生物化学大实验省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

试验室基本操作试验室基本操作第1页1玻璃仪器清洗玻璃仪器清洗试验中所用玻璃仪器清洁是否，直接影响试验结果，往往由於仪器不清洁或被污染而造成较大试验误差，有时甚至会造成试验失败。做生物化学试验对玻璃仪器清洁程度要求，比普通化学试验要求更高。这是因为：生物化学试验中蛋白质、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”计，稍有杂质，影响就很大。生物化学试验对许多常见污染杂质十分敏感，如金属离子（钙、镁离子等）、去污剂和有机物残基等，所以玻璃仪器（包含离心管等塑料器皿）是否彻底清洗净就是非常主要。第2页 初用玻璃仪器清洗 新购置玻璃仪器表面常附着有游离碱性物质，可先用0.5去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在12盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最终用无离子水冲洗两次，在100120烘箱内烘干备用。第3页 使用过玻璃仪器清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用适当毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.5清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，不然重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。第4页 石英和玻璃比色皿清洗 决不可用强碱清洗，因为强碱会浸蚀抛光比色皿。只能用洗液或1 2去污剂浸泡，然后用自来水冲洗，这时使用一支绸布包裹小棒或棉花球棒刷洗，效果会更加好，清洗洁净比色皿也应内外壁不挂水珠。第5页2 塑料器皿清洗塑料器皿清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成塑料器皿，在生物化学试验中已用越来越多。第一次使用塑料器皿时，可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调pH=1）清洗，接着依次用无离子水、1 mol/L KOH和无离子水清洗，然后用10-3 mol/L EDTA 除去金属离子污染，最终用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。第6页3 洗液配制洗液配制 因己确定铬有致癌作用，所以配制和使用洗液时要极为小心，惯用两种配制方法以下：取100mL 工业浓硫酸置于烧杯内，小心加热，然后慢慢加入5g重铬酸钾粉末，边加边搅拌，待全部溶解并迟缓冷却后，贮存在磨口玻璃塞细口瓶内。称取5g重铬酸钾粉末，置于250mL 烧杯中，加5mL 水使其溶解，然后慢慢加入100mL 浓硫酸，溶液温度将达80，待其冷却后贮存于磨口玻璃瓶内。第7页4 其它洗涤液其它洗涤液 工业浓盐酸：可洗去水垢或一些无机盐沉淀。5草酸溶液：用数滴硫酸酸化，可洗去高锰酸钾痕迹。510磷酸三钠（Na3PO412H2O）溶液：可洗涤油污物。30硝酸溶液：洗涤二氧化碳测定仪及微量滴管。510乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：加热煮沸可洗脱玻璃仪器内壁白色沉淀物。第8页 尿素洗涤液：为蛋白质良好溶剂，适合用于洗涤盛过蛋白质制剂及血样容器。有机溶剂：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脱油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脱油漆污垢。氢氧化钾乙醇溶液和含有高锰酸钾氢氧化钠溶液：这是两种强碱性洗涤液，对玻璃仪器侵蚀性很强，可去除容器内壁污垢，洗涤时间不宜过长，使用时应小心慎重。第9页5 玻璃和塑料器皿干燥玻璃和塑料器皿干燥 生化试验中用到玻璃和塑料器皿经常需要干燥，通常都是用烘箱或烘干机在110120进行干燥，而不要用丙酮荡洗再吹干方法来干燥，因为那样会有残留有机物覆盖在器皿内表面，从而干扰生物化学反应。硝酸纤维素塑料离心管加热时会发生爆炸，所以决不能放在烘箱中干燥，只能用冷风吹干。第10页6 移液移液 滴管 使用方便，可用于半定量移液，其移液量为1mL5mL，惯用2mL，可换不一样大小滴头。滴管有长、短两种，新出一个带刻度和缓冲泡滴管，能够比普通滴管更准确地移液，并预防液体吸入滴头。移液管（吸管）吸管使用前应洗至内壁不挂水珠，1mL 以上吸管，用吸管专用刷刷洗，0.1mL、0.2mL和0.5mL 吸管可用洗涤剂浸泡，必要时能够用超声清洗器清洗。因为铬酸洗液致癌，应尽可能防止使用。若有大量成批吸管洗后冲洗，可使用冲洗桶，将吸管尖端向上置于桶内，用自来水屡次冲洗后再用蒸馏水或无离子水冲洗。第11页 吸管分为两种，一个是无分度，称为胖肚吸管，准确度较高，其相对误差A级为0.7 0.8，B级为1.5 0.16，液体自标线流至口端（留有残液），A级等候15s，B级等候3s。另一个吸管为分度吸管，管身为一粗细均匀玻璃管，上面均匀刻有表示容积分度线，其准确度低于胖肚吸管，相对误差A级为0.8 0.2，B级为1.60.4，A级、B级在吸管管身上有A、B字样，有“快”字则为快流式，有“吹”字则为吹出式，无“吹”字吸管不可将管尖残留液吹出。吸、放溶液前要用吸水纸擦拭管尖。第12页吸管吸收溶液最惯用是洗耳球。另外，为便于移液，还能够使用新式吸液球，球上有A、B、C三个玻璃珠阀门，吸液之前，先用拇指和食指按捏A阀，用其它手指挤压球体，由A阀排气，使球内形成负压，插入吸管吸液时，用拇指和食指按捏B阀，将溶液吸至所需刻度，放液时按捏C阀，直至溶液流尽，若需吹出管尖残液时，可在按捏C阀同时，用中指挤压C阀前面小球泡，即可吹出管尖残液。还有一个“吸管泵”，使用更为方便，插入吸管后，用拇指转动上部小轮，即可使园柱形泵内柱塞上下移动，将溶液吸入或排出吸管，尤其是在移取10mL 以上溶液时，用“吸管泵”最为方便。第13页 微量进样器 微量进样器惯用作气相和液相色谱仪进样器，在生化试验中主要是用作电泳试验加样器，通常可分为无存液和有存液两种。1)0.5L 5L无存液微量进样器：进样器不锈钢芯子直接通到针尖端处，不会出现存液，所以可用于5L以下极微量液体进样。2)10L100L有存液微量进样器：不锈钢针尖管部分是空管，进样器柱塞不能抵达，因而管内会存有空气或液体。第14页其使用注意事项是：不可吸收浓碱溶液，以免腐蚀玻璃和不锈钢零件。因为有存液，所以吸液时要往返多拉几次，将针尖管内气泡全部排尽。针尖管内孔极小，使用后，尤其是吸收过蛋白质溶液后，必须马上清洗针尖管，预防堵塞。若遇针尖管堵塞，不可用火烧，只能用0.1mm不锈钢丝耐心串通。进样器未润湿时不可往返干拉芯子，以免磨损而漏气。若进样器内发黑，有不锈钢氧化物，可用芯子蘸少许肥皂水，往返拉几次即可除之。第15页 自动取液器 这种取液器在生化试验中大量地使用，它们主要用于屡次重复快速定量移液，能够只用一只手操作，十分方便。移液准确度（即容量误差）为(0.51.5)，移液精密度（即重复性误差）更小些，为 0.5。取液器可分为二种：一个是固定容量，惯用有100l、200L和1000L等几个；另一个是可调容量取液器，惯用有200L、1000L和5000L等各种规格。每种取液器都有其专用聚丙烯塑料吸头，吸头通常是一次性使用，当然也能够超声清洗后重复使用，而且此种吸头还能够进行120高压灭菌。第16页可调式自动取液器操作方法是用拇指和食指旋转取液器上部旋钮，使数字窗口出现所需容量体积数字，在取液器下端插上一个塑料吸头，并旋紧以确保气密，然后四指并拢握住取液器上部，用拇指按住柱塞杆顶端按钮，向下按到第一停点，将取液器吸头插入待取溶液中，迟缓松开按钮，吸上液体，并停留12秒钟（粘性大溶液可加长停留时间），将吸头沿器壁滑出容器，用吸水纸擦去吸头表面可能附着液体，排液时吸头接触倾斜器壁，先将按钮按到第一停点，停留一秒钟（粘性大液体要加长停留时间），再按压到第二停点，吹出吸头尖部剩下溶液，假如不便于用手取下吸头，可按下除吸头推杆，将吸头推入废物缸。第17页自动取液器使用注意事项是：吸收液体时一定要迟缓平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。为取得较高精度，吸头需予先吸收一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸收血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差。浓度和粘度大液体，会产生误差，为消除其误差赔偿量，可由试验确定，赔偿量可用调整旋钮改变读数窗读数来进行设定。可用分析天平称量所取纯水重量并进行计算方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水20时重0.9982g。第18页生化试验室基本设施与装备生化试验室基本设施与装备 第19页1 温度与环境设施温度与环境设施 许多生化试验都要求在一定温度和湿度下进行操作，所以，一个正规生化试验室必须能够保持恒温、恒湿环境。为了保持这些条件，试验室都应装备空调和加湿器等，而仪器分析室则要求保持干燥，一些怕潮湿和易水解试剂应保留在干燥箱中。因为各种生物材料、制剂和各种生化试剂要求在不一样温度下保留，试验室必须备有4、20、80冰箱，需要在更低温度下保留样品，则须使用液氮罐。对于需在较高温度下进行操作，则可使用烘箱和高温电炉等。试验室还应备有干冰，方便使用乙醇干冰浴进行样品快速冷冻分装。第20页2 试验室用纯水试验室用纯水 生化试验室使用最多溶剂是“水”，配制生化试验用试剂不能用自来水，只能使用经过纯化水。生化试验对所用水纯度是要求比较高，通常能够认为，水质量越高，试验结果就越真实可靠和准确，为此必须确保试验用水质量。惯用两种纯水是二次蒸馏水和无离子水。在超纯分析和特殊生化试验中要求更高水质，如1518 Mcm高纯无离子水、无热源高纯水、无菌水、亚沸蒸馏水、无二氧化碳蒸馏水等。第21页试验室制备无离子水，通常使用聚苯乙烯磺酸型强酸性阳离子交换树脂和聚苯乙烯季胺型强碱性阴离子交换树脂填充阳离子和阴离子交换柱，或是阴、阳离子交换树脂百分比为21混合柱。无离子水水质用电阻率表示，最高纯度是18 Mcm（25）。即使无离子水中阴、阳离子含量能够很低，但用离子交换法却不能去除水中有机物杂质，离子交换树脂中低分子有机化合物亦可能溶于水，所以由无离子水电阻率不能看出水中有机物污染程度，有机物污染有可能干扰生化试验中一些反应，也会使水紫外吸收增加，对于那些对紫外吸收要求十分严格试验，应选取蒸馏水而不用无离子水。第22页试验室中制备蒸馏水，多采取石英管加热硬质玻璃蒸馏水器，蒸馏时不能用自来水，因为会产生水垢，最好用无离子水作为水源。如欲除去有机物，可在蒸馏水器中每升水加1g高锰酸钾和1mL 85磷酸，方便经过氧化除去有机物。不含金属离子水，需用亚沸蒸馏水，即用石英亚沸蒸馏器进行蒸馏，其特点是在液面上方加热，但水并不沸腾，只是液面处于亚沸状态，可将水蒸气带出杂质减至最低，但制水量较小，每小时约14升。第23页试验工作中不应盲目追求水纯度，水价格随水质提升而成倍地增加，所以要依据实际工作需要，即所用水中应排除干扰物质类型，来选取水种类，如：无离子水、普通蒸馏水、二次蒸馏水、亚沸蒸馏水及按特殊要求制备高纯水等。全部各种纯水，在贮存中都会被污染：塑料容器会产生有紫外吸收有机物；玻璃和金属容器会产生金属离子污染；长时间放置更会使水长菌，空气中二氧化碳会溶入水中，所以贮存高纯水一定要隔绝空气，密封盖严，必要时贮存在冰箱冷藏室中。第24页3 消毒系统消毒系统 生化试验要进行生物培养和生物反应操作，这些操作都必须排除其它生物原因干扰，所以在做这些试验之前，都必须对试验中用到、可能造成污染材料、器械等进行消毒灭菌处理。惯用灭菌方法有：高温、高压灭菌、紫外线照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消毒等，所以试验室必须配置各种无菌处理设备。第25页4 计量系统计量系统 生化试验都要求在各种标准定量条件下进行，所以试验室必须配置各种标准定量系统。惯用定量系统有：称量系统、液体体积度量系统、pH测定系统、液体溶质定量系统等。称量系统：最惯用设备是各种千分之一扭力天平、电子天平和各种万分之一单、双盘天平和电子天平等，它们分别用于各种缓冲液配制和标准物质称量等。液体体积度量系统：惯用有各种量筒、移液管、容量瓶、微量进样器和各种自动取液器等。第26页 酸碱度pH测量系统：最惯用是pH试纸和pH计。液体溶质定量系统：此系统主要是依据液体溶质一些理化特征而设计，不一样物质在一定条件下有特定吸收光谱，其吸收值大小与其在溶液中浓度有一定关系，能够经过测定某物质在溶液中吸收光谱来计算出该物质浓度，因而分光光度计就是生化试验室必备仪器分析伎俩。主要有可见分光光度计、紫外可见分光光度计和高档快速扫描紫外可见分光光度计等。第27页5 离心设备离心设备 离心方法是分离和制备生物大分子最惯用伎俩，因而生化试验室必须备有各种形式离心机。惯用有普通台式离心机、高速冷冻离心机和超速离心机等。详见后述。第28页6 电泳装置电泳装置 电泳是生化试验中最惯用最主要试验技术之一，主要用于分析、判定，也可用于制备。电泳装置由电源和电泳槽两部分组成，详见后述。第29页7 层析装置层析装置 层析又称为色谱，是分离各种生物大分子主要伎俩之一，因而各种层析系统和核酸蛋白检测器就是生化试验室最惯用仪器设备。主要层析技术有：吸附层析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等，详见后述。第30页8 光密度仪光密度仪 激光光密度仪是适合用于各种电泳结果分析仪器。它采取激光为光源，色散性强，线性范围广，分辨率高，所得结果能够在电脑中进行多维图象处理，并打印出结果，在生化试验室中正得到越来越广泛使用。第31页9 真空印迹系统真空印迹系统 该设备是一个利用真空原理将已经分离生物大分子(蛋白质、核酸)从电泳后凝胶中转移到膜上仪器，主要由印迹仪和真空印迹泵组成，印迹效率靠近100，重复性好，方法简易、快速，将转移分子变性、中和、印迹等全部步骤均在印迹仪中完成，从而防止了凝胶受损。第32页10 核酸自动合成仪与测序仪核酸自动合成仪与测序仪 用于DNA、RNA自动合成及序列测定。11 蛋白质自动合成与测序仪蛋白质自动合成与测序仪 用于蛋白质分子体外合成与序列测定。第33页12 PCR仪仪 PCR(Polymerase Chain Reaction)是指聚合酶链式反应。该反应是用DNA聚合酶在体外大量扩增DNA片段一个方法。PCR仪就是将此方法实现了自动化操作一个仪器，是生化与分子生物学试验惯用和必备设备。第34页13 同位素试验设施同位素试验设施 生物化学许多试验都要用到放射性同位素，如：生物体分子示踪、分子杂交、放射性检测等，所以试验室必须有安全同位素试验设施。放射源材料存放室：用于放射源材料存放、保管等，应较僻静。操作时防护设施：惯用器含有：有机防护瓶、特制防护衣、防护罩等。接触同位素样品时必须戴防护手套。第35页放射性检测、监测器：在操作同位素地方，应配置检测、监测器，能自动安全报警，随时汇报并指示放射源情况。放射性核素分析测定仪：用来检测分析试验结果。惯用有液体闪烁计数器，数字式放射自显影分析仪，盖革计数器和射线放射显影盒等。废物处理器：使用同位素应有能够安全地存放和处理同位素废物场所，不然禁止使用同位素。第36页14 生物培养设施生物培养设施 生物培养是生化试验必不可少设备。生物材料培养有微生物培养、植物细胞及组织培养、动物细胞及动物培养等。不一样培养，其对设施要求也有所不一样。微生物培养：需要恒温恒湿培养箱、振荡培养器即摇床（有空气和水浴式以及全温式摇床）、发酵罐、大型生物反应器等。植物细胞及组织培养：需要恒温恒湿光照培养箱、振荡培养器、生物反应器和植物房等。动物细胞及动物培养：需要二氧化碳培养箱、电热恒温培养箱和动物房等。第37页15 基因导入仪基因导入仪 用于向受体生物细胞中导入基因。惯用导入仪有：电导入仪、基因枪、激光和超声导入仪、原生质体融合仪等。16 高效液相色谱仪和毛细管电高效液相色谱仪和毛细管电泳仪泳仪 用于各种生物大分子分析与判定。第38页17 暗室暗室 在生化试验研究中，必须有一间装备完整暗室，能对各种摄影乳胶和感光材料进行处理，如各种电泳凝胶摄影冲洗和放大，放射性自显影X射线片及其它感光底片处理，以及进行核酸与荧光物质（溴化乙锭）结合后在紫外线照射下对电泳结果观察操作等。暗室中应装备有：摄影装置、放大机、曝光箱、翻拍仪、自动冲片机和紫外透射仪等。第39页18 冷室冷室 生化试验普通都要求在低温下进行，因为冰浴太小，冷柜也不能进人操作，所以就需要有一间410冷室，工作人员能够在其中进行各种柱层析、各种电泳、生物大分子提取和分离、硫酸铵沉淀蛋白质以及各种物质透析等操作，并能够贮存各种生物制品和生化试剂。第40页19 其它设备其它设备 试验室除以上常规设备和设施外，还必须装备以下一些惯用设备：通风柜：用于有害和有毒气体操作。微波炉：用于化冻、灭菌及其它一些需要快速加热操作。组织打坏机和匀浆器：用于各种生物材料、动植物组织和细胞破碎。超声清洗机：用于各种器皿、移液管和自动取液器吸头清洗和高效液相色谱仪所用流动相脱气等。制冰机：为试验室提供足够碎冰块。第41页 冰冻干燥机：用于生物大分子水溶液冰冻干燥，可由其水溶液直接制得固体干粉。机械和水环式真空泵：用于旋转蒸发器和各种真空抽气操作。旋转蒸发器：用于各种水溶液和有机溶液旋转减压蒸馏操作。普通显微镜和倒置显微镜：用于对各种细胞和生物材料观察。酶标仪：用于免疫化学试验酶联免疫吸附测定。第42页