BDFACSCalibur流式细胞仪操作基础手册.doc

BD FACSCalibur流式细胞仪

FACS101 Handbook

本课程介绍「表面抗原流式分析」相关之基础工作原理。如期望深入了解流式细胞技术应用，请至本企业网站订阅FACSinformation电子报.tw/bdb/index.html。
如需要本课程手册，欢迎至本企业网站下载 .tw/bdb/10-5-3-1.html 。
如需要免疫荧光染色方法，请至本企业网站下载 .tw/bdb/10-5-4-1.html 。

一、BD FACSCalibur基础结构

1.1仪器本体：

1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先开启仪器本体，再打开计算机。

2. 光学系统：BD FACSCalibur 基础配有一支波长488 nm 氩离子雷射

以BD FACSCalibur 基础型为例
Ø FSC Diode 只收488 nm波长散射光
Ø SSC PMT 只收488 nm波长散射光
Ø FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）
Ø FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）
Ø FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）

3. 仪器面板：
仪器前方面板右下方有三个流速控制键、及三个功效控制键。
流速控制：
LO： 样品流速：12 ml /min
MED：样品流速：35 ml /min
HI: 样品流速：60 ml /min

功效控制：
· RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检验是否失压。）
· STANDBY： 无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。
· PRIME：去除流动室中气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，连续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。

4. 储液箱抽屉：
在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。

· 鞘液筒：在抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器能够运行大约 3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣，确保鞘液筒密闭。
· 废液筒：在抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在生物传染性。
· 鞘液过滤器0.22mm过滤器，去除鞘液中杂质，确保进入流动室鞘液是洁净。
· 气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。
· 空气过滤网：用于过滤冷却雷射空气。

5. 上样品区：

上样品区是样本管上样位置。它包含三个部分，一个是进样针 Sample Injection Tube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。

· 进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统一部分。
· 支撑架：用于支撑样本管、并负责开启液滴存留系统。支撑架有三个位置：在样本管之下中位，样本管左侧或右侧。

液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架在左侧或右侧位置时，真空帮浦就会开启，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支撑架在中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架在中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时，让仪器保持RUN模式，使得进样针能够反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗根本以免碎片沈积到流动室中。

1.2 Macintosh计算机和打印机：

准备您细胞样品

1. 理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/ml？通常试验只需0.5 ml样品。
2. 细胞样品务必放至BD FALCON 352052 试管中，不然无法上机。
3. 上机前务必去除样品中之细胞团块，以预防管路堵塞？可使用附滤网BD FALCON试管 (Cat. No.352235) 或35-55 mm尼龙筛网。
4. 供流式分析样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品全部需经荧光染色。表面抗原荧光染色方法大致有两种：直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。硕士可至本企业网站下载染色方法 .tw/bdb/10-5-4-1.html

· 直接免疫荧光染色
· Lysed - No - Wash Procedure
· Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27
· Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure
· Leukemia and Lymphoma Procedure 1
· Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay
· 间接免疫荧光染色
· 滴定抗体浓度
· 常见试剂

5. 如因特殊原因无法下载上述试验方法，请e-mail：或 。

二、开机、关机标准操作

2.1 FACS Calibur 开机

1. 开启细胞仪电源。
2. 开启其它周围配置电源，如打印机及MO机。
3. 开启计算机。
4. 确定鞘流液筒有八分满FACS Flow，确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。
5. 将废液倒掉，并在废液筒中加入200 ml 家用漂白水 (废液筒容量为4L)。
6. 将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。
7. 排除液流管路和过滤器中气泡。
8. 取下样品管，实施 PRIME 功效两次。
9. 使用1ml PBS，HIGH RUN 两分钟。
10. 可开始分析样品。

2.2 FACS Calibur 关机

关机前必需动作：清洗进样管和外套管，预防进样管堵塞、或有染料残留。

1. 将样品支持架左移，取 2 ml FACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器真空系统抽取约 1 ml 液体。
2. 将样品支持架回正，按 HI RUN，然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。
3. 按 Standby，取下样品管，实施 PRIME功效两次。
4. 取 2 ml dH2O，反复上述步骤1-3。
5. 注意最终只留约 1 ml dH2O 在试管中。
6. 按 STANDBY 五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必需动作，以保护雷射光源。）
7. 倒掉废液，并回填 200 ml漂白水。
8. 将减压阀放在「VENT 漏气」位置。将鞘流液筒充填至八分满。
9. 退出软件“File”à“Quit”(如有对话选项，选择“Don‘t save”)。确定退出计算机中全部BD应用软件，全部数据数据已储存备份。
10. 关闭计算机。“Special”à“Shutdown”。

三、上机分析步骤

提议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。
（1）Negative Control（不加任何抗体）。
（2）CD3-FITC（FL1 单染）。
（3）CD19-PE（FL2 单染）。
（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。

3.1 Calibur 开机

1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。 *秘技1：如次序相反，仪器和计算机之间无法建立正常通讯，无法实施“connect to cytometer”。 处理之道，二者全部关机、然后以正确方法重开。

2. 向前拉开储液箱抽屉，检验鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向）。

3. 仪器会对鞘流液筒打气加压，请确定筒盖确实旋紧。 *秘技2：将减压阀方向调在加压（向前）位置。减压阀如在VENT（箭头方向）位置，按RUN功效键时将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检验是否失压），正常为绿色显示。

3.2开启CellQuest 软件、编辑试验文件

4. 在苹果菜单下点击CELLQuest 开启软件。桌面会出现一’Untitled’ 试验文件，可点击试验文件右上角放大钮，将试验文件窗口放大。

5. 从工具板中点击散点图图示。在试验文件空白区点击，拖曳对角线至合适大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框。

6. 在出现散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition (收取) ，确定X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击Multicolor Gating（收取样品时，门内细胞将出现颜色）。点击OK。此时试验文件会出现FSC/SSC散点图。

7. 说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常见图谱，它能够显示两个独立参数相互关系。在图中，横坐标X轴为为荧光1强度相对值，单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度相对值。仪器使用者可因应试验需求来修改全部图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。

8. 从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功效，可复制一个一样大小散点图，在出现对话方框内选择X轴：FL1-H 1024，Y轴：FL2-H 1024。点击OK，FL1/FL2散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。

9. 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant中心将它设定在（x，y）＝（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。

建立仪器和计算机之间通讯

10. 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer，此时会出现Acquisition Control 对话方框。假如无法选择Connect to Cytometer，参考秘技 #1。假如没见到Acquisition Control 对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择Show Acquisition Control。

仪器设置文件

注意：试验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必需在第一次就使用正确仪器设定文件。仪器设定文件（Instrument settings），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值（Threshold），荧光赔偿（Compensation）等仪器条件组合。通常而言，仪器设定次序为Detector/Amps -- Threshold -- Compensation。

11. 检验现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确定FSC和SSC为LIN（线性放大），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。

12. 从Cytometer菜单中选择Threshold，出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口：确定FSC为设阈参数，初步确定预设阈值52。将其拖至空白区。

13. 从Cytometer菜单中选择Compensation，确定全部预设数值皆为零。将其拖至空白区。

3.3 上样品、设置仪器

14. 使仪器处于High RUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确定Acquisition Control 窗口中ý Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据)，点击Acquire。

调整FSC/SSC探测器（电压）

15. 观察FSC/SSC图改变。FSC电压(Voltage)预设为E00，可调整 Amp Gain 从1.00—9.99 使关键细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。调整SSC电压使关键细胞群得以清楚展现。调整FSC/SSC图标准，在于能得到一独立离散细胞族群，该细胞群不和其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Acquisition Control 窗口中Pause。

Gating 圈选

细胞检品中，常含有大小不一样、性质相异细胞群体。我们常见前方散射和侧方散射二维位图，即散射光图谱（Scatter Plot），来圈选出不一样细胞群范围，选择性显示出有意义细胞群体，以下图圈选白血球之淋巴细胞族群。

16. 在工具板中选择多边形Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域（以下图）。分析样品时，区域内细胞应会展现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义细胞。假如要删除R1区域，您能够在工具列中点选Gates → Region list ，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。

17. 选择期望GateFL1/FL2散点图，从Plots菜单中选择Format dot plot。在出现对话方框内，将No Gate 改选 G1=R1。点击OK。

调整FL1、FL2探测器（电压）

18. 点击Acquisition Control 窗口中Restart。在Detector/Amps 窗口中调整FL1、FL2电压，使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100--101处。

19. 在Threshold 窗口，合适地提升FSC阈值>52，以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉关键细胞族群。

20. 点击Acquisition Control 窗口中Pause、Abort。移去阴性对照管，关闭Detector/Amps、Threshold窗口，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。

调整荧光赔偿

说明：最适化最终一步是调整光谱重迭。（如是单色荧光试验可跳过此步骤）如是2色样本，必需时需调整FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必需时需调整FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3赔偿）。

21. High RUN，换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中Acquire。调整FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图右下象限。赔偿调整可经过点击­¯来选择或直接拖动滑标上下移动。调整完成，点击Acquisition Control窗口中Pause。

22. 移去单染CD3，换上单染CD19-PE管。点击Acquisition Control窗口中Restart。调整FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图左上象限。调整完成，点击Acquisition Control窗口中Pause。

23. 最终以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击Acquisition Control窗口中Restart，确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时，点击Acquisition Control窗口中Pause、Abort。

24. 移去样本管，换上dH2O管，让仪器暂且处于Standby状态。关闭Compensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。

3.4搜集试验数据

决定储存细胞总数

25. 预设之「储存细胞总数」为10000。如需修改，从Acquire菜单中选择Acquisition & Storage，并在出现窗口功，确定「Collection Criteria」从10000 of All，再点击OK。

26. 找个档案匣准备储存数据。从Acquire 菜单中选择Parameter Description，出现Parameter Description对话方框。点击Folder，并在随即出现之对话方框，选择「Your Folder」或新建活页夹，点击此对话方框Select ’Your Folder’。

27. 命名立即储存之文件名：点击Parameter Description对话方框File，出现文件名编辑窗口。在Custom Prefix中：输入文件名1231，点击此对话方框OK。日期为最常见之文件名系统。

28. Optional：如有需要，可选择或在P1-P5后空格中输入相关参数名。如P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。输入参数名会存入试验档案中，显示在图谱上。

计数器Counters

29. 从Acquire 菜单中选择Counters. 窗口会显示样品分析速率、和总数进度。
搜集试验数据

30. 你能够开始搜集试验数据了。HIGH RUN，将第一管样品放到检测区，在Acquisition Control窗口中，将 ý Setup 改成 ¨ Setup，此时CellQuest会自动显示 Your Folder：1231.001为资料文件名。点击“Acquire” 便可开启样品之分析测定和数据储存。当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件1231.001，并会以“嘟”声通知，CellQuest会自动升幂附加档名成1231.002。等候下一指示。

31. 你能够换上下一管样品，点击“Acquire” 开启样品之分析测定和数据储存。可继续分析直到全部检品全部分析完成。

3.5试验数据之储存和备份：

32. 不提议长久使用硬盘储存数据数据，可考虑以烧光盘（如配有 CD-RW）、口袋硬盘（Flash Drive）来备份大量试验数据，以免占用原有硬盘内存，影响数据处理速度。可将备份后之数据，拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机分析。

33. 确定全部档案皆己备份后，以鼠标圈选欲删除数据，将其拖拉至Trash筒。

退出软件

34. 检品分析完成后，记得从屏幕上方 File 指令栏选择 Save As，储存试验文件，以备以后使用，不需每次重新编辑。

35. 从屏幕上方 Cytometer 指令栏，选择Instrument Setting，出现Instrument Setting窗口。点系print打印此次试验条件，可贴入试验笔记留底，再点击Save以储存此一试验仪器条件，供以后再使用。点系SAVE后会出现文件保留对话方框，选择文件目录及文件名（例：Your Folder：/Your Setting1），点击Save。点击Done。

36. 检品分析完成后，用鼠标从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选择Disconnect to Cytometer 以断绝计算机和仪器间之联机。以后如不分析数据，您可退出软件“File”à“Quit”(遇有选项永远选择“Don‘t save”)，进行关机程序。

管路清洗

37. 以2 ml 10％ 漂白水替换样品，将样品架置于左位以外管吸除约1 ml，再将样品架置于中位 HI RUN 十分钟。改用 2 ml DI water。反复上述程序，样品架上留约 1 ml DI water 。按STANDBY五分钟。

关主机、关计算机

四、数据分析

FCS list mode数据文件：
说明：FCS list mode数据文件是流式细胞仪标准格式档案（FCS2.0）。该文件含有从流式细胞仪收取平均10,000个细胞数资料，含有4~6个参数。通常软件无法打开list mode数据文件，需藉助如CellQuest, WinList, WinMDI, 等Flow 分析软件，才可开启、绘图、并进行分析统计。

4.1 开启一CellQuest试验文件

1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一’Untitled’ 试验文件，可点击试验文件右上角放大钮，将试验文件窗口放大。

4.2散点图之统计分析（双色）

2. 从工具板中点击散点图图示。在试验文件空白区点击，然后拖动对角线至合适大小。Plot 拖曳完成后能够在右方看到Dot Plot对话框。

3. 在Dot Plot方框中，Plot Source应预设为Analysis，可点击 Select File 钮，并用随即之方框来开启预存之 Sample Files，它们路径在Mac HD：BD Applications：CellQuest Folder：Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录，找到档案后，点击 Open来开启 NORM001 档案。X 和 Y 参数项会出现默认值—FSC-H 256 和 SSC-H 256，在Color方框中点击Multicolor Gating，确定无误以后，点击 OK 便完成了一个 NORM001 FSC /SSC散点图。

4. 工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor 移至FSC/SSC散点图上，并沿着淋巴球聚落周围画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域界定，我们将以此区域来圈选淋巴细胞。(假如要删除R1区域，您能够在工具列中点选Gates → Region list，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)

5. 从Plots菜单中选择Dot Plot可复制一个一样大小散点图，屏幕上会出现一 Dot Plot 对话方框。点击X Parameter 钮来显示 NORM001 档案中全部参数项 (FSC, SSC, FL1, FL2) 将 X 参数项改成「FL1-H 256 Gamma-1」，Y 参数项改成「FL2-H 256 Gamma-2」。从Gate输入栏中将 NoGate 改成G1= R1。

6. 点击 OK 便完成了一个以 G1 圈选 FL1/ FL2 散点图，可将复制图移至原图右方。NORM001 档案为本组试验之阴性对照组，我们将以之来界定阴性和阳性之界限。

7. 从屏幕左列工具板中，选择 Quadrant Marker 工具，然后在 FL1/ FL2 散点图中心处点击并拖曳至定点，通常而言是紧挨着阴性细胞聚落。

8. FL1/ FL2 二维散点图现在被区隔出四个象限，欲计算各象线中细胞数据数据，从屏幕上方Stats菜单中选择Quadrant Stats。能够得到该图之四象限统计结果。UL：左上象限，UR：右上象限，LL：左下象限，LR：右下象限

打印汇报、输出统计数值

9. 从屏幕上方File菜单中选择Print One，能够打印工作中试验文件。

10. 点选四象限统计表，从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数值至Excel档案。在出现方框中命名档案，并决定欲存放档案匣，点击Save。

4.3 开启其它List Mode Data

11. 如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方法选择全部图表 (文件中全部图谱四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Next Data File，软件会自动以新档案来替换现有档案，您只要确定圈选范围、和 Quadrant Marker 位置是否合适，即可打印汇报、或输出统计数值。

12. 对于存在不一样档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方法选择全部图表 (文件中全部图谱四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Change Data Files，并在随即出现之对话方框，选择所在新目录和欲分析档案。点击OPEN。可调整圈选区域，Quadrant Marker阴阳界限，软件会重新计算、统计汇报。

13. 常规使用之试验文件 (内含散点图、圈选区格、四象限分界、和统计汇报) ，我们提议您将它另存新档 File – Save As，以备后需，分析其它档案便轻而易举。

4.3直方图之统计分析（单色）

1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一’Untitled’ 试验文件，可点击试验文件右上角放大钮将试验文件窗口放大。

2. 从工具板中点击散点图图示。在试验文件空白区点击，然后拖曳对角线至合适大小。Plot 拖曳完成后能够在右方看到Dot Plot对话框。

3. 在Dot Plot方框中，Plot Source应预设为Analysis，可点击 Select File 钮，并用随即之方框来开启预存之 Sample Files，它们路径在Mac HD：BD Applications：CellQuest Folder：Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录，找到档案后，点击 Open来开启 NORM001 档案。X 和 Y 参数项会出现默认值—FSC-H 256 和 SSC-H 256，在Color方框中点击Multicolor Gating，确定无误以后，点击 OK 便完成了一个 NORM001 FSC /SSC散点图。

4. 工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor 移至FSC/SSC散点图上，并沿着淋巴球聚落周围画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域界定，我们将以此区域来圈选淋巴细胞。(假如要删除R1区域，您能够在工具列中点选Gates → Region list，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)

5 从Plots菜单中选择Histogram，屏幕上会出现一 Histogram 对话方框。点击 Select File 钮，再点击 Open来开启 NORM001 档案。

说明：直方图（Histogram）表明一个参数和细胞数量之间关系，在图中，横坐标X轴为荧光或光散射强度相对值，单位是道数（channel number），纵坐标Y轴则通常表示细胞出现频率，即相对细胞数。

6. 点击 Parameter 钮来显示 NORM001 档案中全部参数项，将参数项改成「FL2-H 256 Gamma-2」。从Gate输入栏中将 No Gate 改成G1= R1，点击 OK 便完成了一个以G1圈选 FL2直方图，图形 X 轴为橙黄色荧光强度，Y 轴为细胞频率，NORM001 档案为本组试验之阴性对照组，我们将以之来界定阴性和阳性之界限。

7. 从屏幕左列工具板中，选择 Histogram Marker 工具，然后在图左缘处点击并拖曳至定点，通常而言是阴性信号右缘。放开鼠标后即完成Marker 1(M1)。反复前述步骤以增画另一Marker，通常而言 M2 始自 M1 右缘，最终图右界。

8. FL2 直方图现在被区隔出两个区域，欲计算各区域中细胞数据数据，可从 Stats 指令栏中选择 Histogram Stats。

打印汇报、输出统计数值

9. 从屏幕上方File菜单中选择Print One，能够打印工作中试验文件。

10. 点选四象限统计表，从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数值至Excel档案。在出现方框中命名档案，并决定欲存放档案匣，点击Save。

4.3 开启其它List Mode Data

11. 如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方法选择全部图表 (文件中全部图谱四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Next Data File，软件会自动以新档案来替换现有档案，您只要确定圈选范围、和 Quadrant Marker 位置是否合适，即可打印汇报、或输出统计数值。

12. 对于存在不一样档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方法选择全部图表 (文件中全部图谱四角会出现黑色方块，表示被选择上) ，接着从Plots菜单选择Change Data Files，并在随即出现之对话方框，选择所在新目录和欲分析档案。点击OPEN。可调整圈选区域，Markers界限，软件会重新计算、统计汇报。

13. 常规使用之试验文件 (内含散点图、圈选区格、四象限分界、和统计汇报) ，我们提议您将它另存新档 File – Save As，以备后需，分析其它档案便轻而易举。

五、错误信号、疑难排除

5.1 仪器状态（Status）：

在CELLQuest菜单在Cytometer菜单中。用来在收取任何时候查看流式细胞仪运行状态，以利处理仪器运行中出现问题。

状态：显示仪器运行模式
Not Ready：激光器正在预热、鞘液桶空、废液桶满。
Ready：样本管放置在进样区，且支撑臂在中位，样本管加压，仪器在RUN状态。
Standby：仪器在Standby 状态、或仪器在Run 状态而无样本管在进样区上、或支撑架在侧位、或样本管未完全加压。Standby时仪器雷射电源降低。

5.2 常见故障排除程序

5.2.1 样品试管上不去

Ø 误用不适合试管。（请用BD Falcon 352052）
Ø 试管支持架需调整。旋转调整试管支持架（顺时钟向下、逆时钟向上）。
Ø Bal Seal 磨损。（汰换 Bal seal）

5.2.2 仪器处于N0T READY情况

检验以下情况：
Ø 鞘液筒中鞘液是否用完。
Ø 废液筒中废液是否已装满。
Ø 开机需要5分钟时间预热。
Ø 鞘液筒液面检测器连接是否松动、或未连接。

5.2.3 仪器处于STANDBY情况（仪器失压）

假如仪器未加压，上样管放好后，即使控制面板处于RUN模式，但仪器仍未能达成READY情况，此时仪器仍处于STANDBY情况。这可能是因为鞘液筒盖漏气、压力阀未加压，样本管不能被加压等原因造成压力问题。此时，样本不能良好地进入流动室，无法检测。

此时，检验以下情况：
Ø 压力阀未加压。
Ø 鞘液筒是否漏气（盖紧鞘液筒盖）。
Ø 样本管是否有破损。
Ø 上样针上Bal seal是否己磨损。
Ø 鞘液筒上蓝色接头是否连接好。

5.2.4 仪器讯号噪声过高

鞘液过滤器中有气泡，仪器统计了气泡产生信号，造成了噪声数据干扰。气泡还能够改变样本流，造成检测结果不理想；此时，仪器需要做PRIME，排除液路中气泡干扰。假如鞘液筒吸干了，应该重新装满鞘液，然后先取下样品管进行5-10次PRIME，再换上3ml dH2O上样管HI RUN 30分钟，待鞘液流中气泡排除以后，再进行样本测定。

5.2.5 计算机屏幕上见不到细胞显示

检验以下情况：
Ø 假如仪器一直处于STANDBY状态，则检验System Status。
Ø 假如STATUS窗日显示READY，则检验样本管中细胞浓度是否够，上样前是否混匀了。
Ø 检验试验Instrument Settings是否正确。
Ø 检验阈值是否设置过高，造成无法检测目标细胞群。
Ø 检验CELLQuest软件Cytometer目录下Status窗口，是否己被更新。假如未更新，说明仪器和计算机之间通讯发生了故障，此时，应关闭计算机和FACSCalibur，重新打开仪器，继续试验。
Ø PRIME仪器液流，去除流动室中可能存在气泡。若流动室中存在气泡，可能使样本流位置偏离激光束，造成无细胞信号。

5.2.6 加样针有鞘液反流

检验以下情况：
Ø 检验上样针外管是否安好，能够将外管旋下，向上推进，重新拧紧。
Ø 更换上样针上部O型胶环。
Ø 检验液流保留系统真空帮浦是否工作。假如样本管支撑架在旁位时，听不到真空帮浦工作声音，可能是真空帮浦停了，关闭FACSCalibur，再开启；移开支撑架时，假如马达仍然不动，请致电BD用户服务部门寻求帮助。

试验文件1：2 Color ACQ

试验文件2：2 Color ANA

表一、常见荧光染剂

测量参数
荧光染剂
吸光波长(nm)
荧光波长(nm)
标示抗体用染剂
Fluorescein, FITC
490
520

Phycoerythrin-R, PE
495
578

Peridinin-chlorophyll, PerCP
490
677

Cy-Chrome
495
670

PE-Texas Red
495
620

PE-Cyanine 5
495
670
核酸含量分析
Ethidium Bromide
510 (+ds DNA)
595

Propidium Iodide
536 (+ds DNA)
623

Acridine Orange
480 (+ DNA)
440-70 (+ RNA)
520
650

Thiazole Orange
509 (+ RNA)
533

Pyronine Y
560-562 (+ds RNA)
497 (+ss RNA)
565-574
563
细胞 Viability
Propidium Iodide
536
623

YOPRO-1
480
515

Acridine Orange
480
520

7-AAD
488
670
细胞膜电位
DiO-C6 (3)
485
510
Mitochondrial
膜电位
Rhodamine 123
485
546
细胞内pH值
BCECF-AM
488
Ratio 520/620

SNARF1-AM
514
Ratio 587/640
细胞内钙浓度
Fluo4-AM
488