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第三章第三章 发酵液预处理发酵液预处理第1页第2页目n不但在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞不但在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质沉淀物），碎片、核酸和蛋白质沉淀物），n还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于后继各步操作。利于后继各步操作。采取絮凝或凝聚方法，设法增大悬浮液中固体粒子大采取絮凝或凝聚方法，设法增大悬浮液中固体粒子大小，提升其沉降速度；小，提升其沉降速度；或采取稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。或采取稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。第3页第一节第一节 发酵液预处理发酵液预处理一、发酵液过滤特征改变一、发酵液过滤特征改变微生物发酵液特征为：微生物发酵液特征为：发酵产物浓度较低，大多为发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大部分是水；，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；性质不稳定，随时间改变，如易受空气氧化、微生物污染、蛋性质不稳定，随时间改变，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用影响。白酶水解等作用影响。微生物发酵液成份极为复杂，其中除了所培养微生物菌体及残余固微生物发酵液成份极为复杂，其中除了所培养微生物菌体及残余固体培养基外，还有未被微生物完全利用糖类、无机盐、蛋白质，以体培养基外，还有未被微生物完全利用糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物各种代谢产物。及微生物各种代谢产物。第4页改进发酵液过滤特征物理化学方法：改进发酵液过滤特征物理化学方法：调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。解冻及添加助滤剂等。第5页1.1.降低液体粘度降低液体粘度降低液体粘度降低液体粘度 2.2.调整调整调整调整pHpH3.3.凝聚与絮凝凝聚与絮凝凝聚与絮凝凝聚与絮凝 依据流体力学原理，滤液经过滤饼速率与液体粘度成反比，降低液体依据流体力学原理，滤液经过滤饼速率与液体粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提升过滤速率。注意加热温度粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提升过滤速率。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞完整性。与时间，不影响产物活性和细胞完整性。pH值直接影响发酵液中一些物质电离度和电荷性质，适当调整值直接影响发酵液中一些物质电离度和电荷性质，适当调整pH值可值可改进其过滤特征。氨基酸、蛋白质等电点调整；在膜过滤中，发酵液中改进其过滤特征。氨基酸、蛋白质等电点调整；在膜过滤中，发酵液中大分子物质易与膜发生吸附，经过调整大分子物质易与膜发生吸附，经过调整pH值改变易吸附分子电荷性质，值改变易吸附分子电荷性质，即可降低堵塞和污染；细胞、细胞碎片及一些胶体物质等在某个即可降低堵塞和污染；细胞、细胞碎片及一些胶体物质等在某个pH值值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤进行。下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤进行。采取凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质分采取凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质分散状态，使其聚结成较大颗粒，便于提升过滤速率。另外，还能有效散状态，使其聚结成较大颗粒，便于提升过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提升滤液质量。地除去杂蛋白和固体杂质，提升滤液质量。第6页n凝聚凝聚指在电解质作用下，因为胶粒之间双电层电排斥指在电解质作用下，因为胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定现象；作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定现象；n絮凝絮凝指在一些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，指在一些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团过程。使胶粒形成较大絮凝团过程。第7页阳离子对带负电荷胶粒凝聚能力次序为：阳离子对带负电荷胶粒凝聚能力次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+惯用凝聚剂电解质有：惯用凝聚剂电解质有：硫酸铝硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；（明矾）；氯化铝氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁硫酸亚铁 FeSO47H2O；石灰；石灰；ZnSO4；MgCO3（1）凝聚）凝聚 发酵液中细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层结发酵液中细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定分散状态。构使胶粒之间不易聚集而保持稳定分散状态。第8页l采取絮凝法可形成粗大絮凝体，使发酵液较易分离。采取絮凝法可形成粗大絮凝体，使发酵液较易分离。l絮凝剂是一个能溶于水高分子聚合物絮凝剂是一个能溶于水高分子聚合物，其相对分子质量可，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包含带电荷阴离子（如活性官能团，包含带电荷阴离子（如-COOH）或阳离子）或阳离子（如（如-NH2）基团以及不带电荷非离子型基团。）基团以及不带电荷非离子型基团。l它们经过静电引力、范德华引力或氢键作用，强烈地吸附它们经过静电引力、范德华引力或氢键作用，强烈地吸附在胶粒表面。在胶粒表面。l当一个高分子聚合物许多链节分别吸附在不一样胶粒表面当一个高分子聚合物许多链节分别吸附在不一样胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大絮团，这就是絮凝作上，产生桥架联结时，就形成了较大絮团，这就是絮凝作用。用。（2）絮凝）絮凝第9页高分子絮凝剂吸附和絮凝作用示意图高分子絮凝剂吸附和絮凝作用示意图第10页1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；烯类衍生物；2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。当前最常见高分子聚合物絮凝剂当前最常见高分子聚合物絮凝剂有机合成聚丙烯酰胺（有机合成聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物）类衍生物依据活性基团在水中解离情况不一样，可分为三类：依据活性基团在水中解离情况不一样，可分为三类：非离子型、非离子型、阴离子型（含有羧基）阴离子型（含有羧基）阳离子型（含有胺基）阳离子型（含有胺基）工业上使用絮凝剂可分为三类：工业上使用絮凝剂可分为三类：第11页聚丙烯酰胺絮凝剂聚丙烯酰胺絮凝剂第12页聚丙烯酰胺类絮凝剂聚丙烯酰胺类絮凝剂优点优点l用量少，普通以用量少，普通以mg/L计量；计量；l絮凝体粗大，分离效果好；絮凝体粗大，分离效果好；l絮凝速度快；絮凝速度快；l种类多，适用范围广。种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂聚丙烯酰胺类絮凝剂缺点缺点u存在一定毒性，尤其是阳离子型聚丙烯酰胺，用存在一定毒性，尤其是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应慎重。于食品和医药工业时应慎重。聚丙烯酰胺类絮凝剂聚丙烯酰胺类絮凝剂应用应用n医药和食品工业：医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍生聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有机高物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。酰壳多糖等）。第13页影响絮凝原因絮凝剂加量絮凝剂加量(图图3-13-1）絮凝剂分子量絮凝剂分子量溶液溶液pHpH搅拌速度搅拌速度搅拌时间搅拌时间第14页n对于带负电荷菌体或蛋白质来说，采取阳离子型高分对于带负电荷菌体或蛋白质来说，采取阳离子型高分子絮凝剂同时含有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥子絮凝剂同时含有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架双重机理；架双重机理；n对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采取凝聚对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采取凝聚和絮凝双重机理才能提升过滤效果，这种包含凝聚和和絮凝双重机理才能提升过滤效果，这种包含凝聚和絮凝机理过程，称为混凝。絮凝机理过程，称为混凝。（3 3）混凝）混凝）混凝）混凝第15页4.4.加入助滤剂加入助滤剂加入助滤剂加入助滤剂5.5.加入反应剂加入反应剂加入反应剂加入反应剂 一个不可压缩多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量细一个不可压缩多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量细微胶体粒子被吸附到助滤剂表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。微胶体粒子被吸附到助滤剂表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。惯用助滤剂有：惯用助滤剂有：硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最惯硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最惯用是硅藻土。用是硅藻土。使用硅藻土时，通常细粒用量为使用硅藻土时，通常细粒用量为500 g/m3；中等粒度用量为；中等粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为粗粒用量为700-1000 g/m3。加入反应剂和一些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如加入反应剂和一些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成沉淀能预防菌丝体粘结，使菌丝含有块状结构，沉淀本等。生成沉淀能预防菌丝体粘结，使菌丝含有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改进过滤性能；身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改进过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提升过滤速如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提升过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%淀粉酶，淀粉酶，搅拌搅拌30min后，再加后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提升过滤效率硅藻土助滤剂，可提升过滤效率5倍。倍。第16页发酵液中杂质发酵液中杂质a.高价无机离子（高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）b.杂蛋白杂蛋白在采取离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质交换容量。在采取离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质交换容量。u在采取离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，在采取离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，u在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。u在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。所以，在预处理时，应尽可能除去这些物质。所以，在预处理时，应尽可能除去这些物质。二、发酵液相对纯化二、发酵液相对纯化第17页（一）、高价无机离子去除方法（一）、高价无机离子去除方法1.Ca2+草酸、草酸、草酸钠草酸钠，形成草酸钙沉淀形成草酸钙沉淀（注（注意回收草酸）意回收草酸）；2.Mg2+三聚磷酸钠，三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；溶性络合物；3.Fe2+黄血盐，黄血盐，普鲁士蓝沉淀普鲁士蓝沉淀第18页（二）杂蛋白去除方法（二）杂蛋白去除方法蛋白质普通以胶体状态存在于发酵液中。蛋白质普通以胶体状态存在于发酵液中。l在酸性溶液中带正电荷；在酸性溶液中带正电荷；l在碱性溶液中带负电荷。在碱性溶液中带负电荷。在某一在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。1.沉淀法沉淀法第19页l在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；淀；l在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和和Pb2+等形成沉淀。等形成沉淀。酸碱调整，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。酸碱调整，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。第20页2.变性法变性法 加热加热大幅度调整大幅度调整pH值值加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处不足之处a.加热法只适合于对热较稳定目标产物；加热法只适合于对热较稳定目标产物；b.极端极端pH值也会造成一些目标产物失活，且要消耗大量酸碱；值也会造成一些目标产物失活，且要消耗大量酸碱；c.有机溶剂法通常只适合用于所处理液体数量较少场所。有机溶剂法通常只适合用于所处理液体数量较少场所。第21页加入一些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。加入一些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。加入一些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。加入一些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。在四环素类抗生素中，采取黄血盐和硫酸锌协同作在四环素类抗生素中，采取黄血盐和硫酸锌协同作用生成亚铁氰化锌钾胶状沉淀来吸附蛋白质；用生成亚铁氰化锌钾胶状沉淀来吸附蛋白质；在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，二者生成庞大凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性二者生成庞大凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法吸附法第22页第二节第二节 固液分离工程固液分离工程及设备及设备第23页A.重力沉降重力沉降B.浮选浮选C.旋液分离旋液分离D.过滤过滤E.离心离心通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。用于固液比重差小、直径用于固液比重差小、直径530mm颗粒分离，污水处理颗粒分离，污水处理悬浮液以较高速度沿切线方向进入悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋液分离器旋液分离器，轻相由分离器中央排出，轻相由分离器中央排出，重相由分离器下部排出，重相由分离器下部排出，但不适合直径但不适合直径5 m颗粒去除（可用丝网分离器）。颗粒去除（可用丝网分离器）。工业上惯用工业上惯用霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采取霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采取过滤方法；过滤方法；细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采取高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可取高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。用过滤进行固液分离。一、固液分离方法一、固液分离方法第24页优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；缺点：设备投资高、能耗大。缺点：设备投资高、能耗大。离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。1.离心分离离心分离在液相非均一系统中，利用离心力到达液液、液固、在液相非均一系统中，利用离心力到达液液、液固、液液固分离方法，统称为离心分离。液液固分离方法，统称为离心分离。第25页碟片式离心机 是是传传统统离离心心机机，为为当当前前工工业业上上应应用用最最广广泛泛离离心心机机。分分离离因因数数可可达达1000-01000-0，最最大大处处理理量量到到达达300m300m3 3/h/h，惯惯用用于于大规模分离过程大规模分离过程。适用范围 细细菌菌、酵酵母母菌菌、放放线线菌菌、细胞碎片细胞碎片第26页第27页管式离心机 管式离心机是一个分离效率很高离心分离管式离心机是一个分离效率很高离心分离设备，其转鼓细长，可在设备，其转鼓细长，可在15000-5000015000-50000高转高转速下工作，分离因数可达速下工作，分离因数可达10104 4-610-6105 5。它设。它设备简单、操作稳定。备简单、操作稳定。适用范围 细细胞胞、细细胞胞碎碎片片、细细胞胞器器、病病毒毒、蛋蛋白白质质、核核酸酸等等。尤尤其其适适合合普普通通分分离离机机难难以以分分离离固固形形物含量物含量1%1010）悬浮液）悬浮液分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液过滤分离。母发酵液或细胞悬浮液过滤分离。缺点：因为受真空度限制，不适于菌体较小和粘度较因为受真空度限制，不适于菌体较小和粘度较大细菌发酵液过滤，且过滤所得固相干度不如加大细菌发酵液过滤，且过滤所得固相干度不如加压过滤。压过滤。（2）真空转鼓过滤机）真空转鼓过滤机第40页第41页第42页n硅藻土使用方法：硅藻土使用方法：作为过滤介质 预涂在支持介质上 加入到悬浮液中n按支撑单元分：按支撑单元分：板框过滤机，叶片式过滤机等（3）硅藻土过滤机）硅藻土过滤机第43页1）切向流过滤（）切向流过滤（Cross-Flow Filtration）又称错流过滤）又称错流过滤 交叉过滤和十字流过滤，是一个维持恒压下高速过滤技术。其操作特点是交叉过滤和十字流过滤，是一个维持恒压下高速过滤技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动剪切作用将过滤介质表面固使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动剪切作用将过滤介质表面固体（滤饼）移走。体（滤饼）移走。2）双水相萃取）双水相萃取 向水相中加入溶于水一些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形向水相中加入溶于水一些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不一样两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另一成密度不一样两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另一个高分子化合物，从而到达分离和提纯某种高分子化合物目标。个高分子化合物，从而到达分离和提纯某种高分子化合物目标。3）吸附法）吸附法 向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液经过装向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液经过装有吸附剂固定床，即可到达除去细胞碎片目标。主要问题是极难选择适当吸有吸附剂固定床，即可到达除去细胞碎片目标。主要问题是极难选择适当吸附剂，以确保目标产物不被吸附而损失。附剂，以确保目标产物不被吸附而损失。3.其它固液分离方法其它固液分离方法第44页作业：作业：1.1.名词解释：絮凝；凝聚；混凝名词解释：絮凝；凝聚；混凝 2.2.发酵液中高价无机离子和杂蛋白能够采取哪些方法发酵液中高价无机离子和杂蛋白能够采取哪些方法去除？去除？3.3.试述生物工业中惯用固液分离设备原理、特点、及试述生物工业中惯用固液分离设备原理、特点、及适用范围。适用范围。第45页