好氧脱氮菌剂的制备及其强化餐厨废水脱氮研究.pdf

氮素是导致水体污染的重要污染物之一，会引起水质恶化，水体富营养化，进而导致水生动物中毒死亡1。因此，氮素的治理工作日益受到重视，生物脱氮技术受到关注2。目前我国主流的脱氮法有很多，最具有代表性的为 A/O、A2/O 和 SBR 等工艺，SBR 工艺是序批式活性污泥法的简称，是一种按间歇曝气方式来运行的污水处理技术3。该技术的核心是 SBR 反应器，该反应器可将均化、初沉和生物降解等功能综合为一体，且无污泥回流系统。CASCADE 技术是周楚新 等4研发的使用模式算法搜索相关菌株的计算机辅助菌株筛选技术，目前，该技术已成功应用于微生物燃料电池*收稿日期：2023-05-20作者简介：武 俊（1990-），男，云南曲靖人，工程师，主要从事环境保护工作。Feb.2024Vol.53.No.1（Sum 304）2024 年 2 月第 53 卷第 1 期（总第 304 期）云南冶金YUNNAN METALLURGY好氧脱氮菌剂的制备及其强化餐厨废水脱氮研究*武俊1，文顺冬1，樊哙1，杨虎2*，朱红旭3（1.云南云铝泽鑫铝业有限公司，云南 曲靖 655500;2.云南铝业股份有限公司，云南 昆明 652103;3.昆明冶金研究院有限公司，云南 昆明 650031）摘要：针对餐厨废水高有机物、高氨氮的问题，采用计算机辅助菌种选择技术从餐厨垃圾中分离得到了好氧脱氮菌株。试验结果：在培养温度为 35 益、间歇震荡和培养时间 108 h 的条件下，好氧脱氮菌株在培养液中的活菌数达到 8.83 伊 107cfu/mL。在 SBR 反应器中加入自制的含有菌剂的污泥，反应器出水氨氮去除率达到82.10%耀87.92%，与未加菌剂时的氨氮去除率 62.37%耀68.65%相比脱氮率提升了 19.5%，表明本研究的好氧脱氮菌剂对废水脱氮具有强化效果。关键词：CASCADE 技术；复合菌剂；好氧脱氮；SBR 工艺；餐厨废水中图分类号：X502文献标识码：A文章编号：1006-0308（2024）01-0085-07Preparation of Aerobic Denitrifying Microbial Inoculum and Research onDenitrogenation from Kitchen WastewaterWU Jun1,WEN Shun-dong1,FAN Kuai1,YANG Hu2,ZHU Hong-xu3(1.Yunnan Aluminum Zexin Aluminum Industry Co.,Ltd.,Qujing,Yunnan 655500,China;2.Yunnan Aluminum Co.,Ltd.,Kunming,Yunnan 652103,China;3.Kunming Metallurgical Research Institute Co.,Ltd.,Kunming,Yunnan 650031,China)ABSTRACT：Kitchen wastewater contains high organic matter,and high ammonia nitrogen,so adoption of computer-aided bacteriaselection technology can separate and obtain good aerobic denitrifying bacterial strain.Test results are:when the strain culturetemperature is 35 益,with the conditions of the intermittent oscillation and strain culture time is 108 h,the amount of live aerobicdenitrifying bacterial strain in culture medium reaches 8.83伊107cfu/mL.When the home-made sludge contained with microbial inoculumwas added into the SBR reactor,the ammonia nitrogen removal rate in the outlet water of the reactor reached 82.10%87.92%,comparedwith the ammonia nitrogen removal rate without microbial inoculum,the removal rate increased by 19.5%,it shows the aerobicdenitrifying microbial inoculum has strengthening effect to denitrogenation from wastewater.KEY WORDS：CASCADE technology;compound microbial inoculum;aerobic denitrifying;SBR process;kitchen wastewater85Feb.2024Vol.53.No.1（Sum 304）2024 年 2 月第 53 卷第 1 期（总第 304 期）云南冶金YUNNAN METALLURGY图 1SBR 反应器试验装置Fig.1Test device of SBR reactor和土壤纤维素分解微生物筛选等领域，但在餐厨垃圾降解微生物筛选领域的研究还较少。餐厨垃圾废水是指餐厨垃圾经过固液分离并去除大部分废弃油脂的高浓度有机废水，该废水由于具有高有机物和高氨氮的特性，极为适合微生物的生长，近年来成为了生物脱氮领域需解决的重点问题。如能对其进行妥善处理，对于实现餐厨垃圾的无害化和资源化将有重要意义5。微生物的生长繁殖需要吸附在相应的载体上完成，目前研究者常以生物菌剂形式研究生物脱氮过程，主要为利用餐厨垃圾生产液态微生物菌剂，将微生物吸附在相应的载体上，冷冻干燥研磨粉碎制得菌剂，整个过程对环境无污染，制备过程简便，脱氮功能显著，是当下餐厨垃圾废水资源化利用的一条新思路。本研究旨在从餐厨垃圾中筛选出新型复合高效脱氮菌剂强化餐厨垃圾废水脱氮，与传统的筛选方法不同的是在平板划线法上外加 CASCADE 技术，结合生物信息学和人工智能算法技术，筛选分离出好氧脱氮菌株，并将菌株与孔型聚丙烯酸钠混合制备得到好氧脱氮菌剂。之后，为了验证菌剂的脱氮能力，使用外加菌剂的污泥对餐厨垃圾废水进行处理，探究菌剂的脱氮能力，为餐厨废水脱氮领域研究提供了理论基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1CASCADE 技术本研究使用 CASCADE 技术来筛选具有高效脱氮能力的菌株，CASCADE 技术是一种计算机知识模式搜索筛选思路，可以在相应的数据库中针对目标微生物的功能进行微生物筛选6，其技术运用到的基因数据库主要有 NCBI 数据库和 KEGG 数据库，核心的技术为预测靶点技术、人工智能算法技术。1.1.2菌株的来源与培养基的制备本研究筛选微生物的来源取自昆明某大学食堂内的餐厨垃圾，成分包括米饭、蔬菜、肉类、骨头、菜汤等，取样后保存于 4 益冰箱中。培养基的制备：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）7（g/L）：MgSO4 7H2O 1.232 g，K2HPO47 g，KH2PO43 g，葡萄糖 10 g，D-丙氨酸 5 g。PDA 真菌固体培养基需再加入氯霉素 0.1 g 来抑制细菌的生长8，固体培养基需加入 15 g 琼脂粉，配制完成后加蒸馏水定容至 1 L，pH 调整在 7.0依0.5。1.1.3SBR 脱氮试验SBR 反应器示意图见图 1。反应器由有机玻璃制成，内径为 12 cm，高为 40 cm，有效容积为863 L。反应器温度通过恒温加热棒控制在 27耀29 益。反应器曝气方式为间歇式曝气，通过阀门调节空压机曝气量，使用溶解氧仪记录曝气速率，将溶解氧仪探头设置于 SBR 反应器液面以下，以保证SBR反应器表层液面的 DO 始终维持在 1.4耀1.6 mg/L。使用自动进出水控制系统（PLC）控制电磁阀进出水和反应器好氧、缺氧曝气时间。按文献9处理餐厨废水中有机物和氨氮的试验条件来设定 SBR工作流程：进水 1 min寅曝气 3 h寅缺氧搅拌 30min寅沉淀 30 min寅出水 1 min，每 12 h 进水一次，每天进水 2 次。本试验以 UASB 反应器的出水作为 SBR 反应器的试验废水，废水水质见表 1。1.2试验方法1.2.1菌株的筛选1）CASCADE 技术筛选菌株。本研究中的CASCADE 技术主要是基于好氧脱氮理论对餐厨垃圾中的菌株进行筛选。主要分析步骤：淤成分分析：针对餐厨垃圾中的有机物质进行成分分析，明确餐厨垃圾中需要降解的有机成分及其相对含量；于CASCADE 筛选：基于理化分析结果，结合好氧脱氮理论，利用 CASCADE 技术中 NCBI 数据库和 KEGG 数据库对可能存在的高效脱氮菌株进行智能分类和筛选；盂构建菌种名单：根据CASCADE 技术人工智能算法分类结果，结合餐厨垃圾中原有的微生物菌群分析对比，去除餐厨垃圾菌群中不具备脱氮能力的菌株，构建出具有降解有机物能力和具有脱氮能力的菌株组合名单；榆好氧脱氮能力论证：以获得的菌种组合名单为参考，智能构建好氧脱氮菌株的人工培养技术，以便于获得菌种组合名单中的高效脱氮菌株，并使用功能菌株搭配组合，研发复合菌剂论证菌株的好氧脱氮能力。2）菌株平板划线筛选。基于 CASCADE 技术培养结论和相关筛选培养技术的试验方法，总结出本研究的好氧脱氮菌株筛选方法：取 10 g 餐厨垃圾于 90 g 无菌水中，在 30 益，160 r/min 条件下培养 2 h，得到餐厨垃圾稀释悬浮液。取 1 mL稀释悬浮液至 PDA 液体培养基中，在 30 益，160r/min 条件下进行多次富集培养，直至观察到培养液表面有气体快速产生后取 100 滋L 菌液接种到PDA 固体培养基上，细菌的培养方式为在 PDA 固体培养基上 30 益倒置孵育 24 h。观察到有明显菌落后，在 PDA 固体培养基上对菌株进行多次平板划线培养。真菌的培养为在 PDA 真菌固体培养基上 30 益倒置孵育 5耀7 d，直至观察到有明显菌落后对菌株进行多次平板划线培养。将上述分离出的单个菌株接种至 PDA 液体培养基中，于 30 益、160 r/min 条件下振荡培养，每 24 h 取样测定培养液中的硝酸盐氮和总氮，以验证菌株的脱氮能力，保留脱氮能力强的菌株，上述分离培养出的好氧脱氮单菌落均接种至 PDA 液体培养基于-20 益储藏（菌液和甘油比例为 3颐7）备用。1.2.2菌剂的制备将冷冻储藏的菌株以 5%的比例（体积比）接种在含有 500 mL 的 PDA 液体培养中，放置于恒温摇床在 30 益、160 r/min 的条件下培养，培养过程中分别给予不同的供氧条件、培养时间和培养温度进行微生物菌剂脱氮能力论证单因素试验。其中，试验条件设置见表 2。培养完成后，通过平板计数法对培养液中的菌落数进行计数，保留菌落数最多的菌液进行菌剂制备。完成上述试验后，继续量取 450 mL 培养液吸附于 30 g 预处理过的多孔型聚丙烯酸钠中，将 450 mL 培养液与多孔型聚丙烯酸钠充分混合，静置 30 min。混合培养液放置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥 24 h，冻干后将菌剂用粉碎机粉碎，于 4 益保存在干燥器皿中，即得好氧脱氮微生物菌剂。表 2微生物菌剂脱氮能力论证单因素试验Tab.2Single factor experiment for denitrogenation capabilityanalysis of microorganism microbial inoculum试验批次固定变量变量试验1温度培养时间供氧条件静置间歇振荡全程振荡试验2间歇振荡培养时间温度/益253545试验3间歇振荡温度培养时间/h72108144表 1SBR 反应器进水水质Tab.1Influent water quality of SBR reactormg/L水质指标pHCODCr氨氮数值3.964.84957.18依147342.43依65.98武俊，等：好氧脱氮菌剂的制备及其强化餐厨废水脱氮研究87Feb.2024Vol.53.No.1（Sum 304）2024 年 2 月第 53 卷第 1 期（总第 304 期）云南冶金YUNNAN METALLURGY1.2.3餐厨废水脱氮未处理的餐厨垃圾废水水质见表 1，在进行餐厨垃圾废水好氧脱氮试验前，该废水已在 UASB 反应器内进行了为期 53 d 的厌氧生物降解，之所以需要运行 SBR 反应器进行好氧脱氮试验，是由于该废水在经过 53 d 的 UASB 反应器厌氧降解后，其废水中的 COD 和氨氮浓度远远达不到 污水排入城市下水道水质标准 和 城镇污水处理厂污染物排放标准 中的最低排放限值，UASB 反应器的平均出水 COD 浓度高于 1 000 mg/L，氨氮平均出水浓度高于 250 mg/L，本研究采用 SBR 工艺和UASB 工艺联合降解餐厨垃圾废水，以期达到更好的水质净化效果。具体流程：选取 50 g/L 好氧污泥加入 SBR 反应器，在建立 SBR 反应器并提前运行 30 d 后，在污泥中加入 2.5 g/L 本试验研发的好氧菌剂混匀，经过模拟废水脱氮能力驯化后将好氧污泥加入 SBR 反应器用于处理 UASB 反应器出水。整个试验过程中 SBR 反应器温度控制在 26耀30 益，DO 浓度控制在 1.5耀2.0 mg/L，进行为期 65d 的好氧脱氮试验。1.3分析方法与计算菌株的微观形态使用 EM 科特公司扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）记录，氨氮通过水和废水监测分析方法测定10，图形的绘制使 用 Origin8.6（Or igin Lab Corp，Northampton，美国）。去除率的计算方法为：（C0-C1）衣C0伊100%，式中 C0和 C1分别为初始浓度和最终浓度，mg/L。图 2菌株的培养皿照片（a）和扫描电镜照片（b）Fig 2 Culture dish photograph(a)and scanning electron microscope photograph(b)of the strain（a）（b）88图 3不同的氧气供应条件（a）、培养温度（b）和培养时间（c）对菌剂活菌数的影响Fig.3Effect of different oxygen cultrue supply conditions(a),culture temperature(b)and time(c)on livemicrobial inoculum amount2分析与讨论2.1CASCADE 技术筛选菌株研究2.1.1好氧脱氮菌株筛选结果分析本研究利用 CASCADE 技术对餐厨垃圾进行了成分分析，分析结果与微生物高通量测序结果比对（高通量测序方法和结果可参考杨勇 等9的研究），利用该技术筛选了 52 株菌株，人工智能算法技术删除了数据库重复菌株和对人体、环境有害的菌株，最终剩余 42 株菌株，42 株菌株中包含了厌氧菌株和好氧菌株，代表性菌株名称为：地衣芽孢杆菌（Baclicus licheniformis）、解木糖赖氣酸芽抱杆菌（Lysinibacterium xylanilyticus）、假蕈状芽抱杆菌（Baclicus pseudomycoides）、表皮短杆菌（Brevibacterium epidermidis）、蜡样芽孢杆菌（Baclicus cereuss）、固氮类芽孢杆菌（Paenibacillusjamilae）、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus poly-myxa）、解淀粉芽孢杆菌（Baclicus amyloliquefa-cien）、枯草芽抱杆菌（Baclicus subtilis）等 42 类，本研究通过 CASCADE 技术快速获得了每种菌株的筛选方式、最适生存条件和菌株脱氮能力强弱等信息，与传统的筛选方式相比可更加明确脱氮微生物的筛选方向，大大缩短了微生物的筛选周期。2.1.2菌株的形态分析通过平板划线法在好氧条件下获得了好氧脱氮菌株，菌株的形态特征多为圆形、乳白色和黄色、菌落连续分布，表面光滑湿润，边缘整齐，紧贴在培养基表面，且易挑取（图 2a）；多为椭圆状、圆状和杆状、分布密集、菌株长度和宽度范围约为 0.5耀1 滋m，大小形态适中，大部分菌株无鞭毛和芽孢（图 2b），且菌落密集，无明显凹陷和破损，表明菌落生长良好。2.2好氧脱氮菌株的培养2.2.1好氧脱氮菌种培养因素研究复合微生物菌剂具有显著强化含氮废水脱氮的能力11。本研究中菌剂的筛选培养试验为单因素试验。由图 3、表 3 可知，在相同的培养时间和培养温度下，在 45 益培养 108 h 时，三种震荡条件下间歇震荡的活菌数最高，为 5.22 伊 107cfu/mL，显著高于静置和全程震荡的活菌数，说明在间歇震荡下菌落的生长状态最好；在相同的培养时间和震荡下，在 108 h 和间歇震荡时，可以看出，在温度为 35 益时，活菌数达到 8.21 伊 107cfu/mL，说明 35 益是该菌剂生存的最适温度；在相同的温度和震荡条件下，在 35 益和间歇震荡时，说明在时间为 108 h 时菌落密度最高，为 8.83 伊107cfu/mL，在 108 h 时菌落处于对数增长期，菌落密度最高。（a）（b）（c）武俊，等：好氧脱氮菌剂的制备及其强化餐厨废水脱氮研究89Feb.2024Vol.53.No.1（Sum 304）2024 年 2 月第 53 卷第 1 期（总第 304 期）云南冶金YUNNAN METALLURGY图 5SBR 反应器运行中氨氮的去除情况Fig.5Ammonia nitrogen removal situation of SBR reactor operation综上所述，通过对时间、震荡条件（氧气供应）和温度等培养条件进行优化，得知菌落对于温度和溶解氧的需求和多数菌株相似，过高的温度（40 益）、过高的溶解氧和太长的培养时间均会抑制菌落生长，在培养温度为 35 益、氧气供应为间歇震荡和培养时间为 108 h 时菌株活性较好。2.2.2菌剂的制备在 35 益、间歇震荡和 108 h 条件下培养得到的菌液，让其与孔型聚丙烯酸钠充分混合且冷冻干燥后，制备得到了好氧脱氮菌剂（图 4），该菌剂颗粒细小，呈黄棕色，遇水能沉淀，对环境无二次污染，菌剂品质优良。2.3餐厨废水脱氮研究由图 5 可知，1耀21 d 为未加菌剂的阶段，该阶段的进水氨氮平均浓度为 271.15耀280.35 mg/L，出水氨氮平均浓度为 86.35耀103.85 mg/L，平均氨氮去除率为 62.37%耀68.65%。21耀93 d 为投加菌剂的阶段，该阶段的进水氨氮平均浓度为 298.42耀表 3不同的氧气供应条件（a）、培养温度（b）和培养时间（c）对菌剂活菌数的影响Tab.3Effect of different oxygen supply conditions(a),culture temperature(b)and culture time(c)on live microbialinoculum amount氧气供应静置全程震荡间歇震荡温度/益253545菌落数/（伊107Cfu/mL）3.544.145.31菌落数/（伊107Cfu/mL）7.378.506.86培养时间/h72108144菌落数/（伊107Cfu/mL）4.278.547.70图 4好氧脱氮微生物菌剂Fig.4Aerobic denitrifying microorganism microbial inoculum90423.18 mg/L，出水平均氨氮浓度为 42.70耀64.50mg/L，平均氨氮去除率为 82.10%耀87.92%；可以看出，与未加菌剂相比反应器内氨氮的去除率提升了 19.5%，且加入菌剂后，系统内出水氨氮浓度维持稳定。此外，在加入菌剂后，反应器内氨氮的进水浓度出现了显著上升，但是出水的氨氮浓度却维持稳定并且有持续下降的趋势，分析原因主要是由于微生物经过培养驯化后逐渐适应培养环境，脱氮菌株大量繁殖的结果。虽然本研究中菌剂对反应器脱氮拥有显著效果，但其出水氨氮浓度并未达到污水排入城市下水道水质标准 和 城镇污水处理厂污染物排放标准 等的氨氮排放标准，这可能与进水 COD 浓度和 DO 浓度的波动有关。综上，SBR 反应器中加入好氧微生物菌剂对氨氮去除率有显著提升效果，加入菌剂后出水氨氮去除率始终保持在 82.10%耀87.92%，与未加菌剂时的氨氮去除率 62.37%耀68.65%相比脱氮率提升了19.5%，但目前该反应器也尚未达到微生物的最适生长和脱氮条件，其促进效果还需进一步研究。3结 语1）本研究通过 CASCADE 和平板划线技术，筛选出好氧脱氮菌株，期间通过对时间、震荡条件（氧气供应）和温度三个因素进行交互分析，得到在培养温度为 35 益、氧气供应为间歇震荡和培养时间为 108 h 时，培养液中活菌数达到最大（8.83伊107cfu/mL），将该培养液与孔型聚丙烯酸钠混合干燥，制备得到好氧脱氮菌剂；2）好氧脱氮微生物菌剂制备成功后，本研究在 SBR 反应器中加入含有菌剂的污泥，加入菌剂后出水氨氮去除率始终保持在 82.10%耀87.92%，与未加菌剂时的氨氮去除率 62.37%耀68.65%相比脱氮率提升了 19.5%，证实了含有好氧脱氮微生物菌剂的污泥对餐厨废水脱氮具有强化效果。参考文献：1 朱红旭，杨本芹，高媛，等.一株好氧反硝化细菌的筛选鉴定及其脱氮特性J.生物学杂志，2022，39（4）：39.2 武孔焕，聂菊芬，王志芸，等.人工湿地中反硝化细菌的筛选及鉴定J.环境科学导刊，2014，33（6）：5.3 董宝刚，宋小燕，刘锐，等.间歇曝气 SBR 与传统 SBR处理养猪沼液的比较研究J.环境科学，2016，37（11）：8.4 李小建，冯文谦，曾彩明，等.油脂去除对餐厨垃圾压滤液厌氧消化的影响J.环境化学，2012，31（4）：6.5 丁西明，康建邨，闵海华，等.垃圾分类对垃圾渗滤液处理领域的影响分析J.中国给水排水，2021，37（18）：43.6 王俊琳，张亚，刘双清，等.计算机辅助药物设计在新农用化合物开发中的应用 J.农药，2022，61（4）：243.7 杨玲，沙楠景，潘鹏举，等.云南地区铁线莲叶枯病病原菌的鉴定和主要生物学特性J.浙江农业学报，2022，34（7）：8.8 王冬莹，吴文成，李霞，等.一株能同时降解邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和氰戊菊酯真菌的分离、鉴定及降解特性的初步研究J.环境科学学报，2015，35（11）：7.9 杨勇，刘维维，欧根能，等.计算机辅助菌种选择技术的菌剂开发及应用J.云南冶金，2021，50（5）：130.10 吴淑岱.水和废水监测分析方法第四版酝.北京：中国环境科学出版社，2002.11 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