结肠癌患者血清外泌体miR-320的表达及其临床意义.pdf

肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.4结肠癌患者血清外泌体miR-320的表达及其临床意义王治帮，关道宏，谢彝忠（海南省肿瘤医院 普外科，海南 海口，570000）摘要：目的分析结肠癌患者血清外泌体miR-320的表达及其临床意义。方法选取2018年4月至2020年4月我院收治的50例结肠癌患者纳入研究，另选取50例体检健康者纳入对照组，收集两组的血清样本，采用RT-qPCR法检测血清外泌体中miR-320的表达，并分析其对结肠癌的诊断价值。结果纯化的血清样品中存在大量外泌体颗粒，其特性与其他相关研究报道一致。结肠癌患者血清外泌体中miR-320的相对表达量明显低于健康对照组 （0.690.23）vs.（1.530.48），t=11.16，P0.001。血清外泌体miR-320诊断结肠癌的曲线下面积为0.871（95%CI：0.5960.925），诊断敏感度为90.73%，特异度为82.43%。结论结肠癌患者血清外泌体中miR-320表达下调，可能作为结肠癌早期诊断的评价指标。关键词：结肠癌；血清外泌体；miR-320；表达中图分类号：R375.3 文献标识码：A Expression and clinical significance of serum exosome miR-320 in patients with colon cancerWANG Zhibang,GUAN Daohong,XIE Yizhong(Hainan Cancer Hospital,Haikou,570000,Hainan,China)Abstract:Objective To analyze the expression and clinical significance of serum exosome miR-320 in patients with colon cancer.Methods A total of 50 patients with colon cancer admitted in our hospital between April 2018 and April 2020 were included in the study,and 50 healthy patients were included in the control group.The serum samples were collected from the two groups,and the expression of miR-320 in serum exosomes was detected by RT-qPCR method,and the diagnostic value of colon cancer was analyzed.Results There were a large number of exosome particles in the purified serum samples,and its characteristics were consistent with those reported in other relevant research.The relative expression of miR-320 in serum exosomes of patients with colon cancer was significantly lower than that of healthy controls(0.690.23)vs.(1.530.48),t=11.16,P0.05）。本研究经本院医学伦理委员会审批通过，且入组人员均知情同意。1.2方法1.2.1样本收集收集样本前，患者均未接受手术治疗或放化疗。采集两组空腹静脉血58 mL，结肠癌组于确诊当日采集，健康对照组于体检当日采集。采集的样本经离心（3 000 rmin-1 10 min）处理后，留取上层血清，置于-80 冰箱保存。1.2.2外泌体提取及鉴定采用 ExoQuick-TM 试剂盒（日本SBI公司）提取血清外泌体。提取后，将外泌体样品染色并置于JEM-2100F型透射电子显微镜（日本电子株式会社）下观察颗粒形态。采用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测外泌体表面的蛋白标志物，抗体包括羊抗兔二抗（深圳市安提生物科技有限公司）、CD63抗体（武汉菲恩生物科技有限公司）、CD9抗体（武汉菲恩生物科技有限公司）、Calnexin 抗体（巴傲得生物科技有限公司）及TSG101抗体（美国abcam公司）。采用Nanosight 纳米颗粒跟踪分析仪（英国马尔文仪器有限公司，型号NS300）检测外泌体颗粒浓度，稀释样品，浓度为11081109个/mL，检测阈值设为5。1.2.3血清外泌体 miR-320 检测采用 TRIzol 试剂盒（碧云天生物技术有限公司）提取外泌体样品中的总RNA。逆转录反应严格按照逆转录试剂盒（碧云天生物技术有限公司）说明书操作，反应体系20 L：RNA 样品 2 L、引物 1 L、逆转录酶 1 L、5RT缓冲液4 L、GAPDH反向引物1 L、RNase 抑制剂0.5 L、dNTP混合物（10 mmolL-1）1 L、不含RNase的水9.5 L。采用实时荧光定量PCR扩增仪对miR-320进行定量检测，反应体系25 L：稀释的cDNA 2 L、引物2 L、SYBR 12.5 L、ddH2O 8.5 L。采用2Ct法计算结果，以miR-39为外参基因，血清外泌体miR-320相对表达量=2CtmiR-320-2CtmiR-39。1.3统计学分析采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数标准差（x s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用2检验；采用受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）评价血清外泌体miR-320的诊断价值，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1血清外泌体的鉴定电子显微镜视野内可见直径约为100 nm的圆形颗粒，呈脂质双层膜囊状。Nanosight结果显示，样品中颗粒主要分布于35190 nm，且分散均匀，颗粒直径呈单峰正态分布。Western blotting结果显示，样品中外泌体表面有外泌体标志蛋白表达，细胞膜标志蛋白Calnexin呈高表达（图1）。以上结果说明纯化的血清样品中存在大量外泌体颗粒。2.2血清外泌体miR-320相对表达量结肠癌组血清外泌体 miR-320相对表达量明显低于健康对照 组（0.690.23）vs.（1.530.48），t=11.16，P0.001（图2）。2.3miR-320与结肠癌患者临床特征的关系不同临床分期、不同分化程度及是否出现淋巴结转移的结肠癌患者血清中外泌体 miR-320的相对表达量比较，差异有统计学意义（P0.05）（表1）。2.4ROC曲线分析血清外泌体miR-320诊断结肠癌的 ROC 曲线下面积为 0.871（95%CI：0.5960.925），诊 断 敏 感 度 为 90.73%，特 异 度 为82.43%（图3）。462肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.43讨论临床上，结肠癌的早期症状较为隐匿，约75%85%的患者确诊时已错过手术治疗时机6。因此，临床应重视结肠癌的早期诊断。随着临床对结肠癌诊断标志物的深入研究，miRNA被发现与肿瘤的发生和进展有关。miRNA为一类具有高时序性、保守性、组织特异性等特征的内源性非编码RNA。既往研究报道，miR-98-5p7、miR-1458、miR-1839等多种 miRNA 在结肠癌组织中表达异常。虽然miRNA可用于结肠癌的早期诊断，但目前多数研究均以结肠癌组织或细胞作为检测miRNA的样本，而样本的采集一般通过穿刺或有创手术进行，相对繁琐，因此不适用于结肠癌的普遍筛查。有资料显示，miRNA在人体血液、胸腔积液、脑脊液、尿液等体液中均有表达，其中，外周血中miRNA的表达受到临床广泛关注10。徐菲菲等11研究注：（A）电镜下外泌体颗粒形态；（B）颗粒直径分布图；（C）Western blotting检测结果。Note:(A)The shape of exosomes particles under electron microscope;(B)Particle diameter distribution diagram;(C)Results of Western blotting.图1血清外泌体的鉴定Fig.1Identification of serum exosomes图3ROC曲线分析Fig.3ROC curve analysis图2血清外泌体miR-320相对表达量分析Fig.2Analysis of the relative expression of miR-320 in serum exosomes表1miR-320与结肠癌患者临床特征的关系Tab.1The relationship between miR-320 and the clinical characteristics of colon cancer patients临床特征性别男女年龄50岁50岁肿瘤直径5 cm5 cm临床分期期期分化程度中低分化高分化淋巴结转移有无n212926242327321834163119血清外泌体miR-320相对表达量0.670.090.700.110.710.140.680.120.700.110.680.130.730.100.640.070.570.050.740.120.520.080.790.12t1.0250.8100.5813.3757.1119.558P0.3100.4220.5640.0010.0010.001 463肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.4报道，结直肠癌患者血清中miR-194和miR-497呈高表达。另有学者报道，miR-224-3p在结直肠癌患者血清中呈高表达12。由以上结果可知，血清miRNA有可能成为结肠癌临床诊断的评价指标。但血清中包含蛋白质、类脂、无机盐等复杂成分，可能对血清miRNA的检测结果造成一定影响。既往研究显示，血清外泌体的成分没有血清复杂，其中miRNA的存在形式稳定，且检测样本容易获得，分离纯化技术较完善13。此外，外泌体在4 环境下可保存2周，在-20 环境下可保存5年，这为血清外泌体miRNA成为肿瘤评价指标提供了可能性。本研究显示，结肠癌患者血清外泌体中 miR-320的相对表达量明显低于健康对照组（P0.001），提示血清外泌体中miR-320异常表达可能与结肠癌有关。既往研究报道，miR-320可抑制结肠癌细胞增殖和侵袭，可能是结肠癌的治疗靶点14。余海婷等15对 70例结直肠癌患者进行研究发现：miR-21和 miR-92a在结直肠癌患者血清外泌体中呈高表达，血清外泌体miR-21与结直肠癌肝转移有关，血清外泌体miR-92a与结直肠癌临床分期、淋巴结转移、浸润程度等相关，二者可用于结直肠癌患者的病情评估。由以上研究结果推测，血清外泌体miRNA可能成为结肠癌临床诊断的评价指标。进一步通过 ROC 曲线分析发现，血清外泌体miR-320 诊断结肠癌的曲线下面积为 0.871（95%CI：0.5960.925），敏 感 度 为 90.73%，特 异 度 为82.43%，提示血清外泌体miR-320对结肠癌具有较高的诊断价值。其原因可能是由于外泌体表面的脂膜阻断了酶对其中miRNA和蛋白的降解，使得外泌体的稳定性较高，故而对外泌体miR-320的检测具有较好的特异性和稳定性。杨晓等16研究报道，外泌体中含多种特异性分子，可能成为结直肠癌早期诊断的理想标志物。陈欢等17研究报道，外泌体miRNA 对结直肠癌早期临床诊断具有重要价值。Tang等18研究报道，血清外泌体miR-320是一项非侵入性诊断生物标志物，可用于区分转移性和非转移性大肠癌。以上研究表明，血清外泌体miRNA参与了肿瘤的发生，是一类可用于预测肿瘤的分子标志物，血清外泌体miR-320检测作为一项非侵袭性肿瘤诊断技术，值得临床借鉴。综上所述，结肠癌患者血清外泌体中miR-320表达下调，可能成为结肠癌早期诊断的评价指标。同时，本研究也存在一定不足，由于受样本量限制，未能对 miR-320在结肠癌发生和进展中的作用机制进行探究，今后会继续收集相关样本，深入探讨血清外泌体miRNA与结肠癌的关系，以期为结肠癌的早期诊疗提供更有价值的参考依据。参考文献1 ZHANG W L,XIAO J,LU X M,et al.PVT1(rs13281615)and miR-146a(rs2910164)polymorphisms affect the prognosis of colon cancer by regulating COX2 expression and cell apoptosis J.J Cell Physiol,2019,234(10):17538-17548.DOI:10.1002/jcp.28377.2 祝磊,李炳强,陈晨.miRNA-145对结肠癌细胞体外增殖、侵袭、凋亡的影响J.中国免疫学杂志,2019,35(5):575-578.DOI:10.3969/j.issn.1000-484X.2019.05.012.3 李琰,杨博.3D腹腔镜下全结肠系膜切除术对右半结肠癌患者术后microRNA-101和CD4+水平变化及局部复发率的影响J.中国内镜杂志,2019,25(4):24-31.DOI:10.3969/j.issn.1007-1989.2019.04.005.4 DING X Q,WANG Z Y,XIA D,et 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杂志审稿专家（按姓名拼音排序）白勇陈坡程凯邓玉屏冯剑波何枫胡英斌蒋文娟李贺*李威（湖南）李跃军刘芬刘俊*刘鹏（北京）刘新福刘志中毛超安潘常惬申竑宋香清孙未佟仲生王树森吴宏伟夏隆政*肖华谢伟彬许湘华杨云鹏曾宏亮张乐蒙*钟警周钰娟蔡净亭陈珊珊*程岩丁一冯智军*何欣胡哲煜蒋小剑李金兰*李威（上海）李芸刘峰刘科刘鹏*（湖南）刘学文刘治国毛婷彭文颖*申莹莹宋永喜覃丽涂剑王涛*吴晖夏月峰肖坚*谢阳春颜苗叶子奇曾理张瑞光钟外生周泽平曹伟*陈帅戴淼杜灵彬符一岚*何奕黄赛金一李凌*李武李政刘高明刘黎刘韶刘耀龙红萍梅恒彭向东沈波宋正波汤梦婕万小敏王晓稼吴辉菁夏铮铮肖凯谢宇颜仕鹏易斌曾亮张师前钟喆邹冬玲陈刚陈翔戴助*范刚付滢舟贺怡子黄闻欢*雷光李明君李湘平李志铭刘红刘利*刘天舒刘艺平龙瀛蒙光义彭杨*石峰苏晨唐海林王碧芸王瑛吴俚蓉向波肖玲熊炜阳帆尹月曾媚姿张英丽周春花邹双发陈金洋陈兴贵邓敏范洁琳高水超衡建福黄奕雷坚*李宁李心亮李子明刘洪刘路*刘文刘颖（北京）鲁智豪倪士峰蒲兴祥*石卉苏婧唐洁王贺冉王志远吴娜怡园向往肖帅徐崇锐杨海燕于鲁海曾珊张永昌*周殿友*左笑丛陈力陈雪邓坦范磊郭丽娜洪婷*贾罄竹李贵玲李奇灵李亚军廖德华刘怀刘淼*刘文辉刘颖*（湖南）罗嘉宁贻崇全香花石泽亚苏敏唐静怡王俊王子毅吴文一*向左娟谢建飞徐建国杨蕙于芝颖曾卫强赵德华周芙玲陈临溪谌赟邓锡云方堃韩正祥侯静蒋倩李国文李清林李妍廖乙媚刘继勇刘妮刘香丽刘兆喆罗茜欧阳磊任欢史琛孙鹏唐田王念魏永长吴峥肖海帆谢明颢徐康平杨娟袁芃张春波赵东陆周文虎陈攀*成舒乔邓银华方唯意郝志英*胡蕾蒋涛李海涛李秋华李洋林琴刘珈刘念刘晓慧刘志刚罗尧岳欧阳琳达戎佩佩宋程孙涛唐艳艳王胜峰温灏席加喜肖洪涛谢宁徐芹芹杨烁袁霞*张家兴郑虹周于禄标*的为本期审稿专家 465