解磷真菌产紫青霉菌SW-10全基因组测序及功能分析.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:山东省自然科学基金青年项目()国家自然科学基金青年项目()山东省玉米产业技术体系项目()青岛农业大学高层次人才基金项目(/)作者简介:刘峰()男硕士研究生主要从事土壤微生物研究:.通信作者:孙青()女博士讲师主要从事土壤微生物研究:.解磷真菌产紫青霉菌 全基因组测序及功能分析刘峰张培雨姜雯刘树堂孙雪芳赵子铉刘湘孙青(.青岛农业大学农学院山东 青岛.青岛农业大学资源与环境学院山东 青岛)摘要:磷是植物生长必需的营养元素之一但土壤的固化作用等导致土壤有效磷只占土壤全磷含量的 解磷真菌通过分泌有机酸及磷酸酶等能持续、稳定提高土壤磷素的有效性并促进作物对磷素的吸收 本课题组前期分离鉴定出一株对难溶性无机磷和有机磷均具有较好解磷效果的产紫青霉菌()将其命名为 本研究采用 测序平台对菌株 进行全基因组测序完成基因组拼装后进行基因预测、功能注释和解磷相关基因分析 结果表明菌株 基因组大小为.总基因序列长度 共预测到 个编码基因基因平均长度 在、和 数据库中分别有、个和 个基因得到注释鉴定出多个与解磷相关的基因包括柠檬酸合成酶基因 个、苹果酸脱氢酶基因 个、碱性磷酸酶基因 个、酸性磷酸酶基因 个、植酸酶基因 个和磷酸盐转运蛋白基因 个利用 软件预测出菌株 基因组序列中存在碳水化合物活性酶()基因共计 个推测其具有较好的细胞壁水解酶活性 本研究结果可为后续产紫青霉菌解磷相关基因的挖掘利用及其遗传信息的改良提供相关理论依据同时为其它解磷真菌的基因组学研究提供参考信息关键词:产紫青霉菌 解磷全基因组测序基因预测功能注释中图分类号:.文献标识号:文章编号:()(.).().磷是组成植物体内核酸和磷脂等物质的重要矿质元素缺磷往往会导致植株矮小、瘦弱、抗逆性差和产量降低等 我国耕地土壤全磷含量一般在./土壤磷素存量大但其中约不能被植物直接吸收利用而土壤中磷素供给不足常常是制约作物生长发育的重要原因之一 我国约有 的土壤缺磷生产上通常采用外施大量磷肥补充作物对磷的需求但大部分磷肥因土壤金属离子的吸附作用被固定成难溶磷在土壤中大量积累只有 的土壤总磷是以可被植物吸收利用的可溶性形式存在因此能够被植株吸收利用的量很低磷肥利用率只有 磷肥施用量高而利用率低的问题不仅造成了肥料的浪费对土壤质量以及水质也带来了威胁 另据报道磷肥的生产原料磷矿石预计将在未来 年间消耗殆尽 因此通过绿色、高效、经济的解磷措施挖掘土壤潜在磷库对解决作物缺磷、实现作物对磷的高效利用、减轻土壤面源污染及维持生态系统的稳定具有重要意义解磷微生物因其高效的解磷能力被认为是降解土壤难溶磷的有效途径之一 研究表明土壤中存在大量的解磷微生物解磷细菌包括芽孢杆菌属()、假单胞菌属()和不动杆菌属(.)等解磷真菌包括青霉菌属()和曲霉菌属()等 其中解磷真菌的解磷能力一般是解磷细菌的几倍甚至更高而且遗传性状更加稳定对植酸钙、磷酸钙等难溶磷源均有较强解磷能力具备解磷效率高、适应性强、多重解磷机制共同解磷的特点同时解磷真菌还有促进植株生长和提高抗逆性等作用被广泛开发成生物菌肥用于土壤潜在磷库的挖掘与利用 如李豆豆等从番茄根际土中分离出草酸青霉()发现其对磷酸钙、磷酸铝等难溶性无机磷具有较好解磷效果李小军等从烟草根际土壤中筛选出一株烟曲霉()能够有效提高土壤中有效磷含量对烟草具有较好的促生效果 目前关于解磷真菌的研究主要集中于解磷菌的筛选、解磷机理及其对作物生长的影响对其解磷的分子机理研究较少本课题组前期从玉米根际土中筛选到一株对难溶性无机磷和有机磷均具有较好解磷效果的解磷真菌 经形态学及分子鉴定确定为产紫青霉菌()目前关于产紫青霉菌的报道多集中于其解磷条件的优化如 等研究了产紫青霉菌解无机磷的最适 值为.碳源为葡萄糖氮源为()能通过产生有机酸溶解难溶性无机磷 等报道了产紫青霉菌产生胞外磷酸酶的最适 值为.磷源为卵磷脂 但对于产紫青霉菌解磷的分子机制尚无报道 本研究基于 平台对该 菌株进行全基因组序列测序分析并对解磷相关基因及代谢通路等进行初步分析以期为阐明产紫青霉菌解磷机制、挖掘与利用功能基因提供遗传信息基础 材料与方法.供试菌株产紫青霉菌()由青岛农业大学玉米生理生态实验室分离已于中国普通微生物菌种保藏中心登记保藏(山 东 农 业 科 学 第 卷.).基因组 提取将菌株 的分生孢子接种至灭菌 液体培养基置于 /、的培养箱培养 后过滤收集菌丝无菌水冲洗 遍后用液氮速冻研磨采用上海生工生物公司的 柱式真菌 提取试剂盒提取基因组.测序方法选取质量检测合格的 用 打断使其片段化并通过磁珠纯化分选目标片段对 片段做末端修复和 末端加 连接测序接头并用磁珠纯化连接产物 利用 选择性地富集两端连有接头的 片段同时扩增 文库随即利用 定量文库及 对 富集片段进行质控随后通过 平台测序.基因组拼接原始数据经过接头污染去除等处理后过滤生成高质量 序列 采用、软件对测序数据进行从头拼装并使用 (.)软件校正结果随后利用(.)评估基因组拼装的完整性 采用(.)和(.)软件分别进行从头注释和同源注释以完成重复序列的分析与屏蔽、构成与种类统计.蛋白编码基因预测利 用 (.)、(.)和 (.)三个软件对菌株 的基因组序列进行从头预测利用 软件(.)和近缘物种的蛋白质序列进行同源预测 从头预测和同源预测的结果采用 软件整合 生成菌株 的预测结果.基因注释蛋白编码基 因 的 序 列 比 对 采 用(.)软件来完成将预测得到的蛋白编码基因序列与、数据库包含的蛋白质序列进行比对序列比对的临界值选取为 注释采用(.)软件来完成将 注释得到的结果对应到 序列 当中并提取得到 号 注释结果采用 完成 及 注释主要采用 的(.)自动化注释系统完成基因集选择“”基因 判别规则选取 ()注释完成后将 映射到相应 通路 注释利用 软件完成比对数据库为(.)结果与分析.基因组测序与组装本研究利用 测序平台对菌株 进行全基因组测序结果如表 所示 菌株 基因组测序数据量总计 原始 总数为 个过滤后获得 个高质量 含量为.预估其基因组大小为.基因组测序数据拼装完成后共获得 个 最小序列长度为 最大序列长度为 是 基因预测结果(表)显示 基因组共有 个蛋白编码基因总基因序列长度 每个基因平均长度 平均长度 平均每个基因含 个外显子外显子平均长度 内含子平均长度 表 产紫青霉菌 基因组测序与组装类别数量碱基总数/原始 总数高质量 数 含量/.基因组大小/.大片段数量最小序列长度/最大序列长度/表 产紫青霉菌 基因组基因预测结果类别数量蛋白编码基因数量/个总基因序列长度/基因平均长度/平均长度/基因的平均外显子数量/个外显子平均长度/内含子平均长度/第 期 刘峰等:解磷真菌产紫青霉菌 全基因组测序及功能分析.基因功能注释通过 的 数据库共注释到基因 个占预测基因总数的.利用 数据库和 数据库分别注释到基因 个和 个分别占预测基因总数的.和.通过 数据库共注释到基因 个占预测基因总数的.通过 数据库共注释到基因 个占预测基因总数的.利用 数据库和 数据库分别注释到基因 个 和 个 分 别 占 预 测 基 因 总 数 的.和.(图).功能注释对菌株 的基因组利用 注释共得到 个基因按基因功能分为 大亚类即生物学过程 个分支、分子功能 个分支和细胞组分 个分支(图)生图 产紫青霉菌 基因功能注释数据库分布情况图 产紫青霉菌 基因组 功能分类结果山 东 农 业 科 学 第 卷物学过程亚类中涉及基因较多的是生物过程和细胞氮化合物代谢过程分别为 个(.)和 个(.)细胞组分亚类中涉及基因最多的是细胞过程达到 个(.)分子功能亚类涉及基因较多的是分子功能和离子结合过程分别为 个(.)和 个(.)其中具有柠檬酸合成酶活性基因 个苹果酸脱氢酶活性基因 个碱性磷酸酶活性基因 个酸性磷酸酶活性基因 个植酸酶活性基因 个均参与分子功能过程.功能注释对菌株 进行 注释后发现能对应至代谢通路的基因共 个富集在 条代谢通路中(图)涉及基因数量较多的代谢通路主要有以下 条:遗传 信 息 处 理 代 谢 通 路 共 个 基 因(.)信号和细胞过程通路共 个基因(.)代谢通路共 个基因(.)信号转导通路共 个基因(.)碳水化合物代谢通路共 个基因(.)氨基酸代谢通路共 个基因(.)运输和分解代谢通路共 个基因(.)其中与菌株 解磷相关基因包括柠檬酸合成酶基因 个、苹果酸脱氢酶基因 个、酸性磷酸酶基因 个、碱性磷酸酶基因 个和磷酸盐转运蛋白 个主要参与碳水化合物代谢、信号和生物学过程等代谢通路图 产紫青霉菌 基因组 数据库主要代谢通路分析 第 期 刘峰等:解磷真菌产紫青霉菌 全基因组测序及功能分析.功能注释通过 数据库对菌株 进行基因注释及 预测分类共注释到 个基因分为 个大类(图)除功能未知一类外涉及到基因数量较多的分别是:碳水化合物运输和代谢类()共 个基因占比为.翻译后修饰、蛋白质周转及分子伴侣类()共 个基因占比为.次级代谢物的生物合成、运输和分解代谢类()共 个基因占比为.转录类()共 个基因占比为.另外无机离子运输与代谢类()和细胞壁/膜/包膜生物合成类()分别涉及 个和 个基因占比分别为.和.其中与菌株 有机酸分泌相关的基因包括柠檬酸合成酶基因 个和苹果酸脱氢酶基因 个参与能量生产和转化与有机磷矿化水解相关的基因包括 植酸酶基因 个、酸性磷酸酶基因 个和碱性磷酸酶基因 个参与脂质代谢与运输、碳水化合物运输和代谢等过程磷酸盐转运蛋白基因 个参与无机离子运输与代谢过程图 产紫青霉菌 基因组 功能分类结果.碳水化合物活性酶基因分析采用 软件预测菌株 基因组序列中存在的 酶类基因发现其中有 个糖苷水解酶()基因、个糖基转移酶()基因、个碳水化合物酯酶()基因、个辅助活性酶()基因、个碳水化合物结合模块()基因和 个多糖裂解酶()基因(图).解磷及磷酸盐转运相关基因分析解磷微生物可以通过产生和分泌有机酸(包括柠檬酸、苹果酸等)、磷酸酶(包括碱性磷酸酶和酸性磷酸酶)及植酸酶等将土壤中难溶性磷转化为可溶性磷从而有利于植物对磷的吸收经图 产紫青霉菌 基因组 基因数目山 东 农 业 科 学 第 卷过蛋白编码基因的 序列比对、及 功能分析本研究发现了 个柠檬酸合成酶基因、个苹果酸脱氢酶基因、个磷酸盐转运蛋白基因、个碱性磷酸酶基因、个酸性磷酸酶基因和 个植酸酶基因推测其参与了解磷过程(表)表 产紫青霉菌 解磷及磷酸盐转运相关基因基因 描述基因 描述.柠檬酸合成酶().酸性磷酸酶().柠檬酸合成酶().酸性磷酸酶().苹果酸脱氢酶().酸性磷酸酶().苹果酸脱氢酶().酸性磷酸酶().磷酸盐转运蛋白().酸性磷酸酶().磷酸盐转运蛋白().酸性磷酸酶().碱性磷酸酶().酸性磷酸酶().碱性磷酸酶().植酸酶()讨论活化土壤中的难溶性磷、增强土壤有效磷的供给能力对农业可持续发展具有重要意义 土壤解磷微生物能够通过酸解、酶解作用等将土壤中无效磷转化为有效磷供植物吸收利用从而促进植物生长发育 解磷微生物改善土壤磷素营养是一项有利于资源节约、环境友好的重要农业措施 本课题组前期从玉米根际土壤中分离出一株产紫青霉菌 研究发现该菌株对难溶性无机磷和有机磷均具有较好的解磷效果并且能够促进玉米生长接种产紫青霉菌后地上部鲜重和干重、根部鲜重和干重以及株高均显著增加较对 照 分 别 增 加.、.、.、.、.地上部和根部的磷含量分别增加了.和.为深入了解该菌株解磷的生物学特性挖掘具有促进解磷的功能基因本研究利用 测序平台获得菌株 的全基因组序列确定了该菌株的基因组大小为.与已报道的烟曲霉、构巢曲霉等基因组大小相近同时将菌株 基因组测序数据在、等数据库比对分析在分子生物学层面揭示其解磷过程中可能涉及到的基因及代谢通路解磷真菌可通过产生苹果酸、柠檬酸等有机酸促进难溶性无机磷的磷酸根离子释放 等发现比莱青霉在溶解磷酸钙时产生大量草酸和柠檬酸等有机酸 唐超西等自黑曲霉 获得解磷基因 和 均能促进甲酸、乙酸和苹果酸的合成同时分别可以诱导合成 酮戊二酸和柠檬酸 等研究发现将一株草酸青霉的苹果酸脱氢酶 基因导入大肠杆菌后能够有效提高大肠杆菌的解磷能力 本研究发现产紫青霉菌 基因组具有 个柠檬酸合成酶基因和 个苹果酸脱氢酶基因表明其对难溶性无机磷具有降解潜力解磷真菌也可通过分泌磷酸酶、植酸酶等加快有机磷矿化过程 等研究发现解磷真菌在溶解有机磷时其分泌的植酸酶和磷酸酶活性分别可达.和.吴静发现黑曲霉 含有植酸酶基因 能够促进真菌快速分泌植酸酶并提高植酸酶活性进而加快植酸钙溶解 本研究发现菌株 含有 个碱性磷酸酶基因、个酸性磷酸酶基因和 个植酸酶基因说明该菌株能够通过分泌植酸酶和磷酸酶等多种途径矿化土壤中难溶性有机磷增加土壤磷的有效性进而促进作物对养分的吸收研究表明碳水化合物活性酶()与抑菌作用相关 本研究通过 软件预测到菌株 中与碳水化合物活性酶相关基因共计 个包括糖苷水解酶()、糖基转移酶()、碳水化合物酯酶()、辅助活性酶()、多糖裂解酶()五类碳水化合物活性酶基因这与 等报道产紫青霉 具有大量的木质纤维素降解酶相一致 另外 等从 基因组中鉴定出糖苷水解 酶 基 因()表明菌株 可能具有较好的细胞 第 期 刘峰等:解磷真菌产紫青霉菌 全基因组测序及功能分析壁水解酶活性可用于木质纤维素的降解过程 结论本研究采用 测序平台对解磷真菌产紫青霉菌 进行全基因组测序得到菌株的基因组大小为.通过在、及 数据库比对发现其含有 个柠檬酸合成酶基因、个苹果酸脱氢酶基因、个磷酸盐转运蛋白基因、个碱性磷酸酶基因、个酸性磷酸酶基因和 个植酸酶基因从基因角度证实了菌株 具有较强的解磷能力同时预测菌株 基因组含有碳水化合物活性酶相关基因 个推测其具有较好的细胞壁水解酶活性 本研究可为揭示产紫青霉菌的解磷分子机制、推动其在生物解磷方面的进一步开发利用及改良其遗传信息提供理论基础参 考 文 献:.():.刘英杰张丽红张宏等.溶磷微生物在土壤磷循环中的作用研究进展/.微生物学通报:.:./.孟祥坤于新朱超等.解磷微生物研究与应用进展.华北农学报():.():.:.():.姜焕焕李嘉钦陈刚等.解磷微生物及其在盐碱土中的应用研究进展.土壤():.杨顺杨婷林斌等.两株溶磷真菌的筛选、鉴定及溶磷效果的评价.微生物学报():.吴昀纾蔡柏岩.丛枝菌根真菌介导植物磷元素吸收机理的研究进展.山东农业科学():.:.():.:.李豆豆尚双华韩巍等.一株高效解磷真菌新菌株的筛选鉴定及解磷特性.应用生态学报():.李小军吉俐张景宁等.解磷真菌 的筛选及其作用于低品位磷矿的肥效研究.福建农业学报():.():.:.():.:.():.:.():.:.:.:.:.():.():.():.:.:.():.():.山 东 农 业 科 学 第 卷 孙青蒋细良庞莉等.哈茨木霉 全基因组序列测定与分析.中国生物防治学报():.:.():.唐超西龚明波李顺鹏等.黑曲霉 的 文库构建及其溶磷相关基因的筛选.微生物学报():.():.():.吴静.植酸酶 基因的克隆及其在 中的高效表达.泰安:山东农业大学.张德锋高艳侠可小丽等.贝莱斯芽孢杆菌 基因组序列分析及其代谢产物的生防作用.水产学报():.():.:.():.第 期 刘峰等:解磷真菌产紫青霉菌 全基因组测序及功能分析