姜黄素调控KLF2表达对BV2细胞OGD模型中的作用及机制.pdf

医学理论与实践 年第卷第期 姜黄素调控 表达对 细胞 模型中的作用及机制魏建明 曹湘玉 叶紫阳 杨 霞湖南医药学院 湖南省怀化市 摘要 目目的的:研究姜黄素对氧糖剥夺()模型损伤神经元的保护作用并探讨其机制 方方法法:采用 细胞在 环境中培养 模拟神经元缺血缺氧损伤 法检测 小胶质细胞活力 法检测、蛋白的表达水平 法检测炎症因子、的含量 结结果果:与 组相比 组 细胞活力显著降低 蛋白表达下降 蛋白表达增高炎症因子、水平增高(.)/的姜黄素可显著增加 诱导的 细胞活力上调 蛋白表达下调 的表达降低炎症因子的水平(.)而 显著逆转姜黄素对 诱导的 细胞上述保护作用(.)结结论论:姜黄素上调 的表达并降低促炎细胞因子、的水平其机制可能通过抑制 信号通路来实现对神经元缺血缺氧损伤的神经保护作用 基金项目:湖南省大学生创新创业训练计划项目()湖南省中医药科研计划项目()湖南省教育厅科学研究项目()湖南省自然科学基金项目()通信作者:曹湘玉关键词 姜黄素 缺血性脑卒中 中图分类号:文献标识码:/().:().:.().:(.)./(.).(.).:.缺血性脑卒中()占脑卒中总数的 具有高发病率、病死率、致残率、复发率及年轻化趋势等特点已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题 发生机制主要包括炎症反应、氧化应激损伤、铁死亡、细胞焦亡等其中炎症反应是关键机制之一 小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫效应细胞在调控神经炎症方面发挥关键作用 研究表明脑缺血再灌注损伤后脑缺血区小胶质细胞过度激活加剧炎症因子的释放导致脑缺血损伤导致神经元死亡 样因子()是一类具有锌指结构域的核转录因子结合靶基因启动子 富含序列调控相应基因的表达 研究表明激活 能抑制内皮细胞及巨噬细胞分泌的炎症因子、趋化因子的表达发挥抗炎作用 姜黄素()是姜黄根茎的主要生物活性成分有天然的抗氧化性、抗炎特性和抑制凋亡等多种生物学功能 研究证实姜黄素对 具有神经保护作用但具体作用机制仍 年第卷第期医学理论与实践未明确 本研究拟通过()模型模拟神经元缺血缺氧环境诱导 小胶质细胞活化观察姜黄素对 小胶质细胞损伤后的抗炎作用探讨 是否介导姜黄素治疗 的神经保护作用材料与方法.材料.细胞 小鼠源性 细胞(中国科学院典 型 培 养 物 保 藏 委 员 会 细 胞 库 批 号).试剂与仪器 姜黄素(长沙鼎国生物技术有限公司)胎牛血清(美国 公司)细胞培养基(美国 公司)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)(上海吉玛制药技术有限公司)试剂(美国 公司)抗 体()、抗 体()、抗体()酶标仪(美国 公司)、型 细胞培养箱(美国赛默飞公司)、凝胶成像系统(美国 公司).实验方法.细胞培养 细胞采用含./葡萄糖和 胎牛血清的新鲜 培养基在、氧气、细胞培养箱进行培养观察细胞密度达到约 以上进行消化按 比例进行传代培养.建模及处理 将 细胞随机分为正常培养的对照组(组)、氧糖剥夺模型组(组)、姜黄素干预组(组)对照组在培养箱中正常培养细胞模型组加入无糖 培养基在、氮气、环境中培养 然后更换含糖 培养基并置于、环境中孵育 姜黄素组在构建 模型后采用不同浓度(、/)的姜黄素处理 细胞.噻唑蓝()检测 细胞活力 将细胞接种于 孔细胞培养板每孔细胞密度 个每组各孔加入 的 溶液孵育 /离心 吸取并弃去上清液各孔再加 二甲基亚砜()溶解振荡混匀 使用酶标仪在 波长处测定其吸光度()细胞活力(值实验组 值空白组)/值空白组其中 值实验组为实验组的吸光度 值空白组为空白组的吸光度.检测、蛋白表达水平 将 细胞接种于 孔细胞培养板细胞密度为 个/孔加入 细胞裂解液冰上裂解 用细胞刮轻轻刮下细胞收集于离心管中离心 取上清蛋白溶液进行蛋白定量检测采用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后切胶、转膜 脱脂牛奶封闭 加入、抗体()孵育过夜 用 洗膜 次 每 次 加 入 稀 释 后 的 二 抗 溶 液()室温孵育 洗膜 次用化学发光法分析仪显影使用 软件进行条带灰度值分析.细胞转染 将 细胞接种于 孔细胞培养板 细胞密度为 个/孔 后 分别加入 或乱序()孵育 后然后 根 据 转 染 试 剂 说 明 书 步 骤 使 用 试剂进行辅助转染 孵育 检测 表达水平以评价干扰效果 作为内参.检测炎症因子、水平吸取各组细胞上清液至离心管中 /离心 小心吸取上清分装后 冻存 取出 试剂盒平衡至室温按试剂盒内说明进行操作.统计学方法计量资料采用 检验正态性呈正态分布的数据以()表示使用.软件进行统计学分析多组间差异比较采用单因素方差分析组间两两比较采用 法 .认为差异有统计学意义结果.不同剂量姜黄素对 诱导的 细胞活力的影响为观察姜黄素对 诱导的 细胞的保护作用我们将 细胞分为 组分别为 组、组、/组、/组、/组、/组 结果显示(见表):与 组相比 组 细胞活力显著降低(.)而与 组相比 /组、/组均可显著升高 细胞活力(.)本研究还发现在姜黄素的浓度为/时细胞存活率最高 因此本研究后续的实验选择姜黄素的浓度为/表 不同剂量姜黄素对 诱导的 细胞活力的影响()组 别细胞活力/组./组./组./组.组.组.注:与 组比较.与 组比较.姜黄素可调控 诱导的 细胞、的表达为探索 是否介导姜黄素的神经保护作用分别检测 组、组和 /组、蛋白的表达 结果显示(见表):与 组相比 组 蛋白表达水平显著降低(.)蛋白表达水平显著升高(.)而姜黄素可显著增加 诱导的 细胞 蛋白表达(.)降低 蛋白的表医学理论与实践 年第卷第期 达(.)表 各组 细胞的、蛋白表达比较()组 别/组.组.组.注:与 组比较.与 组比较.姜黄素可降低 诱导的 细胞炎症因子、的水平为探讨姜黄素在 诱导的 细胞的神经保护作用机制分别检测 组、组和 /组炎症因子、的水平 结果显示(见表):与 组相比 组炎症因子、的水平显著升高(.)而姜黄素可显著降低 诱导的 细胞、的水平(.)表 各组 细胞的、水平比较(/)组 别/组.组.组.注:与 组比较.与 组比较.显著逆转了姜黄素对 诱导的 细胞的保护作用为进一步研究 在姜黄素保护 诱导的 细胞中的作用采用 干扰 细胞 的表达以评价干扰效果 先将细胞分为 组分别为 组、组和 组 结果显示(见表):与 组相比 可显著下调细胞 蛋白表达水平(.)表 各组 细胞的 蛋白表达比较()组 别 组.组.组.注:与 组比较.随后我们将细胞分为 组分别为 组、组、组、组、组 结果显示(见表):与 组相比 组 蛋白表达显著增高(.)姜黄素组 蛋白表达显著降低(.)处理可显著消除 对 表 达 的 降 低 作 用(.)结果显示(见表):与 组相比 组炎症因子、的水平显著升高(.)而姜黄素可显著降低 诱导的 细胞、的水平(.)处理可显著消除 对、水平的影响(.)表 各组 细胞的、蛋白表达比较()组 别/组.组.组.组.组.注:与 组比较 .与 组比较 .与 组比较.表 各组 细胞的、水平比较(/)组 别 组.组.组.组.组.注:与 组比较.与 组比较.与 组比较.讨论缺血性脑卒中()是由于脑部血管内发生缺血而造成大脑血液供应中断和能量提供不足可促使神经元发生不可逆性损伤坏死 目前主要通过静脉溶栓及血管内再通治疗以挽救缺血区脑细胞并改善神经功能仍有部分患者遗留神经功能障碍 研究表明炎症反应是 的关键发病机制之一而 后炎症反应造成的神经功能损伤与小胶质细胞过度激活密切相关而抑制炎症反应能保护神经元细胞和改善神经功能缺损对 的治疗具有重要的意义据报道姜黄素是姜黄的主要成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用且具有亲脂性容易透过血脑屏障有利于治疗中枢神经系统疾病尤其是脑血管疾病的治疗、是机体重要的促炎细胞因子在炎症和免疫中起关键作用 研究表明急性脑梗死患者血清、水平明显增高且与病情严重程度呈正相关提示、可用于急性脑梗死的程度判断及预后评估 研究表明姜黄素能抑制小胶质细胞的活化及增殖降低炎症因子、的水平对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用 研究表明姜黄素通过抑制 样受体()及炎症因子、的表达进而降低 大鼠脑梗死体积改善神经功能缺损起到脑保护作用 本研究显示姜黄素抑制 诱导的 细胞、的表达减轻炎症反应而发挥神经保护作用与上述研究报道一致 是一种锌指转录因子可调节炎症反应、细胞凋亡和增殖等细胞应激过程参与多种疾病的病理生理发展过程 研究发现急性脑梗死患者血清 下降随着梗死面积增大 水平降低且与病情严重程度呈负相关表明血清 水平是评估急性脑梗死的病情严重程度的重要指标之 年第卷第期医学理论与实践一 研究表明在脑出血大鼠模型中去泛素化酶 表达增高抑制 表达激活核因子()通路引起小胶质细胞活化增强促炎介质、的释放导致脑出血后炎症而下调 表达促进 表达能明显减轻炎症反应 等在大鼠肺组织纤维化模型中发现过表达 可减轻肺间质的破坏和胶原增生抑制促炎因子、的合成与释放减轻炎症反应改善肺组织纤维化和肺组织损伤 研究表明姜黄素能抑制猪脂肪间充质干细胞()的增殖和成脂分化作用与其增加 的表达相关 本研究结果显示姜黄素能上调 表达抑制炎症因子的释放而下调 表达姜黄素产生的上述保护作用也随之消失 由此可见 可能介导了姜黄素对 诱导 细胞损伤的神经保护作用 是一种转录调节蛋白参与调节脑缺血缺氧后炎症反应并释放促炎细胞因子、趋化因子及黏附分子等 徐飞飞等研究发现脑缺血时小胶质细胞中的 被激活后炎性因子、的合成和释放增加同时这些促炎细胞因子又可以激活 从而使该过程在脑细胞间不断扩散加重炎症反应 研究表明 能直接与 及其相关因子 相互作用来抑制 转录活性负调控炎症反应发挥抗炎作用有研究证实姜黄素通过抑制 的激活以减轻阿尔茨海默病()大鼠大脑中的炎性反应提高其学习记忆能力 本研究结果显示姜黄素上调 表达降低促炎细胞因子、的水平可能是通过抑制 信号通路来实现对神经元缺血缺氧损伤的神经保护作用 另有研究表明姜黄素减轻脑梗死后炎症反应其机制可能与其阻断/信号通路有关 结合本研究和其他学者的研究可以确定姜黄素能通过多种信号通路对脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用综上所述姜黄素对 诱导的 细胞发挥神经保护作用可能是通过上调 抑制 信号通路降低炎症因子、的水平以减轻脑缺血再灌注损伤 本研究为探索姜黄素的现代应用提供新靶点也为 治疗提供理论支持、实验依据及带来临床应用前景参考文献 王陇德彭斌张鸿祺等.中国脑卒中防治报告 概要.中国脑血管病杂志():.徐飞飞崔恺王立有等.细辛醚通过调控 通路保护氧糖剥夺/再灌注损伤 细胞的研究.中国药理学通报():.张峰刘利.脑海绵状血管畸形、信号通路的研究进展.中国临床神经外科杂志():.雷丽娟陈渝川陈明华等.样转录因子在动脉粥样硬化中的作用.中国医药生物技术():.王耀宇张雨萌吕天翼等.姜黄素的药理作用及其在脑血管疾病与痴呆防治中的研究进展.中华老年心脑血管病杂志():.孙博宇张世阳赵靖楠等.姜黄素对脑卒中保护机制和作用靶点研究进展.脑与神经疾病杂志():.叶世泰王树超王鑫等.姜黄素对缺血性脑卒中大鼠小胶质细胞增殖的影响.中国医药():.黄明德邹洪兴沈伟峰等.姜黄素下调 抑制缺血性脑卒中炎性应答的实验研究.心脑血管病防治():.():.李广文赵海苹马青峰等.急性脑梗死患者血浆 和 变化的临床意义研究.生命科学仪器():.王强余丹梁霁等.急性脑梗死患者血浆中、和 的表达及意义.中南大学学报(医学版)():.赵松耀尹刘杰李世泽.外周血单个核细胞锌指样转录因子、锌指样转录因子 表达与脑梗死静脉溶栓预后的相关性分析.安徽医药():.金会许秋琳翁伟力等.急性脑梗死患者血清锌指样转录因子、脂蛋白相关磷脂酶 水平及其与病情相关性研究.临床军医杂志():.:.():.刘京霞李方正郇延军等.姜黄素对猪脂肪间充质干细胞成脂分化及 样因子 表达的影响.解剖学报():.()/.:.():.()():./.:.刘涛戴壹范从先等.运动与姜黄素通过 信号通路对阿尔茨海默症模型大鼠的干预研究/中国体育科学学会.第十二届全国体育科学大会论文摘要汇编 专题报告(运动生理生化分会):.张忠胜黄晓敏邓小凤.姜黄素通过调控/信号通路改善脑缺血大鼠神经功能障碍.中医药临床杂志():.收稿日期 (编辑 羽飞)