承德地区红景天组培苗消毒条件筛选及启动培养研究.pdf

红景天（Rhodiola rosea冤是景天科（Crassulaceae）红景天属多年生草本植物，是我国传统的藏药之一，其主要入药部位是根、茎1。红景天主要分布在我国华北、西北、西南等地，野生资源较为丰富。我国红景天储藏量也十分丰富，居世界之首2。红景天喜生长在高寒、高海拔地区，非常耐瘠薄，怕高温炎热气候，植株多丛生3-4。作为一种传统药食两用的植物资源，红景天具有多种药理作用。许多国内外学者研究均表明红景天具有耐缺氧、改善睡眠、预防高原病、抗癌等功效5，在西方和亚洲多国十分畅销。近年来，随着红景天出口量、临床用量逐渐增加，野生红景天被过度挖采，造成了资源濒危；又因其受特殊生理因素、严格地理环境等限制，红景天已被列入中国 国家重点保护野生植物名录，为国家重点二级保护野生植物6-8。植物组织培养技术基于细胞的全能性理论，经历脱分化、再分化，最终实现植株再生9。该试验以河北省围场县棋盘山镇野生红景天带腋芽植株作为外植体，通过研究不同消毒剂种类和时间、不同升汞浓度、酒精和升汞不同消毒时间组合对红景天茎段组培成活率的影响，探索最适合其外植体的消毒条件；并通过研究不同种类和浓度生长调节剂对红景天启动培养的影响，探索最适合红景天组培的生长调节剂，旨在为红景天组织培养快速繁殖提供科学支撑。郝梓博1，于水民1，张洪伟1，刘斯超2，尹鑫1，周志杰1，杨志会1，李超1，薛乾鑫1*（1.承德市农林科学院，河北承德 067000；2.河北省承德市蔬菜技术推广站，河北承德 067000）摘要：目的保护承德地区红景天种质资源，提高其增殖效率。方法采用植物组织培养技术，通过研究不同消毒剂种类和时间，不同升汞浓度以及酒精和升汞不同消毒时间组合对红景天茎段组培成活率的影响，探索最适合红景天外植体的消毒条件；通过研究不同种类和浓度生长调节剂对红景天启动培养的影响，探索最适合红景天启动培养的生长调节剂组合配比。结果当 6鄄BA 和 NAA 浓度均为 1.0 mg/L 时，红景天组培苗的分化率和平均株高均为最高，分化率为 80%，平均株高为 3.6 cm。结论75%酒精消毒 10 s、0.1%升汞消毒 8 min 是最适合红景天外植体处理的组合配比；最适合红景天启动培养的培养基为 MS+6 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖+1.0 mg/L 6鄄BA+1.0 mg/L NAA。关键词：红景天；消毒条件；生长调节剂；组织培养中图分类号：S816.7文献标识码：A文章编号：2095-0896（2024）03-005-03HAO Zi-bo et al.（Chengde Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Chengde，Hebei 067000）AbstractObjective To protect Rhodiola rosea germplasm resources in Chengde area and improve theirproliferation efficiency.Method Plant tissue culture technology was used to explore the most suitabledisinfection conditions for R.rosea explants by studying the effects of different kinds and times ofdisinfectants，different concentrations of mercury chloride，and different combinations of alcohol and mercurychloride disinfection time on the survival rate of R.rosea stem tissue culture；By studying the effects ofdifferent types and concentrations of growth regulators on the initiation culture of R.rosea，we aim to explorethe most suitable combination of growth regulators for R.rosea initiation culture.Result When theconcentrations of 6鄄BA and NAA were both 1.0 mg/L，the differentiation rate and average plant height ofRhodiola tissue cultured seedlings were the highest，with a differentiation rate of 80%and an average plantheight of 3.6 cm.Conclusion The combination ratio of 75%alcohol disinfection for 10 seconds and 0.1%mercuric chloride disinfection for 8 minutes is the most suitable for the treatment of R.rosea explants；Themost suitable culture medium for starting cultivation of R.rosea is MS 6 g/L agar 30 g/L sucrose 1.0 mg/L6鄄BA 1.0 mg/L NAA.Key wordsRhodiola rosea；Disinfection conditions；Growth regulator；Tissue cultureisinfection Conditions Screening and Initiation Culture Study of Rhodiola roseaTissue Culture Seedlings in Chengde Area承德地区红景天组培苗消毒条件筛选及启动培养研究园艺与种苗，Horticulture&Seed 2024，44（03）：5-7doi：10.16530/21-1574/s.2024.03.003基金项目院 承德市科学技术研究与发展计划资助项目 野承德地区红景天种质资源保护及离体快繁关键技术研究冶渊202001B005冤曰承德国家可持续发展议程创新示范区建设科技专项渊202202F017冤曰河北省引进国外智力项目野冀北道地中药材节水与高质量种植技术研究与应用冶遥作者简介院郝梓博渊1994-冤袁男袁硕士袁助理研究员袁研究方向院中药资源学遥*通讯作者院薛乾鑫渊1988-冤袁女袁硕士袁助理研究员袁研究方向院中药资源学遥收稿日期院2023-01-09园艺与种苗2024 年表 4不同种类和浓度生长调节剂对玫瑰红景天启动培养的影响处理植物生长调节剂浓度接种数个分化率%平均株高cm6鄄BAmg/LNAAmg/LIBAmg/LD11.00.130732.7D21.01.030803.6D31.00.130673.0D41.01.030602.8表 1不同消毒剂种类和时间对红景天茎段组培成活率的影响处理75%酒精消毒时间s消毒剂筛选成活率%组培苗长势0.1%升汞消毒时间椅min1%次氯酸钠消毒时间椅minA110447褐化较多A210657长势良好A310867长势良好A4101050褐化较多A510440褐化较多A610660长势良好A710853长势良好A8101043褐化较多表 2不同升汞浓度对红景天茎段组培成活率的影响处理75%酒精消毒时间s升汞成活率%组培苗长势消毒时间min升汞浓度%B11080.170长势良好B21080.360长势良好B31080.553长势良好B41080.747褐化较多B51081.027褐化较多表 3酒精和升汞不同消毒时间组合对红景天茎段组培成活率的影响处理75%酒精消毒时间椅s0.1%升汞消毒时间椅min成活率%组培苗长势C110777长势良好C210887长势良好C310973长势良好C420767褐化较多C520877长势良好C620960褐化较多1材料与方法1.1供试材料选择河北省承德市围场满族蒙古族自治县棋盘山镇长势良好、无病害的红景天带腋芽茎段作为外植体。1.2方法1.2.1外植体预处理及消毒条件筛选。将供试红景天植株剪去叶片并剪成 2 cm 左右带腋芽的茎段，放入盛有洗衣粉溶液的塑料烧杯中浸泡 30 min，并用流水冲洗 23 h。将冲洗好的茎段置于无菌操作台上吸干表面水分，用75%酒精消毒 10 s，随后用灭菌水冲净。再分别放入升汞（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%）、次氯酸钠（0.1%）溶液中消毒（4、6、8、10 min），随后用灭菌水冲净并用灭菌纸吸干表面水分，并接入 MS+6 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖培养基中。每组处理接种 10 瓶，重复 3 次，每隔 5 d 观察 1 次组培苗长势，20 d 后统计组培苗成活率。1.2.2不同种类和浓度生长调节剂对红景天启动培养的影响。启动培养以 MS+6 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖作为基本培养基，并分别加入植物生长调节剂 6鄄BA 1.0 mg/L 和 NAA（0.1、1.0 mg/L）、IBA（0.1、1.0 mg/L），将处理好的红景天茎段褐变部分切除并接入配好的培养基中，每种培养基接种10 瓶，重复 3 次，30 d 后统计组培苗分化率和平均株高。1.2.3数据统计方法。该试验使用 Excel 2010 进行数据分析及制表。各指标计算公式如下：平均株高（cm）=株高总和/接种数；分化率（%）=分化个数/接种总数100%；成活率（%）=移栽成活数/移栽总数100%。2结果与分析2.1红景天外植体预处理及消毒条件筛选2.1.1不同消毒剂种类和消毒时间对红景天茎段组培成活率的影响。用 75%酒精和 0.1%升汞、1%次氯酸钠混合消毒处理红景天外植体，结果如表 1 所示。随着 0.1%升汞和 0.1%次氯酸钠消毒时间的增加，组培苗成活率均呈现先上升再下降的趋势。当 75%酒精消毒 10 s、0.1%次氯酸钠消毒 10 min 时组培苗成活率最低，为 43%，并且茎段褐化率较高；当 75%酒精消毒 10 s、0.1%升汞消毒 8 min 时，组培苗成活率最高，为 67%，且组培苗长势良好。所以75%酒精和 0.1%升汞混合消毒组合较适合用于红景天组培苗的消毒。2.1.2不同升汞浓度对红景天茎段组培成活率的影响。用 75%酒精和不同浓度升汞消毒处理红景天外植体，结果如表 2 所示。随着升汞浓度的增加，组培苗成活率呈现逐渐下降的趋势。当升汞浓度为 0.1%时，组培苗成活率最高，为 70%，且组培苗长势良好；当升汞浓度为 1.0%时，组培苗成活率最低，为 27%，且褐变率较高，所以 0.1%是最适合红景天组培苗消毒的升汞浓度。2.1.3酒精和升汞不同消毒时间组合对红景天茎段组培成活率的影响。用 75%酒精和 0.1%升汞不同消毒时间组合处理红景天外植体，结果如表 3 所示。随着 0.1%升汞消毒时间的增加，红景天组培苗成活率呈现先上升再下降的趋势，当 75%酒精消毒 10 s、0.1%升汞消毒 8 min 时，组培苗成活率最高，为 87%，且长势良好。所以 75%酒精消毒 10 s、0.1%升汞消毒 8 min 是最适合红景天组培苗的消毒组合配比。2.2不同种类和浓度生长调节剂对红景天启动培养的影响由表 4 可知，当 6鄄BA 浓度为 1.0 mg/L、NAA 浓度为1.0 mg/L 时，红景天组培苗的分化率和平均株高均为最高，分化率为 80%，平均株高为 3.6 cm。所以最适合红景天启动培养的培养基为 MS+6 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖+1.0mg/L 6鄄BA+1.0 mg/L NAA。63 期（上接第 4 页）参考文献1 柯甫志袁徐建国袁孙健华袁等.日本柑橘新品种冥冥红美人J.浙江柑橘袁2011袁28渊4冤院22-24.2 黄正金袁闾连飞袁樊苏帆袁等.三个兔眼蓝莓品种南京地区引种表现及配套栽培技术J.特种经济动植物袁2022袁25渊1冤院81-83.3 周京一袁李璇袁王秀敏.野红美人冶在上海市的引种表现及配套栽培技术要点J.上海农业科技袁2022渊4冤院76-78.4 杨玉华.试论柑橘优质高产栽培技术探讨J.山西农经袁2018渊3冤院56-60.5 杨万玉.湖北武穴柑橘高产稳产优质栽培关键技术J.果树实用技术与信息袁2016渊7冤院29-31.（责任编辑郑丹丹）3讨论与结论在植物组织培养过程中，造成植物组培苗污染的原因有很多，其中外植体带病菌是主要原因之一10。在组织培养过程中，外植体消毒格外重要，常用的消毒剂有酒精、升汞、次氯酸钠等。选择的外植体不同，对不同种类和浓度的消毒剂的反应也不同11。该研究选择红景天带腋芽茎段作为外植体，通过研究酒精、升汞、次氯酸钠不同消毒组合和不同时间对组培苗成活率的影响来探索最适合红景天无菌体系建立的消毒处理方式。外植体的选择在组织培养过程中是非常重要的部分，不同外植体的选择对组培快繁体系的成功建立影响差异明显11。红景天组培常用的外植体有种子、叶片、茎段等。不同时间采摘的外植体在污染率上也有很大的差异。姚军等12发现苦丁茶组织培养适宜采摘在春天萌发的顶芽或腋芽，污染率较低；范淑芳13用华中枸骨带芽的茎段作为组织培养的外植体时发现，春季刚采摘的中上部枝条效果最好，增殖系数可达 4，这与该研究选择红景天带腋芽茎段作为外植体研究结果一致，选择植株中上部位新梢茎段更适合组培苗的分化和愈伤组织的诱导。姚绍娥等14对海南冬青的种子进行灭菌，先用 75%乙醇浸泡 510 s 后，再用 0.1%升汞分别浸泡 6、8、10、12 min，最后发现升汞最佳消毒时间是浸泡 10 min，灭菌效果最好且种子活性最高；周志坚等15对苦丁茶进行离体培养时发现苦丁茶萌蘖芽茎段用次氯酸钠溶液浸泡无效，用新洁尔灭消毒 15 min 后用无菌水冲洗，再用 0.1%升汞消毒6 min，消毒效率只有 13.3%；但只要预先使用 0.1%氰霉素处理 10 min 就可让消毒率从 13.3%上升至 43.3%。该研究通过选择升汞和次氯酸钠处理外植体，发现当选择带芽茎段作为外植体时，升汞的处理效果要优于次氯酸钠，当用 75%酒精和 0.1%升汞混合消毒处理外植体时，组培苗成活率最高。75%酒精消毒 10 s、0.1%升汞消毒 8 min 是最适合红景天组培苗的消毒组合。陈家龙16对北美冬青“格瑞”进行不定芽诱导发现6鄄BA 与 ZT 和 KT 相比更有利于提高其不定芽的增殖系数，增殖系数为 46；李永欣等17发现美洲冬青在各种培养基上都可以诱导出腋芽，其中以 MS+0.5 mg/L BA+0.1 mg/LIBA作为培养基诱导率最高，为 95.5%，且植株生长健壮。该研究红景天启动培养选择 6鄄BA 作为细胞分裂素，选择NAA 和 IBA 作为生长素，细胞分裂素和生长素单独使用对植株分化的促进效果远不及两者搭配使用，所以选择细胞分裂素和生长素最佳浓度配比对研究红景天启动培养格外重要。当 6鄄BA 浓度为 1.0 mg/L、NAA 浓度为 1.0 mg/L时，红景天组培苗的分化率和平均株高均为最高，分化率为80%、平均株高为 3.6 cm。所以最适合红景天启动培养的培养基为MS+6g/L琼脂+30g/L蔗糖+1.0mg/L6鄄BA+1.0mg/LNAA。参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典渊一部冤M.北京院中国医药科技出版社袁2010院144.2 李君袁陈志袁李建民袁等.红景天的研究进展J.云南农业大学学报袁2007袁84渊1冤院61-64.3 卢杰袁郑维列袁兰小中袁等.长鞭红景天的研究概况J.中国野生植物资源袁2007袁115渊4冤院6-11.4 张建新.长鞭红景天渊Rhodiolafastigiata冤对环境胁迫应答机制研究D.拉萨院西藏大学袁2009.5 董滟.红景天的药用价值与临床应用J.四川中医袁1998渊7冤院17-18.6 胡锦美.红景天初提液的澄清处理与纯化J.福州师专学报袁2000渊6冤院75-80.7 明海泉.红景天甙的合成及药理作用J.中国药学杂志袁1986渊6冤院373.8 张慧云.红景天中络塞维的纯化及抗疲劳特性研究D.无锡院江南大学袁2013.9 孙忠青.植物细胞的全能性及应用J.安徽农业科学袁2013袁41渊21冤院8843-8844.10 陈振光.园艺植物离体培养学M.北京院中国农业出版社袁1996.11 桂晴袁郝明灼袁邹义萍袁等.冬青属植物组培快繁研究进展J.北方园艺袁2022袁519渊24冤院115-122.12 姚军袁张燕玲袁林荣.苦丁茶的组织培养和快速繁殖研究J.广西科学院学报袁1996渊Z1冤院30-34.13 范淑芳.不同外植体及冷藏处理对华中枸骨组织培养的影响J.安徽农业科学袁2014袁42渊7冤院2000-2001.14 姚绍嫦袁谭文明袁蓝祖栽袁等.海南冬青组培快繁体系的建立J.江苏农业科学袁2017袁45渊1冤院22-26.15 周志坚袁翟应昌袁周丽华袁等.苦丁茶的离体培养与快速繁殖J.广东林业科技袁1996渊4冤院24-28.16 陈家龙.冬青渊Ilex chinensis Sims冤离体快繁体系建立及光合自养培养研究D.南京院南京农业大学袁2006.17 李永欣袁王晓明袁陈明皋袁等.外源激素对美洲冬青组织培养的影响J.中南林业科技大学学报袁2010袁30渊1冤院65-68.（责任编辑刘赟）郝梓博等承德地区红景天组培苗消毒条件筛选及启动培养研究7