浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略.doc

摘要动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略目 录摘要I1引言12基础理论概述12.1细胞培养的概念12.2原代细胞培养的概念12.3传代细胞培养23影响细胞体外培养的因素23.1细胞分离方法23.1.1直接分离法33.1.2酶消化法33.2细胞培养温度33.3细胞培养基的成分33.3.1天然培养基33.3.2合成培养基33.4接种密度43.5培养基的pH值43.6细胞的冻存与复苏43.6.1细胞冻存43.6.2细胞复苏54细胞实验室无菌环境的防控策略54.1无菌室的彻底消毒54.2培养用品的清洗和消毒灭菌64.2.1清洗64.2.2消毒灭菌64.3培养试剂的分装与保存74.4对操作者的要求75结语8参考文献9致谢10浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略1引言细胞体外培养技术由于具有简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测实验结果，以及方便控制培养产物等优点，在医药领域已成为研究发病机理和筛选药物的重要手段，在分子生物学领域，利用细胞培养技术，结合细胞融合、细胞杂交以及转基因技术，进行基因重组、组织构建，成为分子遗传和组织工程研究者的重要研究工具，利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分。近年来，分子生物学和分子遗传学获得巨大进展，培养细胞技术被广泛应用于该领域的研究，这些培养的细胞已成为基因工程、遗传工程、体细胞克隆、转基因动物、生物制药、干细胞、微生物学、细胞生物学、遗传学、病毒学、免疫学等学科研究的有力工具和重要途径。2基础理论概述2.1细胞培养的概念细胞培养是指将细胞从机体中取出，人工模拟机体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等的研究工作，是维持细胞结构和功能的体外培养方法。2.2原代细胞培养的概念原代培养是指取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养，这是细胞培养的最初和必经阶段。培养方法包括：单层细胞培养和悬浮培养。(1) 单层细胞培养：将取下的组织块无菌剪切后，用0.25%胰酶消化，使细胞分离，再用无菌Hanks液或0.85%NaCl溶液洗涤后，置培养皿或培养瓶中培养。(2) 悬浮培养：悬浮培养的细胞多取材于血液或体腔液，一般采用离心法分离细胞，低速500-1000r/min，离心5-10min即可。培养时，只要取适当浓度的细胞悬液接种于完全培养液中，细胞就能增殖。2.3传代细胞培养传代细胞培养是指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中，即当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养。根据原代培养物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系或细胞株。这些细胞一般可顺利传40-50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系株。一般细胞原代培养1-4周后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，影响细胞的生长繁殖。在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。人传代次数与个体年龄成反比：人胚胎40-60代；幼年20-40代；成年10-30代；得了早老病的儿童2-10代。传代培养的方式主要有：贴壁型细胞传代和悬浮型细胞传代。(1)贴壁型细胞传代：传代时需要用胰酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用溶液与胰酶按体积比为1:1或1:2比例混合后联合使用。过滤除菌后小量分装，于-20保存。消化时吸去培养瓶内的培养液，加入适量的溶液与胰酶的混合液，以能覆盖细胞层为宜，将培养瓶平放，37作用3-5min，加入Hanks液，1000r/min离心5min即可除去消化液，洗1-2次后加入完全培养液，计数，置培养皿或培养瓶中培养。(2)悬浮型细胞传代：传代时用吸管将细胞吹打均匀，特别是一些成团生长的细胞，应将细胞团块打散。根据细胞生长状况的不同，用吸管将细胞悬液吸去适当的量，然后再加入完全培养液至原体积3影响细胞体外培养的因素3.1细胞分离方法细胞分离方法细胞培养之前，首先要进行组织块的分离，其主要方法包括：直接分离法（包括机械法和EDTA螯合法）和酶消化法（包括胰蛋白酶消化和胶原酶消化）。3.1.1直接分离法该方法分离得到的细胞数量没有酶消化法得到的多，但可满足一般实验的要求，该方法的优点是操作流程简单，不需要复杂的仪器和昂贵的胶原酶。3.1.2酶消化法多用于新生动物组织或动物胚胎的肝细胞培养。胰蛋白酶消化法具有分离效果好、操作简单和价格便宜的特点，因为胰酶消化的条件很难掌握，所以未被广泛应用；胶原酶消化法具有分离效果好、细胞产量高（即时存活率高、对细胞损伤小）、维持细胞特异性功能的时间长等优点。3.2细胞培养温度不同种类的动物细胞对温度的要求并不一致，如人和哺乳动物的细胞培养温度为35-37，鸟类细胞培养温度为38.5，鼠类细胞为34。一般来说，细胞对低温的耐受力比高温强。因此，在细胞的培养过程中要及时地根据细胞的类型调整适宜的温度。在使用恒温培养箱时，箱内温度应维持在37、CO2体积分数为5%。3.3细胞培养基的成分培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基，按其来源分为天然培养基和合成培养基。3.3.1天然培养基最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。质量好的血清应该是无溶血、橘黄色清亮透明、无细菌、无支原体污染的黏稠状液体。血清的体积分数要控制在5%-20%，当超过30%时反而不利于细胞生长，过高或过低的血清体积分数都不利于细胞的生长和增殖。一般将血清保存于-20以下，时间不易过长。3.3.2合成培养基合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好地生长增殖。迄今为止，人工合成的培养基已有多种，如RPMI-1640、Eagles MEM、DMEM等，其主要差别在于氨基酸、维生素、无机盐和能源物质的组成及含量不同。一般认为RPMI-1640营养全面，对各种组织生长都适用；Eagles MEM适合于细胞株的传代培养；DMEM有利于细胞的分裂增殖；Hams F12能促进细胞的分化。也有学者将不同培养基混合应用，从而得到较好的培养效果。培养液中的抗生素是青霉素和链霉素。此外，卡那霉素、新霉素、两性霉素、氯霉素等都可以防止细胞培养过程中细菌和真菌的感染。3.4接种密度一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，细胞密度过大时，养分不足，使细胞迅速老化；而密度过小时，不利于细胞单层的形成。在传代培养中，细胞的密度取决于传代的时间。一般分瓶的稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。在细胞生长的外部条件完全相同的情况下，细胞分散比率不同会导致不同的增殖倍数，影响细胞产量，这对培养种细胞尤其重要。3.5培养基的pH值在培养动物细胞时，不同种动物或是同一种动物的不同部位对pH值的要求各不相同。一般认为，动物细胞培养基的pH值一般在7.2-7.4，呈弱碱性。培养过程中pH值低于6.8时对细胞生长会有抑制作用，细胞生长缓慢；而当pH高于7.6时则细胞不能生长，这可能是由于空气的接触而导致培养基中的营养成分被氧化所致。3.6细胞的冻存与复苏细胞冻存和复苏的基本原则是“慢冻快融”，实验证明这样可以最大限度地保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质都能提高细胞膜对水的通透性。缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。3.6.1细胞冻存传代培养的细胞，如果暂时不用，可以冷冻保存。利用冻存技术将细胞置于-196液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞后用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂至终体积分数5。15的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。标准冷冻速度开始为-1min或者-2min，当温度低于-25时可加速，到-80之后可直接投入液氮内（-196）。3.6.2细胞复苏复苏细胞的原则为快速解冻，从液氮中取出细胞冻存管之前应准备好38的温水，冻存管取出后用镊子夹住顶端迅速放入温水中，结束后还要在75酒精中清洗几次，除去透明过程中染上的杂质。为缩短透明时间，可将标本放在烘干箱或灯光下加热，透明时间长短根据标本大小、多少和环境温度而定。冻存复苏后的状态主要与冻存保护剂的种类、浓度以及细胞复苏方法和复苏后培养液中小牛血清浓度等有关。二甲基亚砜（DMSO）是一种具有非常强的溶解能力和非凡渗透能力的化学物质，也是应用最广泛的体外培养细胞冻存保护剂，其常用体积分数为1020，不同种属细胞的最适浓度也存在一定差别。4细胞实验室无菌环境的防控策略目前细胞培养过程中最主要的问题就是污染，污染可导致细胞死亡，从而造成人力、财力和时间的损失，有时还可能造成特殊材料的不可再用。因此，在做细胞实验时，一定要尽力避免污染的发生。4.1无菌室的彻底消毒无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。一般情况下，无菌室每周都要彻底清洁、消毒1次，用稀释的新洁尔全面彻底地擦洗无菌室的台面和地板，用屋顶装置的紫外灯照射整个细胞培养室30-60min，以对环境进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。在超净工作台区域应保持清洁及宽敞，必要物品，如试管架、吸管盒等可暂时放置，其他实验用品用完即应移出，以利于气流的通畅。超净台的平均风速保持在03.2-0.48m/s为宜，过大、过小均不利于保持净化度。使用前最好开启超净台内紫外灯照射10-30min，然后让超净台预工作10-15min，以除去臭氧和使工作台面空间呈净化状态。使用完毕后，要用70酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。4.2培养用品的清洗和消毒灭菌细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，从事细胞培养的工作人员必须要掌握这些物品的清洗和消毒灭菌的知识与方法。4.2.1清洗离体条件下，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。(1)玻璃器皿的清洗：一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗个步骤。(2)橡胶制品清洗：新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15min，流水冲洗；0.5mol/L HCl煮沸15min，流水冲洗；自来水煮沸2次；蒸馏水煮沸20min；50烤干备用。(3)塑料制品的清洗：塑料制品由于质软而易出现划痕，耐腐蚀能力强但不耐热。使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，然后用纱布（或棉签）和50清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15min，流水冲洗（15-20遍），蒸馏水浸洗3次，双蒸水泡24h，晾干备用。(4)包装：对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料有牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装非常方便、适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。4.2.2消毒灭菌微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因，对于已经清洗的器皿要进行灭菌处理，常用的方法是高温湿热灭菌和高温干热消毒两种方法。(1)高温湿热灭菌。此法是最常用的灭菌方法，对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、玻璃器皿、金属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。不同压力蒸气的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸气消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。(2)高温干热灭菌。此法主要是将物品放入电热烤箱内加热到160以上，并保持90-120min，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸气接触的物品（如粉剂、油剂）。干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后再打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。电热箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。4.3培养试剂的分装与保存培养液和胰酶的配制用水是三蒸水或符合培养细胞标准的水。试剂的除菌方法采用过滤除菌法，最好使用一次性的滤器和滤膜，如果是反复使用的滤器则应在过滤前先将滤器和滤膜高压灭菌，而后在无菌操作台内进行过滤分装，接收滤液的容器也需事先高压灭菌。配制好的培养液经测试确认没有污染方可用于培养细胞。配好的试剂于保存。培养细胞所用的血清必须储存于-20-70，但不能超过个月，解冻时在-20或-70-4冰箱溶解1天，至室温下全溶后再分装，在溶解过程中要规则摇晃均匀，使温度与成分均一，这样可以减少沉淀。最好不要直接在37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。4.4对操作者的要求有很多污染的发生都与实验操作人员操作不当有关，细胞培养实验的操作应是严格的无菌操作。首先实验进行前，无菌操作台面、手术器械、废液缸及实验用品均应用紫外灯照射30-60min灭菌；以70酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10min后，方可开始实验操作。实验操作人员进培养间之前，须先洗手，在缓冲间换穿专用实验服和拖鞋，准备好与细胞培养操作实验有关的所有试剂和用品，严禁在实验进行时频繁出入培养间。在无菌操作台开始操作前须戴一次性乳胶手套，并用70酒精擦拭、擦瓶口和烧灼瓶口。在实验过程中，要求实验人员规范操作，严格遵守无菌工作流程。操作者动作要轻，安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。操作时尽量不要谈话、咳嗽，以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。吸取培养液和细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。做完实验后应将实验产生的废物和废液及时移出培养间，并用消毒水浸泡的纱布擦拭台面，保证工作台清洁无菌。5结语动物细胞培养作为现代多个学科领域研究的重要技术，具有越来越占有重要的地位。目前，动物细胞培养已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得了很大的进展，但还存在一些亟待解决的问题。为了获得更多细胞、节省成本，合理控制细胞培养时的影响因素和做好细胞培养过程中污染的防控工作，是每个细胞培养研究者都要重视的工作。参考文献1甘露，张志辉，吕美娜，等细胞培养技术J国组织工程研究与临床康复，2008，12(29)：5739-5742.2寇伯君，李玉林，石英爱人和小鼠内皮细胞的分离、培养及鉴定J吉林大学学报，2005，31(1)：155-15.3李杨，郭继彤，吴凯峰，等牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养J细胞生物学杂志，2002，24(4)：254-257.4黄兰兰，石国庆，卢春霞影响动物细胞体外培养因素J黑龙江动物繁殖，2005，13(4)：16-17.5张忠，杨德斌，章培军，等浅谈神经细胞的培养技术J大同医学专科学校学报，2001，22(3)：19-20.6赵位，谭文松，俞俊堂动物细胞培养工程的现状与展单J华东理工大学学报，2002，23(2)：131-1377姜彬细胞培养技术简介及避免污染的策略J生物学通报，2008，43(3)：54-55.致谢通过这两个多月的忙碌和学习，本次毕业论文已经接近尾声，虽然花费了所有的业余时间，但作为一个大学生的毕业论文，由于经验的匮乏，难免有许多考虑不周的地方，在这里衷心感谢指导老师的督促指导，以及一起学习及努力的同学们的支持，让我按时完成了本次毕业设计。在本次毕业论文中，我遇到了许多问题，在此我要感谢我的指导老师XXX老师从论文的选题，定稿及中期修改，后期格式调整等各个环节中都一直给我悉心的帮助和耐心的指导。为了指导我们的毕业论文他放弃了自己的休息时间。他的敬业精神和无私奉献精神令人钦佩。同时感谢四年来所有的任课老师和所有的同学给自己的指导和帮助，同时感谢实习单位给我提供的宝贵的实习机会和在各个方面给与我帮助的伙伴们。在此再一次真诚的向帮助过我的老师和同学表示感谢!