全后，蟾蜍将失去一切反射活动，全身肌肉软瘫。如动物仍有反射动作，表示破坏不彻底，必须重新破坏。
2、去皮和制作下肢标本：（1）左手握住蟾蜍的脊柱，用粗剪刀在前肢腋窝处，将脊柱横断，并沿脊柱两侧避开坐骨神经剪开腹壁，此时头、躯干上部及内脏全部下垂，剪除头、全部躯干及内脏组织，剪去肛周皮肤，留下脊柱和后肢（2）用圆头镊子夹住脊柱边缘，注意不要碰到坐骨神经，捏住皮肤边缘，逐步向下牵拉剥离皮肤。将全部皮肤剥除后，标本放于盛有任氏液的小烧杯中。随即洗净蛙板、剪刀和双手上的污物及毒汁。
（3）用粗剪刀沿脊柱和骨盆的中线，将标本纵剖为两半，注意勿损伤坐骨神经。一半置于蛙板上，以制备标本；另一半置于盛有任氏液的玻璃平皿中备用。
3、制备神经－腓肠肌标本：
（1）把下肢的背面朝上，辨认蟾蜍大腿的三头肌、二头肌和半膜肌，以及小腿的腓肠肌。
（2）用玻璃钩针和镊子仔细把二头肌和半膜肌分开，便可看到一条粗大的神经，此即坐骨神经。用玻璃钩针把神经挑起，剪去通往大腿肌肉的神经分支，顺着神经走行方向，转向腹腔面沿脊柱逐渐把神经主干全部分出，直到所连的椎骨为止。用粗剪刀剪除多余的肌肉和脊椎骨，仅留下与坐骨神经相连的一小块脊椎骨，用镊子夹住这块脊椎骨，轻轻提起坐骨神经，用手术剪剪去残余的分支，并将坐骨神经一直分离到膝关节附近。
（3）分离腓肠肌的跟腱，用线结扎跟腱，在结扎处以下将跟腱剪断。持线提起腓肠肌，用粗剪刀剪去小腿骨和其上的肌肉，再将大腿肌肉剪去，只留长约1～2cm的股骨，并将其上肌肉刮干净，以便在肌动器上固定此标本

。4、检验标本：用锌铜弓的两端轻轻接触神经，若肌肉产生收缩，则表示此标本的机能状态良好。
5、实验仪器用品的准备。
打开计算机采集系统，连接张力传感器与刺激输出。将标本的骨头固定在肌槽的骨头固定孔内，腓肠肌肌腱上的扎线与张力传感器应变梁相连，双针形刺激电极密切接触近膝关节处的腓肠肌，电极接头与刺激输出线相通，调节好扎线的张力，不可过松或过紧，以使肌肉自然拉平为宜（保证肌肉一旦收缩，即可牵动张力传感器的应变梁）。
6、计算机采集系统的准备
开通与张力传感器相连的通道，选择张力信号输入，然后启动波形显示图标，此时显示通道中出现扫描线。调节刺激装置的设置，将延时、波宽及刺激强度调至最小，选择单刺激方式刺激。启动刺激图标，调节扫描基线接近刺激标记先后即可进行实验。
7、实验观察
（1） 启动刺激图标，观察肌肉收缩反应。如果肌肉无收缩反应，则适当增加刺激强度，其他刺激参数保持不变。间隔少许时间，同法进行第二次刺激，直到出现肌肉的最小收缩。测量收缩幅度并记下刺激强度，此时的刺激强度为阈强度。
（2） 同法逐渐增加刺激强度，观察刺激强度与肌肉收缩反应的关系。
（3） 当刺激强度达到某一数值后，肌肉收缩幅度不再随刺激强度的增加而升高。记录3—4次同等高度的收缩曲线和刺激强度。
实验四 神经干复合动作电位的记录观察

【目的要求】
1.学习电生理实验方法。
2.观察蛙坐骨神经干复合动作电位的波形，并了解其产生的基本原理。
3、学习测定不应期的方法，及学习测定神经冲动传导速度的方法。
【基本原理】
神经干在受到有效刺激后，可以产生动作电位，标志着神经发生兴奋。如果在神经干另一端引导传来的兴奋冲动，可以引导出双相的动作电位，如果在两个引导电极之间将神经麻醉或损坏，则引导出的动作电位即为单相动作电位。神经细胞的动作电位是以“全或无"方式产生的。坐骨神经干是以由很多不同类型的神经纤维组成的，所以，神经干的动作电位是复合动作电位。复合动作电位的幅值在一定刺激强度下是随刺激强度的变化而变化的。
神经在一次兴奋的过程中，其兴奋性也发生一个周期性的变化，而后才恢复正常。兴奋性的周期变化，依次包括绝对不应期、相对不应期、超常期和低常期4个时期。根据两次刺激间隔的设置，可以观察出兴奋的周期。神经干受到有效刺激发生兴奋后，产生的动作电位将以一定的速度沿神经传导。测定神经纤维兴奋的传导速度v时，在远离刺激点的不同距离处分别用两组引导电极引导动作电位，测出两引导点之间的距离m和分别引导出的动作电位的时相差s，根据v = m / s即可计算出其传导速度。

【动物与器材】
蟾蜍或蛙、常用手术器械、计算机采集系统、神经屏蔽盒、任氏液。
【方法与步骤】
1.  制备蛙或蟾蜍坐骨神经干标本。
2. 将蛙的坐骨神经干标本置于屏蔽盒内的电极上，神经干的中枢端置于刺激电极一侧，从末梢端引导动作电位。
3. 动作电位的观察与记录
(1) 神经干兴奋阈值的测定

刺激强度从0.1V开始，逐渐增加刺激强度，当刚刚出现动作电位时的刺激强度，即为神经干的兴奋阈值。
(2) 双相动作电位
在刺激阈值的基础上逐渐加大刺激强度，可见动作电位的图形为双相，而且其幅值随刺激强度增大而加大。当刺激增加到一定强度时，可见动作电位的幅值不再增大。
(3) 动作电位参数的测量
用鼠标点击“快捷工具栏”的“观察”，移动鼠标，测出动作电位的一系列参数。
(4) 单相动作电位
在两个引导点击之间损伤神经干标本，可使原来的双相动作电位的下相小时，变为单相；注意上相动作电位的图形有什么变化。
4、神经干不应期的测定
用鼠标点击“开始”“刺激”，最初可见到相距30ms（首间隔）的两个动作电位图形，而且两个图形的幅值是同样大小的。此后用鼠标再次点击“刺激”，每刺激一次，第二个刺激即按照“间隔”所设定的时间向第一个刺激靠近一次，从而使第二个动作电位图形向第一个动作电位相应靠近。当发现第二个动作电位的图形幅值开始比第一个减小时，说明第二个刺激落入到第一次刺激的相对不应期。第二个刺激越是靠近第一个刺激，其动作电位的幅值就越小。当第二个刺激距离第一个刺激大约为1.5～2ms左右时，第二个动作电位则完全消失，表明第二个刺激落入到第一次兴奋后的绝对不应期。
 5、 神经冲动传导速度的测定
实验测得搭在两组引导电极之间的神经干长度m，两个动作电位起始点的时间间隔s，由公式v = m / s计算得实验用的蛙坐骨神经干标本的兴奋传导速度

【注意事项】
a) 实验过程中注意保持标本的活性良好，经常用任氏液湿润之。
b) 如果在显示窗上发现动作电位图形倒置，将引导电极位置交换即可。
C) 在引导动作电位的实验中常常会记录到刺激伪迹。刺激伪迹是由外加的刺激和电紧张电位产生的，会随着刺激强度的变化而不断变化，而且刺激伪迹是双相的，通过这些特点可以将刺激伪迹与动作电位的曲线分辨开来。

实验五 脊神经背根和腹根机能的验证
【目的要求】. 1．学习暴露脊髓和分离脊神经背、腹根
的方法。 2．了解背根和腹根的不同机能。
【基本原理】. 脊神经的背根是由传入神经纤维组成，具有传入机能；腹根由传出神经纤维组成，具有传出机能。若切断背根，则相应部位的刺激不能传入中枢；若切断腹根，不能传出冲动，则效应器也不再发生反应。
材料器具 大蟾蜍；中式尖头剪刀，镊子，解剖刀，玻璃钩针，探针，干电池，金属细导线（铜丝），黑线，白线，蛙板（20×15厘米），大头针；两栖动物生理盐水（0.65%氯化钠溶液）。
步骤
1.将蟾蜍或蛙毁脑后腹位固定于蛙板上。沿背部中线剪开皮肤，向前开口至耳后腺水平，向后开口至尾杆骨中段。用剪刀小心剪去脊椎两侧的纵行肌肉及椎间肌肉，暴露椎骨。
2.用金冠剪横向剪断环椎，然后将弯头金冠剪小心伸入椎管，自后至前，逐节剪断两侧椎弓，移去骨片，暴露全部脊髓（勿损伤脊髓）。
3.用眼科镊轻轻挑开脊髓表面的银灰色或黑色脊膜，再用任氏液冲洗马尾部，小心识别第7—10对脊神经背根和腹根。用玻璃解剖针分离一侧第9对脊神经的背、腹根（背根近椎间孔处有淡黄色、半个小米粒大小的脊神经节），将背根穿两条白色丝线，腹根穿两条红色丝线备用。放松两后肢即可进行实验观察。
①提起白丝线，
轻轻用刺激电极钩起背根，打开刺激器，用较弱的单脉冲刺激背根（只引起同侧后肢抖动），记录结果。
②用同样方法刺激腹根，记录结果。
③将两条白色线双结扎背根后从中间剪断神经，分别刺激其中枢端和外周端
（刺激强度不变），记录结果。
④用同样方法结扎并剪断腹根，重复刺激背根中枢端，记录结果。
⑤分别刺激腹根中枢端和外周端，记录结果。
分析和讨论
1.刺激背根外周端，没有反应；刺激背根中枢端有反应，证明背根是传入神经根（感觉神经根）。
2.刺激腹根外周端有反应，刺激腹根中枢端没有反应，证明腹根是传出神经根（运动神经根）。
建议 实验中如分离背、腹根失败，可用脊髓末端的马尾做上述实验。

（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）