微生物限度检查方法验证方案.doc

微生物限度检查方法验证方案
1.目的：
为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，涉及细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较实验菌的恢复生长结果，来评价整个检查方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法合用于该品种的微生物限度检查。 
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊因素确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准
2.范围：
本验证方案合用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文献： 
根据《中国药典》2023年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的规定，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检查条件发生改变时，也许影响检查结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实行：
4.4.1 实验前的准备: 
4.4.1.1 实验用品的准备：将实验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。 
4.4.1.2实验用培养基的制备：取合用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 
4.4.1.3实验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。   
4.4.2 实验菌的制备和稀释： 
4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 
4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。 
4.4.2.1.2将上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释制成每1ml含菌50～100cfu的实验菌液。在黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养基中，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱（菌悬液），用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌50～100cfu的实验孢子液。 
4.4.2.1.3上述菌液在供实验的同时，取1ml注皿、培养、计数；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌用营养琼脂培养基，于30～35℃倒置培养48小时，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，于23～28℃倒置培养72小时。 
4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 
4.4.2.2.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中，在30～35℃培养18～24小时。 
4.4.2.2.2 取上述均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释，制成每1ml含菌10～100cfu的实验菌液。 
4.4.2.2.3上述菌液在供实验的同时，取1ml注皿、注入营养琼脂培养基，于30～35℃倒置培养48小时，计数。 
4.4.3供试液的制备： 
4.4.3.1 根据供试品的理化特性与生物学特性，采用适宜的方法制备供试液。 
4.4.3.2，取供试品养胃舒软胶囊5g，加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充足乳化，作为1：20的供试液。 
4.4.3.3 供试液的制备如需用水浴加温时，温度不得超过45℃，时间不得超过30min。 5.5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方法: 
4.4.4.1 验证实验分4组，照《微生物限度检查法》操作，分别用3个不同批号样品进行3次独立的平行实验，
并分别计算供试品组和对照实验组的菌回收率。 
4.4.4.2实验组：  
4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和实验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株实验菌平行制备2个平皿。 
4.4.4.2.2薄膜过滤法：取1：20的供试液1～10ml，加至100ml稀释液中混匀，按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充足干燥）。用适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量约100ml，总冲洗量不得超过1000ml，在最后一次冲洗液中加入一种实验菌液1ml（含菌50～100CFU），滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于相应的经预培养合格的培养基平板上，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基平板。每株实验菌平行制备2个平板。 
4.4.4.3菌液组：取实验菌液各1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每株实验菌平行制备2个平皿。 5.5.4.4供试品对照组： 
4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 
4.4.4.4.2薄膜过滤法：取1：20的供试液1～10ml（取用量同实验组），加至100ml稀释液中混匀，按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充足干燥）。用冲洗液冲洗滤膜，冲洗液、冲洗量及冲洗次数同实验组，滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于经预培养合格的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上，每种培养基平行制备2个平板。 
4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊解决时，需增长稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的限度。 
4.4.4.5.1平皿法：分别取1ml稀释剂或缓冲液和1ml实验菌液（含菌50～100CFU），注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株实验菌平行制备2个平皿。 
4.4.4.5.2薄膜过滤法：每个滤桶内加入100ml稀释液，按薄膜过滤法过滤，用冲洗液冲洗滤膜，冲洗液、冲洗量及冲洗次数同实验组，在最后一次冲洗液中加入一种实验菌液1ml（含菌50～100CFU），滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于相应的经预培养合格的培养基平板上，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基平板。每株实验菌平行制备2个平板。 
4.4.4.6倾注培养基：在菌液组各平皿中分别倾注15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，其中，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固。 
4.4.4.7培养观测：用于细菌计数的营养琼脂培养基平板，倒置于30～35℃的培养箱中，培养48小时；用于霉菌、酵母菌计数的玫瑰红钠琼脂培养基平板，倒置于23～28℃的培养箱中，培养72小时。逐日观测菌落生长情况，点计菌落数。 
4.4.4.8菌落计数：将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观测并记录结果。
4.4.4.9计算回收率 
 ×100% 
稀释剂对照组回收率＝ ×100% 
4.4.4.10结果鉴定：在3次独立的平行实验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于70％。实验组的菌回收率均不低于70％，则照该供试液制备方法和计数法测定。若任一次实验中实验组的菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 
4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果： 
第一次：
样品名称

实验日期

规格

样品批号

生产商

类别

供试液的制备及解决
□ 保温振摇法  □ 研钵法 □ 匀浆仪   档   min 
□ 水溶性供试品：供试品  g(ml)，加稀释剂  ml，制成1：  供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜 冲洗量   ml。 
□ 非水溶性供试品：供试品  g(ml)，加乳化剂（名称   ；批号   ）   g(ml)，加稀释剂   ml，制成1：   供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜冲洗量   ml。 
□ 其它：                   。
技术方法
细菌计数

霉菌和酵母菌计数
培养基名称
营养琼脂培养基 
玫瑰红钠琼脂培养基
配制批号

培养温度

培养起止时间

菌种名称菌
大肠埃希菌
金黄色葡萄球
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
菌种编号

菌悬液批号

菌液稀释倍数

实验组（cfu）
1

2

平均

菌液组（cfu）
1

2

平均

稀释剂对照组（cfu）
1

2

平均

供试品对照组（cfu）
1

2

平均

实验组回收率(%)

稀释剂对照组回收(%)

结论

检查人/日期

复核人/日期

第二次：
样品名称

实验日期

规格

样品批号

生产商

类别

供试液的制备及解决
□ 保温振摇法  □ 研钵法 □ 匀浆仪   档   min 
□ 水溶性供试品：供试品  g(ml)，加稀释剂  ml，制成1：  供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜 冲洗量   ml。 
□ 非水溶性供试品：供试品  g(ml)，加乳化剂（名称   ；批号   ）   g(ml)，加稀释剂   ml，制成1：   供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜冲洗量   ml。 
□ 其它：                   。
技术方法
细菌计数
霉菌和酵母菌计数
培养基名称
营养琼脂培养基 
玫瑰红钠琼脂培养基
配制批号

培养温度

培养起止时间

菌种名称菌
大肠埃希菌
金黄色葡萄球
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
菌种编号

菌悬液批号

菌液稀释倍数

实验组（cfu）
1

2

平均

菌液组（cfu）
1

2

平均

稀释剂对照组（cfu）
1

2

平均

供试品对照组（cfu）
1

2

平均

实验组回收率(%)

稀释剂对照组回收(%)

结论

检查人/日期

复核人/日期

第三次：
样品名称

实验日期

规格

样品批号

生产商

类别

供试液的制备及解决
□ 保温振摇法  □ 研钵法 □ 匀浆仪   档   min 
□ 水溶性供试品：供试品  g(ml)，加稀释剂  ml，制成1：  供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜 冲洗量   ml。 
□ 非水溶性供试品：供试品  g(ml)，加乳化剂（名称   ；批号   ）   g(ml)，加稀释剂   ml，制成1：   供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜冲洗量   ml。 
□ 其它：                   。
技术方法
细菌计数
霉菌和酵母菌计数

培养基名称
营养琼脂培养基 
玫瑰红钠琼脂培养基
配制批号

培养温度

培养起止时间

菌种名称菌
大肠埃希菌
金黄色葡萄球
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
菌种编号

菌悬液批号

菌液稀释倍数

实验组（cfu）
1

2

平均

菌液组（cfu）
1

2

平均

稀释剂对照组（cfu）
1

2

平均

供试品对照组（cfu）
1

2

平均

实验组回收率(%)

稀释剂对照组回收(%)

结论

检查人/日期

复核人/日期

4.4.5控制菌检查方法验证方法: 
4.4.5.1 根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌，选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证实验分3组，分别用3个不同批号样品或同一批号样品进行3次独立的平行实验。 
4.4.5.2实验组： 
4.4.5.2.1 平皿法：取1：10的供试液10ml（相称于供试品1g、1ml、10cm2和1ml实验菌液（含菌10～100CFU）加入同一增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。 
4.4.5.2.2薄膜过滤法：取1：10的供试液10ml（相称于供试品1g、1ml、10cm2），按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充足干燥）。用适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量约100ml，总冲洗量不得超过1000ml，在最后一次冲洗液中加入1ml实验菌液（含菌10～100CFU），滤过，取出滤膜，放入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。 
4.4.5.3 阳性对照：取1ml实验菌液（含菌10～100CFU），加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。 
4.4.5.4 阴性对照：取10ml稀释剂或缓冲液替代供试液，加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。 
4.4.5.5结果鉴定：在3次独立的平行实验中，阳性对照组应检出实验菌，阴性菌对照组应无菌生长。若实验组检出实验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若实验组未检出实验菌，应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，建立新的方法，并重新验证。 
4.4.5.6控制菌检查方法验证结果：
第一次：
控制菌名称

样品名称

实验日期

规格

样品批号

生产商

类别

供试液的制备及解决
□ 保温振摇法  □ 研钵法 □ 匀浆仪   档   min 
□ 水溶性供试品：供试品  g(ml)，加稀释剂  ml，制成1：  供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜 冲洗量   ml。 
□ 非水溶性供试品：供试品  g(ml)，加乳化剂（名称   ；批号   ）   g(ml)，加稀释剂   ml，制成1：   供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜冲洗量   ml。 
□ 其它：                   。
培养基名称
培养时间
培养起止时间
菌落生长情况
实验组
阳性对照
阴性对照

结论

检查人/日期

复核人/日期

第二次：
控制菌名称

样品名称

实验日期

规格

样品批号

生产商

类别

供试液的制备及解决
□ 保温振摇法  □ 研钵法 □ 匀浆仪   档   min 
□ 水溶性供试品：供试品  g(ml)，加稀释剂  ml，制成1：  供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜 冲洗量   ml。 
□ 非水溶性供试品：供试品  g(ml)，加乳化剂（名称   ；批号   ）   g(ml)，加稀释剂   ml，制成1：   供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜冲洗量   ml。 
□ 其它：                   。
培养基名称
培养时间
培养起止时间
菌落生长情况
实验组
阳性对照
阴性对照

结论

检查人/日期

复核人/日期

第三次：
控制菌名称

样品名称

实验日期

规格

样品批号

生产商

类别

供试液的制备及解决
□ 保温振摇法  □ 研钵法 □ 匀浆仪   档   min 
□ 水溶性供试品：供试品  g(ml)，加稀释剂  ml，制成1：  供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜 冲洗量   ml。 
□ 非水溶性供试品：供试品  g(ml)，加乳化剂（名称   ；批号   ）   g(ml)，加稀释剂   ml，制成1：   供试液；取供试液   ml，冲洗次数   次，每膜冲洗量   ml。 
□ 其它：                   。
培养基名称
培养时间
培养起止时间
菌落生长情况
实验组
阳性对照
阴性对照

结论

检查人/日期

复核人/日期

4.4.6 验证结论:根据上述验证结果,总结出该品种的微生物限度检查方法如下:
5.验证结果评价与建议你
5.1验证结果评估与结论： 
按照验证方案的规定实行验证，并将验证过程记录在验证报告中。对微生物限度检查方法验证的数据进行分析，对验证的结果进行分析和评价，并建议平常监控的项目和周期。
5.2验证会审
验证领导小组对验证实行的过程及结果进行分析和评价，做出确认结论。重要关注如下问题是否得到证明和解决： 
5.2.1验证过程是否有漏掉？
5.2.2验证过程中对验证方案是否进行过修改？修改因素、依据是否充足？是否经批准？
5.2.3验证记录是否完整？数据是否真实？
5.2.4验证结果是否符合标准规定？偏差及对偏差的说明是否合理？是否需要做进一步实验？ 
5.4 最终批准：
本验证项目按照验证方案的环节和规定实行验证后，由验证小组对验证的结果进行分析和评价，验证领导小组组长在验证小组分析和评价的基础上，批准验证是否合格，批准是否投入检查使用。