微生物实验报告：水中细菌总数和大肠菌群的检测.doc

实验六 水中细菌总数和大肠菌群的检测摘 要：本实验以测定公园河流水的细菌总数和大肠菌群的数量，来测定特定地点的水质情况。初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标，判定水体的质量。对该实验点的水源作出了定性的评价，以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。关键字：河流水；细菌总数测定；大肠菌群；EMB培养前言各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数cfu/g(mL)，可用稀释平板计数法检测。水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。特征：G-无芽孢杆菌，兼性厌氧、在3724h内能发酵乳糖产酸、产气。多管发酵法初发酵：适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气；分离培养：伊红美蓝（EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落；复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。材料和方法牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5.0 g，琼脂8g， 蒸馏水1000ml； pH 7.0乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵1：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL（调pH值后加）、水 1000mL、pH 7.27.4三倍浓缩液（3）：除水以外，其余成分取三倍用量分装：1的培养基分装9ml/管， 3的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。灭菌条件：115 ，15min。EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定脱水培养基，按说明书操作，水用量为90%。水源：紫竹院河水 仪器： 高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环 、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。试剂 ： 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂具体实验步骤：1），相关器械的灭菌操作，以及前往紫竹院取少量的样品水。2），按照上述的配料，无菌操作配置培养基。3），细菌总数的测定：取上述样品水，一次稀释10-1,10-2,10-3,3个浓度。对于每个浓度，取1ml稀释液加入冷却好的牛肉膏蛋白胨培养基中，立即混匀，每个浓度重复一次。将平皿倒置培养在37的温箱24h，计算平皿的细菌总数。4），大肠菌群的测定：将样品水稀释成100,10-1,10-2,3个梯度。实验结果与数据分析1，细菌菌落总数组别稀释浓度及菌落数平板菌落状况报告方式选取菌落总数（cfug , cfu/ml10-110-210-311200均小于30最低稀释度下菌落数稀释倍数8.0102400平均8002,大肠菌群总数实验结果原溶液10-110-2ck初发酵产酸+-产气+-EMB紫黑色+-粉红色-革兰氏染色G-+-结论+0阳性管数5003，EMB 数据值计算查表可得，MPN=接种量最大的管：1ml 每100ml水样中菌数最大可能值：230 95%可信限值 上限：700 下限：70水样的分析得出这样的结果：细菌总数：80个/mL大肠菌群数：2300个/L大肠菌群数占细菌总数：2.88%。根据我国生活饮用水卫生标准GB5749-85规定细菌总数不超过100个，已达标。大肠菌群不得超过1000个，超标。经过严格的消毒处理，大肠杆菌不超过10000个，水样达标。结论：从上述的水样分析，我们可以得出此处的河流水污染不是很严重，作为景观水，已经达到了标准，但是此类水是不能作为饮用水的，可能存在一些粪便的污染，导致大肠菌群的数量过高，倘若经过严格的消毒灭菌，才能饮用。实验讨论：1， 大肠菌群的定义是什么？、为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。而由于大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。大量的调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，而且人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。所以大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 2，EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？EMB培养基主要包含以下几种物质：蛋白胨，乳糖，蔗糖，磷酸二氢钾，伊红Y，美蓝，蒸馏水。EMB培养基的机制就是靠微生物在发酵过程中，使培养基发生分解，产生大量的氢离子，从而改变培养基的PH，由于提前添加的指示剂，在PH值的改变下，就会发生颜色的变化，从而鉴定生长的菌种。在检测大肠菌群的时候，蛋白胨提供了氮源，磷酸二氢钾提供了磷元素和钾元素，实验应注意的问题以及改进：1，样品的问题 由于本实验是一个检测的实验，存在一个严格灭菌的过程。从采样，到最后的分析，整个过程不仅不能让其他杂菌污染，而且还得保证样品中本身细菌的总数基本不损失。1），采样的器械必须是经过严格灭菌的，而且其本身的构造不会对微生物的生存造成威胁。2），由于样品会处于密闭的过程，水中的含氧量会慢慢降低，所以对样品的处理应该尽快处理。3），对于样品的稀释不应该用蒸馏水，而应该用灭菌的生理盐水，防止细菌吸水裂解死亡。4），整个接种的操作必须正确，不能杀死细菌，或者引入其他杂菌。2，关于梯度重复的问题本实验设计到一个很关键的问题，那就是梯度重复。对于一个梯度的实验量的统计和处理，我们常常采用重复，来解决其实验误差所造成的影响，但有些时候重复增加了大量的工作量，却没有根本提高实验的准确性，仅以本实验为例。在对细菌数量测定时候，我们每个梯度设置了2个重复，在事实上，第一个梯度的准确性很高，但是在最后一个梯度，可能存在很大的误差。在对一个样品进行定量分析的时候，我们往往要考虑很多干扰它的因数。假定我们所取的样品现在要进行一个梯度的稀释后取样，当前浓度为c，取样的体积为v，那么假定单位体积内只存在一个细菌，则可以建立如下的数学模型：从模型中，我们可以得到最终的表达式：，当取样体积和梯度恒定的时候，我们不难发现，增大取样的重复数，可以提高实验的精确度，但是当c足够大的时候，分子本身就会变得无限小，而分母的一次增量远不如多次的。同理，当c很小的时候，分子变得很大，分母变得很小，这个时候不增加次数，或者调解取样体积，会造成很高的实验误差，所以，本实验的三个精度变量就是梯度，取样体积，梯度重复数。鉴于对本实验的最后分析，我们觉得，在后两个梯度有必要增加重复数，虽然增加了工作量，但是可以有效避免较大的实验误差带来的干扰。同样，在对其他的实验样品处理过程中，原始浓度一般只需要2个重复，随着数量级的增加，其重复的次数也应该发生变化，不应该不变，诸如在在10-3，设置4个重复，而10-5时候，可以设置8个重复，这样可以在追求最简工作量的时候，获得最简的实验结果。参考文献：1 王玉兰. 环境微生物学实验方法与技术.北京，化学工业出版社. 2009,3.2 陈坚. 环境微生物实验技术. 北京：化学工业出版社，20083 钱存柔. 微生物学实验教程（第二版）.北京：北京大学出版社，20084 周德庆. 微生物学教程（第二版）. 北京：高等教育出版社，2002,5.5 沈萍. 微生物学. 北京：高等教育出版社，2000.6 徐全智，杨晋浩. 数学建模（第二版）. 北京：高等教育出版社，2008.