基于固体核磁共振多次交叉极化的定量检测优化技术.pdf

Vol.40 No.2第40 卷第2 期2023年0 6 月Chinese J Magn Reson,2023,40(2):136-147波谱学杂志Chinese Journal of Magnetic ResonanceJun.2023doi:10.11938/cjmr20223039基于固体核磁共振多次交叉极化的定量检测优化技术董洪春1#，张志兰1#，王宁3，唐丹丹1，裘子慧1，舒婕1,2*1.苏州大学材料与化学化工学部，江苏苏州2 1512 3；2.苏州大学分析测试中心，江苏苏州2 1512 3；3.上海交通大学分析测试中心，上海2 0 0 2 40摘要：多次交叉极化（multiCP）是一种耗时短、可行性高的固体核磁共振定量方法，近年来受到了广泛的关注.通过研究发现，multiCP实验参数的设置依赖于样品及基团的属性对于样品属性差异较大的体系，其获取定量结果时的实验参数条件较苛刻针对这一问题，本文结合LGCP（L e e-G o l d b u r g c r o s s p o l a r i z a t i o n）技术，提出了一种multiCP的优化方案，命名为MLGCP-1.本文以L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸/L-缬氨酸的混合物作为模型样品，并通过与multiCP进行对比，探讨MLGCP-1方法定量分析的可行性与优势首先，通过对L-丙氨酸、L-缬氨酸样品基团比例的测量，发现MLGCP-1实现定量检测的参数一交叉极化接触时间（tp）范围较multiCP更宽，可由1.01.3ms增至0.8 2.0 ms.此外，通过对L-缬氨酸、L-丙氨酸/L-缬氨酸中特定基团间积分比值的分析发现，MLGCP-1与multiCP相似，同样受到13C-H交又弛豫时间（TcH）差异度的影响。即TcH差异度越大，可定量的tp参数范围越小但与multiCP相比，MLGCP-1对tp的宽容度更高。即对于相同的样品体系，MLGCP-1可定量的tp范围更宽总之，与multiCP相比，MLGCP-1可实现定量表征的实验参数范围更宽，更适用于表征属性差异较大的样品体系。关键词：固体核磁共振（SSNMR）；交叉极化；多次交叉极化；定量方法；氨基酸中图分类号：0 48 2.53The Improved Solid-state NMR Quantitative Method on the Bases ofMultiple-cross Polarization TechniqueDONG Hongchunl#,ZHANG Zhilanl*,WANG Ning,TANG Dandan,QIU Zihuil,SHU Jiel.2*1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Materials Science,Soochow University,Suzhou 215123,China;2.Analysis and Testing CenterSoochow University,Suzhou 215123,China;3.Instrumental Analysis Center,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,ChinaAbstract:Recently,multiple-cross polarization(multiCP)has attracted much interest owing to its favorable performance asa solid-state nuclear magnetic resonance quantitative method.Relating investigations revealed that the setup of multiCPparameters relies on the properties of the samples.Diverse types of samples require different parameters.To improve thetolerance to sample properties,an improved method named MLGCP-1 was proposed in this work,which employed Lee-Goldburg cross polarization technique.L-alanine,L-valine and their mixtures were chosen as model samples to evaluate theperformance of MLGCP-1 method.multiCP experiments were also conducted for comparison.Based on the test of moleculargroup ratio,it was revealed that the range of contact time tp of MLGCP-1 was larger than that of multiCP,which improvedfrom 1.01.3 ms to 0.82.0 ms.Moreover,according to the study of L-valine and mixtures,it was revealed that the range oftp was influenced by the difference of cross relaxation time TcH.Large Tch difference limited tp range for quantification.Thismanner was in accordance with multiCP.However,the tp range of MLGCP-1 was markedly enlarged in comparison withmultiCP,presenting higher tolerance to the sample properties.Keywords:solid-state nuclear magnetic resonance(SSNMR),cross polarization,multiCP,quantitative method,amino acid收稿日期：2 0 2 2-11-2 4；在线发表日期：2 0 2 3-0 3-14基金项目：国家自然科学基金资助项目(2 16 7 3148)；2 0 2 1年度江苏省大型科学仪器开放共享自主研究课题(TC2021A027).通信作者(Corresponding author):*Tel:[phone],E-mail:#共同第一作者文献标识码：A第2 期引言固体核磁共振（solid-state nuclearmagneticresonance，SSNM R）技术不仅用于表征材料分子的结构和动态学行为，还可以实现多种定量信息的检测1,2 1传统SSNMR定量技术是直接激发高功率去耦（directpolarizationwithhighpowerdecoupling，D P）技术3 该方法实现定量的关键是D/5Ti（D 为弛豫等待时间，Ti为检测核的自旋晶格弛豫时间）.然而对于多数样品，尤其是具有刚性结构的样品，13C的T较长且自然丰度低定量检测时，DP实验耗时较长，往往需要花费十几个小时甚至数周的时间4 近年来，为了实现短时间内SSNMR的定量检测，科研工作者们先后提出了数种实验技术与方法5-15 在这些方法中，多次交叉极化（multiple-cross polarization，mu l t i CP）技术由于具有较高的普适性和可行性，受到了广泛的关注198 5年，Gerstein和Dybowskil16)在交叉极化（cross polarization，CP）技术的基础上，首次提出了多次交叉极化的概念.1990 年，Mehring课题组基于此技术提出了较DP方法耗时更短的SSNMR定量方法，该方法通过多次交又极化过程，使样品体系中各种不同基团待检测核的CP效率逐步提升并趋于相同，从而实现谱图中谱峰积分的定量17 ；2 0 14年，Schmidt-Rohr课题组将该方法命名为multiCP，系统地探讨了H射频场强度对定量结果的影响，并应用于土壤腐殖质的成分分析13；2 0 17 年，该课题组对multiCP技术进行了优化，通过使用18 0 补偿脉冲技术降低90 脉冲共振偏置和激发脉宽不准确所导致的信号损失此外，Hirschinger等18,19 基于-甲酸钙、二茂铁和丙氨酸的multiCP实验数据，并结合理论计算，讨论了魔角旋转速率对multiCP谱图信噪比和测量结果准确性的影响随着对multiCP方法的不断研究与推广，多个课题组相继使用该方法开展定量相关的表征与研究，从而获取多相高分子的结晶度2 0 、混合物的组分含量2 1,2 2 、分子基团的比例与结构2 3-2 5 等信息。目前，multiCP 技术在农业2 0,2 4、矿物2 3,2 5、环境2 等领域都表现出潜在的应用价值.实现multiCP准确定量的关键是如何依据样品的属性合理地设置实验参数.2 0 2 1年，本课题组以L-丙氨酸、L-缬氨酸和二者混合物为模型样品，深入探讨了multiCP实验的测量结果受样品属性的影响2 6 ，发现multiCP实验参数一交叉极化接触时间（tp）的设置依赖于样品及基团的13C-H交叉弛豫时间（TcH）对于TcH值相近的基团或体系，其获取定量结果时的实验参数设置相似.然而，对于TcH值差异较大的体系，其获取定量结果时的实验参数条件较苛刻。此外，当体系氢原子核在自旋锁定场下的自旋晶格弛豫时间（T号）较短时，同样会影响multiCP测试结果的准确性针对这一问题，本文结合LGCP（L e e-G o l d b u r g c r o s spolarization）同核去耦技术2 7.2 8 ，提出了一种multiCP的优化方案，命名为MLGCP-1以L-丙氨酸、L-缬氨酸和两者混合物为研究体系，对比探讨MLGCP-1和multiCP对体系属性和实验参数的宽容度，总结MLGCP-1作为定量方法的参数设置规律与优势。董洪春等：基于固体核磁共振多次交又极化的定量检测优化技术1371实实验部分1.1订试剂与样品制备L-丙氨酸和L-氨酸（A.R.级）粉末样品购于北京伊诺凯科技有限公司，均直接使用，未进行进一步处理.L-丙氨酸和L-缬氨酸混合样品的制备过程：分别以L-丙氨酸和L-缬氨酸摩尔比为1:1、1:3和3:1的比例称取一定质量的两种粉末样品，置于研钵中反复研磨，使两者混合均匀.将样品填充在外径为3.2 mm的ZrO2转子中，均匀压实，进行SSNMR实验.1381.2SSNMR 实验所有实验均在配备3.2 mmH/F/XMASDVT三共振探头的BrukerAVANCEIIHD400WB固体NMR波谱仪（瑞士，布鲁克公司）上进行 H和13C的共振频率分别为40 0.2 5MHz和10 0.6 5MHz，魔角旋转速率为10 kHzH 和13C的90 脉冲宽度分别为3.2 s和3.6 s，所对应的射频场强度分别为7 8 kHz和6 9kHz.所有CP过程中H的最大自旋锁定场强度为7 8 kHz，脉冲形状为功率由10 0%衰减至50%的ramp-CP脉冲2 9，13C的自旋锁定场强度为7 8 kHz，采样期间使用TPPM对 H去耦30 。所有的13CNMR谱图中，13C谱峰的化学位移均以四甲基硅烷（TMS）为参比，以金刚烷作为二次标样，将分子中CH基团13C谱峰的化学位移（8 c38.484）进行定标31,32 1.3数据分析各基团Tch相对差异度 S=（A-A)/A *10 0%，其中，A,代表TcH中较大的值、A 代表Tcn中较小的值，L-丙氨酸和L-缬氨酸纯净物分子基团比例的百分误差计算方法：首先对分子内各基团谱峰积分值进行归一化，I=I,/lave，其中，lave=,/n，n 为含13C基团的种数，I,为分子内某一基团的积分值。之后，依据公式 P=(-I)/I1*100%计算归一化积分面积的实验值相对于其理论值（I）的百分误差，其中理论值I为分子内各基团碳原子的摩尔比.涉及多个基团时，则取百分误差的最大值.混合物中各组分含量的百分误差的计算公式为 M=(P-)/Q*100%，其中，0 P=1。/(l。+1)为实验测得混合物中组分的摩尔含量，I。、I,分别代表混合物中各组分的特征峰积分值，为组分的实际摩尔含量.2丝结果与讨论2.1LGCP对体系弛豫时间的影响及multiCP方法的优化方案图1(a)为本文提出的MLGCP-1实验脉冲序列示意图，该方法基于multiCP脉冲序列示意图如图1(b)13,并在最后一次CP后引入LGCP技术2 7,2 8 ，使 H的磁化矢量锁定在魔角方向上CP过程中，LG同核去耦技术削弱了氢原子核之间的偶极耦合作用，从而影响了 H13C的CP效率在分子体系中，非季碳受到的影响更强，TcH明显增长；而对于季碳原子，由于没有通过化学键与氢原子直接相连，TcH值大于非季碳TcH，且由于受到氢同核去耦技术的影响较小，因而TcH无明显变化因此，LGCP技术的引入，缩小了非季碳与季碳原子核之间TcH的差异度与此同时，由于氢原子核之间的偶极耦合被削弱，抑制了氢原子核间的自旋扩散作用，因而抑制了射频场下的氢自旋晶格弛豫作用，即T被延长33。此外，MLGCP-1实验中，LGCP的次数仅为一次，且设置在multiCP的最后其主要原因为：LGCP过程中，氢原子核间的偶极耦合作用受到抑制，不利于局部质子密度较低的碳原子核（如L-丙氨酸中的13C=O）的H13CCP作用，多次的LGCP会导致各种13C的CP效率降低，且CP效率很难趋于一致；同时，逐次CP过程中，前几次的CP过程受tp参数的影响较小因为每次 H13CCP的不足可以通过下一次的CP过程进行补偿，从而实现13C信号的逐次增强而最后一次CP过程的tp参数设置十分重要，较长的tp会导致明显的TH作用，因而LGCP放在最后可有效抑制T的影响.波谱学杂志第40 卷第2 期董洪春等：基于固体核磁共振多次交叉极化的定量检测优化技术139DecouplingHd909013C90Loops=n-2图1(a)MLGCP-1实验脉冲序列示意图，相应的相循环为：=,-y：2=x；=-y,；4=x,x,-x,-x,y,-y,-;Ds=-y,y,y,-y,x,-x,-x,x;D=y,-y,-,y,-x,x,x,-x;D=-y;Dg=y;DRe=x,-x,-x,x,y,-y,-y,y;(b)multicP实验脉冲序列示意图，相应的相循环为：=,-；2=x3=-y,y；4=x,x,-x,-x,J,J，-,-；s=-,y,-y,x,-x,-x,x;6=y,-y,-y,y,-x,x,x,-x;DRee=X,-x,-x,x,y,-y,-y,yFig.1(a)The pulse sequence of MLGCP-1 method with the following phase cycles:1=y,-y;2=x;D;=-y,y;4=X,X,-x,-x,y,y,-y,-y,s=-y,y,y,-y,x,-x,-x,x;D6=y,-y,-y,y,-x,x,x,-x;D=-y;Dg=y;DRe=x,-x,-x,x,y,-y,-y,y;(b)multiP pulse sequence with following phase cycles:1=y,-y;D2=x;D3=-y,y;4=x,x,x,x,y,y,-y,-y;Ds=-y,y,y,-y,X,-x,-x,x;D6=y,-y,-y,y,-x,x,x,-x;DRec=X,-x,-x,x,y,-y,-y,y实验首先选取L-丙氨酸和L-缬氨酸两种固体样品，对比了绝热CP实验ramp-CP和LGCP过程中，分子各基团的Tcn和TB：L-丙氨酸和L-缬氨酸的分子化学结构及13CCPNMR谱如图2 所示，Tcn和TB测量值见表1与ramp-CP相比，两种样品在LGCP过程中的TB均有明显地增长L-丙氨酸由1.7 ms增至12.8ms，L-缬氨酸由2.5ms增至2 4.3ms此外，两种样品中各基团TcH的差异度降低L-丙氨酸各基团间，TcH最大差异度由8 8.3%降为55.0%；L-缬氨酸各基团间，TcH最大差异度由8 8.6%降为7 1.0%.基于近期的研究工作2 6 发现，体系间TcH的差异度和TH值是影响multiCP实验参数设定的主要因素；TcH差异度较小且TH值较大时，multiCP的实验参数范围较宽，实验可行性高。由此可见，结合LGCP技术有望提高multiCP实验对参数设置的宽容度.(a)Decoupling“H9090190901(a)90-35.3490%35.3ReceiverAA9013C万(b)90a2090Loops=n-1(b)90Receiver42NH23OHNH2L-alanine*250图2(a)L-丙氨酸和(b)L-缬氨酸分子化学结构示意图及13CCPNMR谱，谱峰依据结构示意图中的序号进行归属Fig.2 The structure schemes and 13C CP NMR spectra of(a)L-alanine and(b)L-valine.Peaks are assigned using labelswith respect to the structural schemes为了进一步评估MLGCP-1方法的可行性，本文仍然以L-丙氨酸和L-缬氨酸为模型样品，通过改变 tp，绘制了的ramp-CP、L G CP、m u l t i CP和MLGCP-1四种方法的CP动力学曲线。L-丙氨酸的CP动力学曲线如图3(a)(d)所示。与ramp-CP、L G CP和multiCP相比，MLGCP-1 所采集的L-丙氨酸各基团的归一化积6-OH568L-valine*200150100cchemical shift850ppm250200150cchemical shift10050ppm140波谱学杂志表1L-丙氨酸和L-缬氨酸分子中各基团在ramp-CP和 LGCP条件下的Tch和T,值Table 1 TcH and TH values of L-alanine and L-valine measured under ramp-CP and LGCP conditionsLGCPSampleCarbonsL-alanine123L-valine45678第40 卷ramp-CPTi,H/msTcH/ms977.10.1700.0420.360718.50.1740.0360.0330.2900.154Tg/ms1.72.5TcH/ms0.3870.1740.3310.4140.1570.1200.2400.374TIg/ms12.824.31.00.84000000.6880000000D口口0.4口口0.2A13020.00.01.0,0.80.60.40.20.0-0.20.4-0.6-0.8-1.010.0图3L-丙氨酸粉末样品中CH3、CH 和CO三种基团的IH13C交叉极化动力学曲线图，使用的技术分别为(a)ramp-CP、(b)LGCP、(c)mu l t i CP和(d)MLGCP-1;L-丙氨酸的归一化积分比例较理论值的百分误差，使用的技术分别为(e)ramp-CP、(f)LGCP、(g)m u l t i CP和(h)MLGCP-1.红色背景区域实验百分误差小于5%Fig.3The cross polarization H-13C dynamic curves ofCH3,CH and CO groups in L-alanine by using the schemes of(a)ramp-CP,(b)LGCP,(c)multiCP and(d)MLGCP-1;The percentage errors of L-alanine were calculated according to the normalized peak integrals,by using the schemes of(e)ramp-CP,(f)LGCP,(g)multiCP and(h)MLGCP-1.The red background highlights the regions withpercentage errors less than 5%分面积受t影响更小。通过对谱峰积分值的计算，可得到归一化积分面积比值的实验值较其理论值的百分误差L-丙氨酸的百分误差受tp的影响如图3(e)(h)所示ramp-CP和LGCP在所测试的 tp条件下均不可定量；对于multiCP，仅当tp为0.9 1.2 ms时，对应的谱峰归一化积分面积的比值较理论值的百分误差小于5%；对于MLGCP-1，L-丙氨酸三个基团的动力学曲线在tp为0.8 2.0 ms范围内几乎重合，且实验百分误差均小于5%.L-氨酸实验数据表现出相同的趋势：如图4所示，随着multiCP方案中LGCP技术的引入，实验方法对tp的宽容度提升对于L-缬氨酸，ramp-CP和LGCP无法实现定量检测；而multiCP仅当1.0A)ramp-CP20.00.51.0p(ms)(a)ramp-Cp0.51.0p(ms)(e)1.00.8009888口。口口1.52.01.52.0n1.0-AAA40.6口0.4口0.2A1LCCP0232.00.00.00.5p(ms)(b)1.010.80.60.40.20.0-0.2-0.4-0.8-1.00.0000808880.2A！multicp1.01.5LGCP0.51.0f(ms)(f)3OHNHMLGCP-10.00.5(ms)(c)1.00.80.60.40.20.0-0.2-0.4-0.81.52.01.05%multicp0.51.0p(ms)(g)1.52.00-0.4-0.81.52.06.01.00.80.60.40.20.0-0.20.5p(ms)(d)1.4s、t p 0.7 m s 的实验参数范围内，MLGCP-1实验误差均小于5%；与multiCP相比，紫色区域的面积大大增加在CP实验中，足量的 H磁化矢量恢复到热力学平衡态是进行下一次CP的前提当ta过短时，为下一次CP所准备的 H初始磁化矢量过小，即使后续开展多次H一13CCP，仍很难使13C信号达董洪春等：基于固体核磁共振多次交叉极化的定量检测优化技术(ne)sjelbaiu!1.04440.8+0.60.4口0000ramp-CP0.51.0(ms)(a)ramp-CP0.51.01.5(ms)(e)141(n)s1.00.80.6：00000.2LGCP1.52.02.0(n00.80.6三0.4+用0.2+5之0.06.00.00.5(ms)(b)1.010.80.40.20.0-0.2-0.4-0.8NH2457OH687060.2multicp20.0.01.01.52.030.6LGCP-0.80.51.0p(ms)(f)80480.51.01.5,(ms)(c)1.010.80.60.40.20.0-0.2-0.41.52.0MLGCP-12.00.5(ms)(d)1.010.80.60.40.20.0-0.25%-0.4multicP-0.80.51.01.5p(ms)(g)1.0HIIIIIIH5%MLGCP-12.00.5p(ms)(h)1.52.01.01.52.0142到持续增强并趋于一致；而当ta满足1 2 TH时，6 3%8 6%的H磁化失量恢复到平衡态34.该实验条件下可实现13C信号的逐次增强，从而实现MLGCP-1在更宽的tp范围内定量.波谱学杂志第40 卷COMLGCP-13.02.51.51.00.500.51.01.52.0,(ms)(a)comulticp3.02.51.51.00.500.51.01.52.0(ms)(e)图5使用MLGCP-1方法采集并绘制的L-丙氨酸中(a)CO、(b)CH、(c)CH;基团归一化积分值随实验参数 tp、t a 变化的二维投影图，以及(d)相应实验参数条件下的百分误差投影图.使用multiCP方法采集并绘制的L-丙氨酸的(e)CO、(f)CH、(g)CHs基团归一化积分值随实验参数tp、t a 变化的二维投影图，以及(h)相应实验参数条件下实验结果的百分误差投影图Fig.5The two-dimensional projection diagrams of normalized integrals of(a)CO,(b)CH,(c)CH,in L-alanine using MLGCP-1method,the normalized integrals was modulated by the experimental parameters tp and ta.(d)The two-dimensional projection ofthe percentage errors under corresponding experimental parameters.multiCP method was employed for comparison.Thecorresponding diagrams were plotted in(e)-(h)CHMLGCP-13.02.51.51.00.500.51.01.52.0,(ms)(b)CHmulticp3.02.51.51.00.500.551.01.52.0(ms)(f)CH,MLGCP-13.02.51.51.00.500.51.01.52.0f,(ms)(c)CH,multicp3.02.592.01.51.00.500.551.01.52.0(ms)(g)MLGCP-11.003.070.900.800.700.600.500.400.300.200.101.000.900.800.700.600.500.400.300.200.100.2000.1852.50.1700.1550.1400.1251.50.1100.0951.00.0800.50.06500.51.01.52.0,(ms)(d)multicp3.02.51.51.00.500.51.01.52.0(ms)(h)0.0500.2000.1850.1700.1550.1400.125-0.1100.0950.0800.0650.050然后，将ta固定为2 s，通过逐次改变tp和n两个实验参数，来进一步探讨MLGCP-1定量性对交叉极化次数n的依赖性，所绘制的积分值投影图及对应的误差投影图如图6 所示.通过对该组数据的分析发现，MLGCP-1可定量的tp范围受n的影响规律与multiCP相似即随着n的增大，可定量的tp范围逐渐增宽当n3时，MLGCP-1方法具有可用于定量的t范围如下：n=3时，百分误差值小于5%的tp范围为1.21.8ms；n=4时，百分误差值小于5%的tp范围为0.8 2.0 ms；n=6 时，可定量tp范围增至0.5 2.0 ms.而对于multiCP，n=3时，百分误差值小于5%的tp范围为1.3 1.4ms；n=4时，百分误差值小于5%的tp范围为0.9 1.2 ms；n=6 时，可定量tp范围为0.6 1.0 ms.2.3样品体系TcH和TH值对MLGCP-1定量结果的影响近期的研究2 6 发现，在满足ta和n的设置条件下，multiCP实验参数tp的设置依赖于样品的属性参数TcH和T对于纯净物和均相体系而言，不同基团的Tch的差异度是影响实验参数tp设置的关键，Tc差异度越大，t范围越小；而对于混合物体系或多相体系，需同时考虑各个基团的TcH和各组分的T对实验参数节的影响.第2 期董洪春等：基于固体核磁共振多次交叉极化的定量检测优化技术143COMLGCP-1655432200.51.01.52.0t(ms)(a)6COmulticp543200.51.01.52.01(ms)(e)图 6 使用MLGCP-1方法采集并绘制的 L-丙氨酸中(a)CO、(b)CH、(c)CH 3基团的归一化积分值随实验参数 tp、n 变化的二维投影图，以及(d)相应实验参数条件下实验结果的百分误差投影图使用multiCP方法采集并绘制的L-丙氨酸的(e)CO、(f)CH、(g)CH;基团的归一化积分值随实验参数 tp、n 变化的二维投影图，以及(h)相应实验参数条件下实验结果的百分误差投影图Fig.6 The two-dimensional projection diagrams of normalized integrals of(a)CO,(b)CH,(c)CH,in L-alanine using MLGCP-1method.The normalized integrals was modulated by the experimental parameters tp and n.(d)The two-dimensional projection ofthe percentage errors under corresponding experimental parameters.multiCP method was employed for comparison.Thecorresponding diagrams were plotted in(e)(h)CHMLGCP-1654320.51.01.52.0(ms)(b)6CHmulticp54320.51.01.52.0,(ms)(f)CH,MLGCP-16532200.51.01.52.0(ms)(c)6CH,multicP543200.51.01.52.0(ms)(g)MLGCP-11.0060.900.800.700.600.500.400.300.200.101.000.900.800.700.600.500.400.300.200.100.2000.18550.1700.1550.140二0.1250.11030.0950.08020.06500.51.01.52.00.050(,(ms)(d)6multicp543200.51.01.52.0(ms)(h)0.2000.1850.1700.1550.1400.1250.1100.0950.0800.0650.050为了与multiCP方法对比，探讨MLGCP-1受样品属性的影响规律，本文选取L-缬氨酸作为模型样品，首先评估各个基团间TcH差异度对MLGCP-1实验参数tp设置的影响L-氨酸分子中含有5种13C基团，如图2(b)所示。ramp-CP条件下相同种类基团之间的TcH值相近，例如同为CH基团的碳5、6；而不同种类基团之间的TcH值相差较大，例如分别为CO、C H 和CH3的碳7、5和8.实验选取了三组13C进行研究，分别是5和6、5和8、6 和7，ramp-CP条件下对应的TcH差异度依次为8%、7 6%、8 9%.MLGCP-1实验的百分误差如图7(a)(c)所示，multiCP实验的百分误差如图7(d)(f)所示对于5和6 两个基团，MLGCP-1定量结果的百分误差始终小于5%，与multiCP结果基本一致；对于TcH差异度较大的5和8、6和7，MLGCP-1可定量的tp范围分别为0.4 2.0 ms、0.7 2.0 ms，而multiCP可定量的tp范围分别为0.6 1.5ms、0.91.4ms.可见，MLGCP-1方法中tp参数受TcH差异度的影响趋势与multiCP相同，即TcH差异度越大，tp范围越小但对于相同的样品体系，MLGCP-1方法可定量的tp范围更宽，对样品的属性表现出更高的宽容度.为了进一步探讨MLGCP-1对于共混体系组分含量测定的优势，本文选取L-缬氨酸和L-丙氨酸摩尔比分别为1:3、1:1、3:1的三种混合物作为模型样品，通过分析几组TcH差异度不同的基团的实验数据，并与multiCP方法的实验结果进行对比如图8 所示，L-缬氨酸和L-丙氨酸混合物的13CCPNMR谱图中，L-丙氨酸的C-2、3和L-缬氨酸的C-5、6 所对应的谱峰没有重叠.基于此，实验选取三组基团用于计算组分含量，包括：1）L-丙氨酸的2 号碳和L-缬氨酸的5号碳（记为2/5）；2）L-丙氨酸的2 号碳和L-氨酸的6号碳（记为2/6）；3）L-丙氨酸的3号碳和L-氨酸的6 号碳（记为3/6）.ramp-CP条件下三组基团TcH相144波谱学杂志第40 卷(a)1.010.80.60.40.20.0-0.2-0.4-0.6-0.8-1.00.01.010.80.60.40.20.0-0.2-0.4-0.8-1.00.0图7 MLGCP-1和multiCP可定量的tp范围受L-缬氨酸中基团TcH差异度的影响规律：（a)MLGCP-1实验百分误差图，测量体系的TcH差异度为8%；(b）M L G CP-1实验百分误差图，测量体系的Tch差异度为7 6%；(c)MLGCP-1实验百分误差图，测量体系的Tch差异度为8 9%；(d)multiCP实验百分误差图，测量体系的Tch差异度为8%；（e)multiCP实验百分误差图，测量体系的TcH差异度为7 6%；（f)multiCP实验百分误差图，测量体系的TcH差异度为8 9%.TcH差异度均使用ramp-CP 测得Fig.7 The impact of Tch difference in L-valine on the quantified range of tp.(a)MLGCP-1 percentage errors,recorded on thesystem with Tch difference of 8%;(b)MLGCP-1 percentage errors,recorded on the system with TcH diference of 76%;(c)MLGCP-1percentage errors,recorded on the system with Tch difference of 89%;(d)multiCP percentage errors,recorded on the system withTc difference of 8%;(e)multiCP percentage errors,recorded on the system with Tc difference of 76%;(f)multiCP percentageerrors,recorded on the system with Tch difference of 89%.Tch values were measured under ramp-CP condition(b)1.0j0.80.6MLGCP-10.40.20.0-0.25%-0.41-0.6JL-valine:(5)-(6)-0.81-1.010.51.0,(ms)(d)multicpL-valine:(5)-(6)1.01.50.51,(ms)(c)1.010.80.6MLGCP-10.40.20.0-0.25%-0.4-0.6L-valine:(5)-(8)-0.8-1.01.52.05%2.0MLGCP-15%L-valine:(6)-(7)0.00.51,(ms)(e)1.010.80.6j0.40.20.0-0.2-0.42-0.6-0.8-1.0+0.01.0multicp5%L-valine:(5)-(8)1.00.5,(ms)1.51.52.02.00.01.010.