miR-34c抑制NLRP3炎性小体诱导的小胶质细胞焦亡机制研究.pdf

收稿日期 2021-03-30摇 修回日期 2022-07-27基金项目 安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2019A0364,2022AH051480);中国卒中学会脑血管病全程管理启航基金(2021);蚌埠医学院自然科学研究重点项目(2021byzd128)作者单位 蚌埠医学院第一附属医院 神经内科,安徽 蚌埠 233004作者简介 骆摇 嵩(1986-),男,硕士,副主任医师,副教授.文章编号 1000鄄2200(2023)05鄄0561鄄04基础医学miR鄄34c 抑制 NLRP3 炎性小体诱导的小胶质细胞焦亡机制研究骆摇 嵩,李摇 理,刘东亮,屈洪党摘要目的:探索 miR鄄34c 在调控 NLRP3 炎性小体激活 caspase鄄1 信号通路诱导小胶质细胞焦亡中的作用。方法:观察脂多糖(LPS)联合 ATP 激活小胶质细胞后,通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测 LDH 的释放,以判断小胶质细胞细胞膜的完整性;再对 miR鄄34c 转染后的小胶质细胞在 LPS 和 ATP 激活下,观察小胶质细胞细胞膜变化。采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK鄄8)分别检测 miR鄄34c 转染后的小胶质细胞和未转染的小胶质细胞在 LPS 和 ATP 刺激下活力变化情况。采用蛋白免疫印迹分别检测 LPS+ATP 诱导的小胶质细胞(对照组)中和 miR鄄34c 转染后小胶质细胞(观察组)中的蛋白表达情况,如 NLRP3 炎性小体、caspase鄄1、GSDMD、IL鄄1茁、IL鄄18。结果:LPS+ATP 联合诱导下的小胶质细胞较正常的小胶质细胞,miR鄄34c 表达减少(P 0.01);观察组小胶质细胞 LDH 释放水平较对照组下降(P 0.05)外,其他时间观察组均明显高于对照组(P 0.01);观察组中小胶质细胞中NLRP3 炎性小体、caspase鄄1、GSDMD、IL鄄1茁、IL鄄18 生成较之对照组小胶质细胞中炎性小体相关因子减少(P 0.01)。结论:miR鄄34c 可以抑制 LPS+ATP 诱导的小胶质细胞焦亡,可能通过降低 NLRP3 炎性小体活化及下游 caspase鄄1 依赖细胞焦亡信号通路关键蛋白表达有关。关键词 细胞焦亡;miR鄄34c;NLRP3 炎性小体;小胶质细胞中图法分类号 R 743.3摇 摇 摇 文献标志码 A摇 摇 摇 DOI:10.13898/ki.issn.1000鄄2200.2023.05.001Study on the mechanism of miR鄄34c inhibitingNLRP3 inflammasome鄄induced microglia pyrolysisLUO Song,LI Li,LIU Dong鄄liang,QU Hong鄄dang(Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu Anhui 233004,China)Abstract Objective:To explore the role of miR鄄34c in regulating NLRP3 inflammasome to activate the caspase鄄1 signaling pathwayto induce microglia pyrolysis.Methods:After the observation of lipopolysaccharide(LPS)combined with ATP for activating microglia,the release of lactate dehydrogenase(LDH)was detected using LDH cytotoxicity detection kit to determine the integrity of the microgliacell membrane;then,the microglia transfected with miR鄄34c are activated by LPS and ATP,which was observed for the changes in glialcell membrane;cell proliferation and toxicity detection kit(CCK鄄8)was used to detect changes in the viability of miR鄄34c transfectedmicroglia and untransfected microglia under the stimulation of LPS and ATP;Western blotting was used to detect the protein expressionin LPS+ATP鄄induced microglia and microglia after miR鄄34c transfection,such as NLRP3 inflammasome,caspase鄄1,GSDMD,IL鄄1茁,IL鄄18.Results:Compared with normal microglia,the expression of miR鄄34c in microglia induced by LPS+ATP combination decreased(P 0.01);the LDH release level of microglia in the observation group was lower than that in the control group(P 0.05),while the observation group was significantly higher than the control group at other times(P 0.01);the production of NLRP3inflammasome,caspase鄄1,GSDMD,IL鄄1茁 and IL鄄18 of microglia in the observation group was decreased compared with those in thecontrol group(P 0.01).Conclusions:MiR鄄34c can inhibit LPS+ATP鄄induced microglial pyroptosis,which may be related to thereduction of NLRP3 inflammasome activation and key proteins expression in the downstream caspase鄄1鄄dependent pyroptosis signalingpathway.Key words pyrolysis;miR鄄34c;NLRP3 inflammasome;microglia摇 摇 目前缺血性脑卒中已经成为我国常见的疾病之一,治疗手段有限,致残率高,死亡率高,复发率高,涉及到的病理生理过程复杂。挽救缺血半暗带是缺血性脑卒中治疗成败的关键,而在缺血半暗带区域同时也存在炎症反应,有学者形象地将其比作类似缺血半暗带的“炎症半暗带冶1-5。NLRP3 炎症小体过度表达和产生对于缺血性脑卒中进展加重都有不良影响。有研究发现,当发生大脑中动脉栓塞或165蚌埠医学院学报 2023 年 5 月第 48 卷第 5 期全脑发生缺血时,就会加剧促炎细胞聚集活化和NLRP3 炎性小体过度表达、产生,从而加剧缺血区域脑组织炎症免疫反应6-10。小胶质细胞焦亡在缺血脑组织固有炎症反应中有重要的作用11-12,其分泌炎症因子,召集更多的活化的炎性细胞,进一步加剧炎症反应,其自身焦亡现象导致炎症反应更趋扩大,通过调节缺血半暗带周边的炎症反应,避免M1 小胶质细胞焦亡对于保护缺血半暗带十分重要。MicroRNA(miRNA)是约 18 25 个核苷酸的内源性非编码小 RNA 分子,通过与靶基因的 3忆非翻译区(3忆鄄UTR)结合调控基因表达,促进细胞的增殖、分化和凋亡等过程13。据报道,miR鄄34 家族成员miR鄄34c 能通过调节血管平滑肌细胞钙化、内皮细胞衰老等影响糖尿病引起的血管衰老14。在对缺血性脑卒中病人进行基因分型中发现,miR鄄34c 的表达水平与缺血性脑卒中风险呈负相关关系15。提示 miR鄄34c 可能用于缺血性脑卒中的预测或治疗,但对于 miR鄄34c 的具体调控机制尚不清楚。因此,本研究旨在探讨 miR鄄34c 是否对 NLRP3 炎性小体所诱导的小胶质细胞焦亡具有抑制作用及可能的机制,为后续的缺血性脑卒中神经保护临床应用提供新的治疗靶点和实验依据。1摇 材料与方法1.1摇 细胞培养摇实验所用细胞是人源小胶质细胞HMC3,该细胞株源于北京北纳创联生物技术研究院,并于 37 益、5%CO2、CM8鄄1 培养液条件下进行培养。1.2摇 主要试剂摇miR鄄34cmimics 和 miR鄄NC 购自上海佰欧晶生物科技有限公司;一抗人抗兔 NLRP3 和GSDMD 抗体(武汉爱博泰克公司);ATP 由生工生物工程(上海)公司提供;脂多糖(LPS)由上海源叶公司提供;乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(碧云天公司);SuperScript芋 Reverse Transcriptase 购自赛默飞生物化工制品有限公司;Power Up SYBR GreenMaster Mix 购自赛默飞公司;组织总蛋白提取试剂(T鄄PER tissue protein extraction reagent)和抑制剂(halt proteaseand phosphatase inhibitor cocktail)购自赛默飞公司;BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自上海碧云天公司;引物购自上海生工生物工程公司,CCK8 试剂盒购自迈克生物公司。1.3摇 方法摇1.3.1摇 LDH 检测摇 首先将对数生长期的 HMC3 细胞以 5 伊103个/孔进行铺板(96 孔板)。选择 5 个孔加入含 100 ng/mL LPS 的培养基培养 24 h。含100 ng/mL LPS 的培养基培养 HMC3 细胞24 h 后更换含 5 mmol/L ATP 的培养基培养 30 min,去除上清,PBS 冲洗 2 遍。每孔加入 100 滋L 无血清培养基。细胞培养板放入离心机(400 g)5 min 后,每孔取上清 60 滋L,随后加入 60 滋 LLDH 的检测液并加入到新的 96 孔板中。放入摇床避光混匀 30 min。利用酶标仪以490 nm 波段检测。INT 溶液(1 伊)的配制:首先把 10 伊 的 INT 溶液稀释为 1 伊 的 INT 溶液,稀释为总量为 400 滋L INT(1 伊)溶液,其中稀释比例(1颐 10),试剂现配现用。LDH 检测工作液的配置:取乳酸溶液 400 滋L,INT 溶液(1 伊)400 滋L,酶溶液 400 滋L,进行混匀。1.3.2摇CCK鄄8 检测摇取各组细胞在 96 孔板中以5 000 个/孔的细胞密种板。CCK8 铺板后的细胞更换含 100 ng/mL LPS 的培养基培养 24 h 后,更换含5 mmol/L ATP 的培养基培养 30 min,CCK8 实验的细胞更换完全培养基,每孔 100 滋L。CCK8 实验每孔加入10 滋L 的 CCK8 溶液,培养箱孵育2 h 后再酶标仪于450 nm 检测吸光度,连续检测5 d,每天相同的时间加入 10 滋L CCK8 溶液,培养箱孵育2 h 后进行检测。1.3.3摇Western blotting 检测摇各组细胞培养到80%90%时,胰酶消化后,离心后加入 RIPA 蛋白裂解液,冰上裂解 30 min 后,离心取上清。随后用BCA 定量试剂盒进行蛋白定量,各组总浓度不低于60 滋g/L。根据快速凝胶电泳试剂盒,配制 10%凝胶,加入等量的样品后,上层浓缩胶以 70 V 电泳30 min,下层分离胶 100 V 进行电泳 1.5 h。随后,取胶体,取等面积 PVDF 膜,并用甲醇浸泡 10 s;紧贴到胶体上,加紧转膜夹后,以 200 mA 转膜 2 h(转膜仪冰浴)。转膜结束后,BSA 封闭液封闭 1 h,然后 TPBS 洗膜3 次(10 分钟/次)。一抗孵育过夜,第2 天,TPBS 洗膜 3 次后,二抗孵育 1 2 h,加入显影液,曝光显影。1.4摇 细胞分组摇 按照实验分组,LPS+ATP 联合诱导小胶质细胞作为对照组,miR鄄34c 转染后 LPS+ATP 联合诱导小胶质细胞作为观察组。比较 2 组小胶质细胞的细胞活力和细胞焦亡相关关键因子关系。1.5 摇统计学方法摇采用 t 检验、方差分析和 q检验。2摇 结果2.1摇 miR鄄34c 在 LPS+ATP 联合诱导的小胶质细胞265J Bengbu Med Coll,May 2023,Vol.48,No.5焦亡中表达情况摇正常的小胶质细胞,其 miR鄄34c表达相对较高,达到 1.435 依0.076;而 LPS+ATP 联合诱导下的小胶质细胞,其 miR鄄34c 表达减少,为1.000 依0.066。两者表达差异有统计学意义(t=23.67,P 0.01)。2.2摇 miR鄄34c 转染后小胶质细胞 LDH 释放结果摇对照组小胶质细胞发生焦亡后,LDH 释放达到(0.070 依0.004)。而在观察组中 miR鄄34c 转染后的小胶质细胞,其 LDH 释放呈现下降趋势(0.038 依0.001)。2 组之间差异有统计学意义(t=42.51,P 0.01)。2.3摇miR鄄34c 转染后小胶质细胞细胞活力结果摇观察组小胶质细胞活力随时间延长而明显延长(P 0.01)。而对照组中的小胶质细胞活力亦随时间延长而明显延长(P 0.05)外,其他时间观察组均明显高于对照组(P 0.01)(见表 1)。表 1摇 2 组小胶质细胞活力比较(x 依 s)分组n第1 天第2 天第3 天第4 天第5 天FPMS组内观察组301.00 依0.355.92 依0.35*15.46 依1.29*#29.69 依0.71*#银49.00 依0.71*#银姻19 620.770.010.579对照组301.00 依0.443.83 依0.50*10.56 依0.82*#17.56 依0.63*#银28.11 依1.27*#银姻5 734.520.050.010.010.010.01摇 摇 q 检验:与第1 天比较*P 0.05;与第2 天比较#P 0.05;与第3 天比较银P 0.05;与第4 天比较 姻P 0.052.4摇 2 组小胶质细胞内焦亡相关蛋白表达变化摇与对照组相比,观察组 NLRP3 炎性小体、caspase鄄1、GSDMD、IL鄄1茁、IL鄄18 表达均有明显降低(P 0.01)(见表 2)。表2摇 2 组小胶质细胞内焦亡相关蛋白表达变化(x 依s;pg/mL)分组nNLRP3 炎性小体caspase鄄1GSDMDIL鄄1茁IL鄄18观察组303.12 依0.421.99 依0.261.76 依0.581.83 依0.03 2.61 依0.49对照组304.92 依0.853.32 依0.693.97 依0.084.30 依0.36 3.48 依0.50t10.409.8820.6737.436.81P0.010.010.010.010.013摇 讨论摇 摇 缺血性脑卒中有着复杂的病理生理过程,减轻缺血半暗带区域过度的炎症反应,对于保护和挽救缺血半暗带有着重要的意义。小胶质细胞在中枢神经系统炎性反应中占据着重要的作用,其过度活化,通过级联式地激活更多炎性细胞活化及其炎性因子释放,从而加剧缺血半暗带损伤16-19。目前研究20显示,小胶质细胞除了凋亡和坏死两种调控方式之外,还存在细胞焦亡的现象。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应,这种反应不同于传统意义上的细胞凋亡和细胞坏死,是一种既有凋亡的程序型特点,也具有炎性坏死特点的新的细胞死亡方式。之所以说其具有凋亡的某些特点,是因为细胞焦亡过程中存在细胞核逐渐皱缩,DNA 断裂等发生;但又不全如凋亡最终悄无声息,而是在后期如坏死一样,发生细胞的肿胀破裂,大量细胞内容物从细胞膜中漏出,引起局部剧烈的炎症反应,故而把这种兼具细胞凋亡和坏死两种特点的细胞死亡方式称为细胞焦亡21。细胞焦亡在感染性疾病、神经系统变性疾病和动脉粥样硬化发生发展中均扮演着重要的角色22-24。以往研究14发现 miR鄄34 家族成员 miR鄄34c 能通过调节血管平滑肌细胞钙化、内皮细胞衰老等影响糖尿病引起的血管衰老。在对缺血性脑卒中病人进行基因分型中发现,miR鄄34c 的表达水平与缺血性脑卒中风险呈负相关关系15。表明 miR鄄34c 可能用于缺血性脑卒中的预测或治疗,但对于 miR鄄34c 的具体调控机制尚不清楚。本研究中,发现了类似结果,即正常的小胶质细胞 miR鄄34c 表达高于LPS+ATP 组,提示 miR鄄34c 对于小胶质细胞具有保护性意义。在对 miR鄄34c 转染后的小胶质细胞膜完整性及其细胞活力检测中,均优于 LPS+ATP 诱导组小胶质细胞,也进一步证实 miR鄄34c 对于小胶质细胞存活,主要是抑制细胞焦亡具有保护意义。另外,有研究指出在缺血性脑卒中损伤下,Pro鄄caspase鄄1 被损伤相关分子模式(damage鄄associatedmolecular patterns,DAMPs)激活的炎症小体 NLRP3裂解成活性 caspase鄄1,并诱导细胞膜穿孔使细胞溶解、死亡,胞内物质通过不完整的胞膜外释引起炎症反应25。caspase鄄1 还可以促进促炎因子释放到细胞外,募集更多的炎症细胞聚集,扩大炎症反应26。ZHOU 等27在研究大鼠缺血性脑卒中发现,通过抑制小胶质细胞中 NLRP3 的表达,可以显著减弱小鼠365蚌埠医学院学报 2023 年 5 月第 48 卷第 5 期体内 caspase鄄1 激活,对脑缺血性脑损伤起到保护作用。因此我们进一步提出问题,即 miR鄄34c 是否通过调控 NLRP3 炎性小体表达,介导 caspase鄄1 活化,从而降低小胶质细胞焦亡及相关炎症因子释放这一信号途径而发挥作用。本研究对 2 组小胶质细胞进行了焦亡相关蛋白及因子表达分析,结果显示 miR鄄34c 转染小胶质细胞与 LPS+ATP 诱导下的细胞焦亡相关蛋白比较,其 NLRP3 炎性小体、caspase鄄1、GSDMD、IL鄄1茁、IL鄄18 生成均下降,进一步提示 miR鄄34c 可能通过调控 NLRP3 炎性小体表达,介导caspase鄄1 活化,从而抑制小胶质细胞焦亡。综上所述,miR鄄34c 可能通过抑制小胶质细胞NLRP3 炎性小体活化,从而抑制经典的 caspase鄄1 活化依赖的小胶质细胞焦亡发生。参考文献1摇JACK 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