济宁地区新生儿遗传代谢病串联质谱筛查结果分析.pdf

医学检验与临床2 0 2 4年第35卷第1期Medical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.15：doi:10.3969/j.issn.1673-5013.2024.01.002济宁地区新生儿遗传代谢病串联质谱筛查结果分析-段宁宁陈西贵杨池菊周成4(济宁市妇幼保健计划生育服务中心新生儿疾病筛查中心，山东济宁2 7 2 0 0 0)摘要 目的：了解济宁地区遗传代谢病的患病率、疾病构成和基因变异类型。方法：采集2 0 2 2 年1月-12 月参加新生儿疾病筛查的新生儿足跟血，用串联质谱，（tandemmass spectrometry，M S/M S）法检测血中氨基酸、肉碱和琥珀酸丙酮浓度，筛查遗传代谢病。用核酸质谱和二代测序检测突变基因，Sanger测序验证，用百分位数法确定参考值范围。结果：52 19 2 例新生儿遗传代谢病MS/MS初次筛查阳性12 9 8 例，召回118 8 例，阳性召回率9 1.53%(1188/1298)。确诊遗传代谢病32 例，阳性预测值2.6 9%(32/118 8)，总患病率为1/16 31。以氨基酸代谢疾病最常见，占56.2 5%（18/32)，其次为有机酸代谢疾病和脂肪酸氧化代谢疾病，分别占2 8.13%(9/32）和15.6 3%（5/32)。常见的突变基因是PAH和MAT1A，有机酸代谢疾病常见的突变基因为MMACHC，脂肪酸氧化代谢疾病常见的突变基因为ACADVL。结论：氨基酸代谢疾病是济宁地区新生儿最常见的遗传代谢病，其常见突变基因为PAH和MAT1A。建立遗传代谢病MS/MS筛查切值，探讨疾病构成及其热点突变基因位点，有助于遗传代谢病的早期诊断和精准治疗。关键词 遗传代谢病；新生儿疾病筛查；串联质谱；基因分析Analysis of tandem mass spectrometry screening results of neonatal genetic metabolicdiseases in Jining cityDUAN Ning-ning,CHEN Xi-gui,YANG Chi-ju,et al(Jining Maternal and Child Health and Family Planning Service Center,Shandong Jining 272000)Abstract Objective:To understand the prevalence,disease composition and genetic variant type of genetic metabolic diseases inJining region.Methods:The heel blood of newborns attending neonatal disease screening from January to December 2022 was collectedand the blood concentrations of amino acid,carnitine and acetone succinate were detected by tandem mass spectrometry(tandem massspectrometry,M S/MS)to screen for genetic metabolic diseases.Mutated genes were detected by nucleic acid mass spectrometry andsecond-generation sequencing and verified by Sanger sequencing,and reference ranges were determined by the percentile method.Results:52,192 neonatal M S/MS were positive,1188 were recalled,with a positive recall rate of91.53%(1188/1298).32 cases of geneticmetabolic diseases were confirmed,with a positive predictive value of 2.69%(32/1188),and an overall prevalence was 1/1631.Amino acidmetabolism diseases were the most common,accounting for 56.25%(18/32),followed by organic acid metabolism diseases and fatty acidoxidation metabolism diseases,accounting for 28.13%(9/32)and 15.63%(5/32),respectively.The common mutated genes were PAHandMAT1A,the common mutated genes for organic acid metabolic diseases were MMACHC,and the commonly mutated genes for fatty acidoxidative metabolic diseases were ACADVL Conclusion:Amino acid metabolic diseases are the most common genetic metabolic diseasesin newborns in Jining region,and their mutation genes are PAHand MAT1A.The screening value of M S/MS of genetic metabolic diseasesis established to explore the disease composition and its hot spot mutation gene locus,which is helpful to the early diagnosis and precisetreatment of genetic metabolic diseases,Key words Genetic metabolic diseases;Neonatal disease screening,Tandem mass spectrometry,Genetic analysis近年来，随着串联质谱（tandemmass spectrome-try，M S/M S）技术的应用，为遗传代谢病的早期精准诊断和个性化治疗提供了新的技术平台。MS/MS法筛查新生儿遗传代谢病具有高灵敏性、高特异性、高一基金项目：济宁市重点研发计划项目，项目编号：2 0 2 0 YXNS049。A通讯作者：周成，E-mail：j n f y z c 16 3.c o m。6选择性和快速检测的优点，通过检测新生儿滤纸干血斑中多种氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱水平，筛查数十种遗传代谢病-4。2 0 2 2 年济宁市应用MS/MS技术筛查新生儿52 19 2 例，现将筛查结果和疾病检出情况报告如下。1资料与方法1.1检测对象为济宁地区2 0 2 2 年1月1日-2022年12 月31日出生的新生儿，按照新生儿遗传代谢病血片采集技术规范要求，采集新生儿出生后48 h7d的足跟血三滴，用S&S903滤纸吸附，自然晾干后制成干血斑，0 8 或-2 0 冰箱密封保存，由新生儿疾病筛查实验室集中检测。1.2仪器和试剂三重四级杆MS/MS仪为美国Waters产品，型号TQDeterctor。琥珀酰丙酮和非衍生化多种氨基酸、肉碱和和琥珀酰丙酮检测试剂盒（串联质谱法）和质控品为广州丰华生物工程有限公司产品。1.3筛查实验方法用全自动打孔仪取直径3.2mm新生儿干血斑，加至9 6 孔U底型微孔板中，加人包含用氨基酸、肉碱内标的萃取液10 0 L，使用粘性封片覆盖微孔板，立即微孔板置于振荡器内，在温度为30（5），振频为6 50 7 50 rpm的条件下振荡孵育45分钟。揭去粘性封片，每空转移7 5L至对应的9 6 孔V型微孔板中，用铝箔覆盖微孔板，静置2 h以上，放入自动进样器中，三重四级杆MS/MS仪用全扫描采集模式采集数据，通过目标分析物峰强度与内标物之间的比率，计算待测分析物浓度，检测指标包括11氨基酸、31种肉碱和琥珀酰丙酮，实验设置高低值质控。1.4基因检测MS/MS筛查阳性新生儿立即召回，采集静脉血5mL，用磁珠捕获法富集纯化DNA。用飞行时间质谱法检测已知的遗传代谢病突变基因，用二代测序技术检测已知或未知的遗传代谢病突变基因，阳性结果用Sanger测序验证。1.5疾病诊断新生儿筛查血样检测结果为可疑阳性时，召回复查，血样仍阳性者，检测特异性生化指标和突变基因。遗传代谢病诊断依据：特异生化指标异常并携带复合杂合子或纯合子；特异生化指标显著异常或出现临床症状，并携带杂合子。1.6统计学方法采用SPSS20.0软件进行统计学分析，检测指标Cut-off值范围用百分位数法；计数资料采用例数和百分率n（%）表示，患病率用1：Medical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.1n表示。2结果2.1筛查指标统计分析在52 19 2 例新生儿，男性2 7 6 2 8 例，女性2 456 4例，男女之比1.12：1，MS/MS筛查结果及统计学分析见表1。2.2疾病检出结果分析52 19 2 例新生儿中共筛查出氨基酸代谢疾病、有机酸代谢疾病和脂肪酸氧化代谢疾病等三类遗传代谢病可疑阳性12 9 8 例，召回118 8 例，召回率9 1.53%，确诊遗传代谢病32 例，患病率为1：16 31，三类遗传代谢病的筛查和确诊结果见表2。2.3突变基因检出情况氨基酸代谢疾病共检出5种突变基因，有机酸代谢疾病共检出6 种突变基因，脂肪酸氧化代谢疾病共检出4种突变基因，各种疾病突变基因的检测情况见表3。3讨论MS/MS技术目前是国际公认的高度成熟的检测技术，在检测小分子物质方面具有较高的灵敏度和特异性。MS/MS筛查方法的建立为新生儿遗传代谢病筛查开辟了新的天地，使多数先天性遗传代谢性疾病在新生儿期得以识别。基于此技术检测滤纸干血斑中的多种氨基酸、游离肉碱、酰基肉碱和琥珀酰丙酮是筛查新生儿遗传代谢病的主要方法。MS/MS技术实现了一次检测筛查多种疾病，而传统的新生儿疾病筛查试验方法只能一次检测筛查一种疾病，如检测TSH筛查先天性甲状腺功能减退症，同型半胱氨酸检测可以筛查多种有机酸代谢疾病6-7。MS/MS样品前处理方法包括衍生化(酯化，主要是丁基酯)和非衍生化（非酯化，游离酸）两种方法，衍生化法需要氮气催干或加热增发衍生化试剂，处理过程复杂，易污染环境；而非衍生化样品处理相对简单。基于上述原因，多数实验室多采用非衍生化法处理样品。应用MS/MS检测多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮浓度是筛查氨基酸代谢病、有机酸代谢病和脂肪酸氧化代谢病的主要方法，任一分析物的异常水平可表明各种代谢异常，如游离肉碱和酰基肉碱是脂肪酸氧化、（FAO）障碍和有机酸血症（OA）的疾病标记物；氨基酸是氨基酸血症的标记物；琥珀酰丙酮(SA）是已知的酪氨酸血症1 型的氨基酸代谢障碍的主要标记物。建立正常新生儿氨基酸、肉碱和琥珀酰医学检验与临床2 0 2 4年第35卷第1期医学检验与临床2 0 2 4年第35卷第1期亮氨酸/异亮氨酸(Leu/le)蛋氨酸(Met)鸟氨酸(Orn)苯丙氨酸(Phe)脯氨酸(Pro)酪氨酸(Tyr)缬氨酸(Val)游离肉碱(CO)乙酰肉碱(C2)丙酰肉碱(C3)丙二酰肉碱/3-羟基丁酰肉碱(C3DC/C4OH)丁酰肉碱(C4)甲基丙二酰基肉碱/3-羟基异戊酰基肉碱(C4DC/C5OH)异戊酰基肉碱(C5)异戊烯酰基肉碱(C5:1)戊二酰基肉碱/3-羟基已酰基肉碱(C5DC/C6OH)己酰基肉碱(C6)辛酰基肉碱(C8)辛烯酰基肉碱(C8:1)癸酰基肉碱(C10)癸烯酰基肉碱(C10:1)癸二烯酰基肉碱(C10:2)十二碳酰基肉碱(C12)十二碳烯酰基肉碱(C12:1)十四碳酰基肉碱(C14)十四碳烯酰基肉碱(C14:1)十四碳二烯酰基肉碱(C14:2)3-羟基十四碳酰基肉碱(C14OH)十六碳酰肉碱(C16)十六碳烯肉碱(C16:1)3-羟基一十六碳烯酰肉碱(C16:1OH)3-羟基十六碳酰肉碱(C16OH)十八碳酰肉碱(C18)十八碳烯肉碱(C18:1)3-羟基十八碳烯酰肉碱(C18:1OH)十八碳二烯酰肉碱(C18:2)3-羟基-十八碳酰肉碱(C18OH)琥珀酰丙酮(SA)Medical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.1表152 19 2 例新生儿非衍生化MS/MS法筛查结果统计分析检测指标丙氨酸(Ala)精氨酸(Arg)瓜氨酸(Cit)甘氨酸(Gly)7平均值中位数标准差Cut-off 值范围261.22256.116.745.0311.6510.74341.28330.21118.74114.6020.5119.72102.8298.3440.0439.69171.33172.981.6377.1123.11118.029.6228.523.2022.61.201.110.080.070.180.160.130.110.100.090.030.020.100.080.040.030.050.050.110.100.070.060.060.050.020.020.120.110.040.030.170.160.080.070.030.020.030.022.011.980.120.110.030.030.020.020.680.661.121.100.020.020.240.220.020.020.610.5867.114.823.4190.7530.644.8531.218.1263.228.9029.338.125.200.610.050.060.060.040.010.070.020.020.050.030.030.010.050.030.050.040.010.010.850.060.010.010.220.360.010.100.010.191156351.5607.040150130064300855533502110081420292905530010504500.2840.020.350.070.450.0640.040.4300.020.040.20.010.10.010.150.010.350.020.20.010.1500.150.010.30.010.250.030.40.020.2500.0500.030.456.50.020.450.010.0700.040.241.90.43.50.010.050.10.900.0300.98疾病类型氨基酸代谢疾病有机酸代谢疾病脂肪酸氧化代谢疾病合计表3三类遗传代谢病突变基因检出情况突变基因情况疾病类型例数突变基因构成比%(例)PAH33.33(6/18)MAT1A27.78(5/18)氨基酸代谢疾病18SLC25A1316.67(3/18)ARG15.56(1/18)MMACHC33.33(3/9)MCCC222.22(2/9)POLG11.11(1/9)有机酸代谢疾病9ACADVL40.00(2/5)ASADS20.00(1/5)脂肪酸氧化代谢疾病5ACADM20.00(1/5)SLC22A520.00(1/5)丙酮Cut-off 值是开展遗传代谢病筛查的基础。本研究通过本地5万多例新生儿筛查结果，确定了筛查指标的平均值、中位数、标准差和Cut-off 值，为遗传代谢病筛查提供了实验诊断依据。遗传代谢病患病率和疾病构成存在区域性差异，济宁地区遗传代谢病总患病率为1：16 31，其中患病率最高的是氨基酸代谢疾病，约占遗传代谢病的56.25%，其次为有机酸代谢疾病和脂肪酸氧化代谢疾病，分别占2 8.13%和15.6 3%，与河南省和山东潍坊地区的患病率和疾病构成接近8-9，但脂肪酸氧化代谢疾病患病率低于广州地区0 。提示脂肪酸氧化代谢疾病在南方地区的患病率较高。本次报道的2 0 2 2年度的遗传代谢病患病率和疾病构成与济宁地区2022年以前的报告结果接近-14。近年来，基因检测技术快速发展，越来越广泛地应用于新生儿遗传代谢病筛查领域，从基因层面筛查诊断遗传代谢病，弥补了MS/MS技术存在假阳性（受胎龄、出生体重、营养、用药等因素影响）、假阴性（部分疾病在新生儿期或未发病时代谢Medical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.1参考文献MCCC111.11(1/9)PCCB11.11(1/9)医学检验与临床2 0 2 4年第35卷第1期表2 三类遗传代谢病筛查和确诊结果分析可疑阳性例数召回例数(%)359328(91.33)732661(90.30)207199(96.14)12981188(91.53)ASS116.67(3/18)MUT11.11(1/9)确诊例数(%)18(56.25)9(28.13)5(15.63)32(100.00)产物通常无异常）风险和不能确定遗传代谢病基因型的不足16-1。济宁地区氨基酸代谢疾病常见的突变基因是PAH和MAT1A，有机酸代谢疾病常见的突变基因为MMACHC，脂肪酸氧化代谢疾病常见的突变基因为ACADVL。综上所述，本研究建立了济宁地区新生儿遗传代谢病的MS/MS筛查切值，分析了本地区遗传代谢病疾病构成和热点突变基因，为新生儿遗传代谢病的精准筛查和诊断及早期个性化治疗提供了科学依据。1 Chace DH,Kalas TA.A biochemical perspective onthe use of tandemmass spectrometry for newbornscreening and 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