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第53卷第2 期2024年2 月石油污染土壤微生物修复技术及机理研究进展张钊（河北工程大学能源与环境工程学院，河北邯郸0 56 0 38）摘要：综述了环境微生物技术在石油污染土壤修复中的应用方法，介绍了人为干预提高石油降解微生物治理油污土壤的原位和异位修复技术和微生物去除石油组分的作用机理。针对微生物修复的研究热点多为石油降解微生物的选取及多种微生物的复合菌对石油组分的去除效果，但对微生物技术的实际应用和机理研究相对较少。提出了未来微生物技术修复石油污染土壤的研究和发展方向，包括特定材料对微生物的固定化、利用宏组学与示踪技术进一步明确微生物的降解机理和质粒拼接手段构建高效基因工程菌。关键词：石油污染土壤；微生物修复；吸收；转运机理；功能基因中图分类号：TQ07;TQ09;X53technology and mechanism of oil-contaminated soil(School of Energy and Environmental Engineering of Hebei University of Engineering,Handan 056038,China)Abstract:Microbial remediation has been widely studied due to its low cost,low environmental impactand high efficiency.The research hotspots for microbial remediation are the selection of petroleum-degrad-ing microorganisms and the removal effect of multiple microbial complex bacteria on petroleum compo-nents,but there are relatively few practical applications and mechanism studies on microbial technology.This article sorts out various technical means and practical application research of microbial remediation ofoil-contaminated soil,reports the mechanism of microbial remediation of petroleum pollutants,and putsforward the future research and development direction of microbial remediation.Key words:oil-contaminated soil;microbial remediation;absorption;transshipment mechanism;func-tional genes近年来,石油产品的需求量逐渐增长,石油开采量大，与石油钻探、精炼和运输相关的活动引起石油产品的环境风险增加，这些活动导致的原油渗漏估计为每年6 0 8 0 万t12。石油组分大致分为脂肪烃、芳香烃、石蜡、胶质和沥青质，石油组分中碳氢化合物已有部分被列为优先污染物，对人体和环境健康威胁较大,如苯、甲苯、乙苯、菲、苯并a已经被美国环保局（EPA）划进优先污染物的范围3。石油烃会在介质中扩散并吸附到土壤基质，对土壤的生物群落和理化性质产生不利影响4。由于石油污染土壤所占面积巨大，焚烧和垃圾填埋的传统方法由于能耗和场地的成本过于昂贵，化学修复往往不能避免二次污染问题，而微生物修复由于其成本效益和生态友好性倍受关注。1石油污染土壤的微生物修复技术石油污染土壤的生物修复技术一般可以分为两类,原位修复技术和异位修复技术。二者的区别在于是否需要将污染土壤进行移位和运输。原位修复一般采用土著微生物,经过培养和驯化,并通收稿日期：2 0 2 3-0 3-2 4修改稿日期：2 0 2 3-0 5-11基金项目：国家自然基金面上项目（518 7 8 2 37）作者简介：张钊（19 9 8），男（满族），河北唐山人，在读硕士生，师从郭海娟教授。电话：15532 39 2 547,E-mail：z h a n g z h a o 0 52 0 12 6.c o m应用化工Applied Chemical Industry3文献标识码：A文章编号：16 7 1-32 0 6(2 0 2 4)0 2-0 414-0 5Research progress on microbial remediationVol.53 No.2Feb.2024ZHANG Zhao过添加营养物质、电子受体、提高含氧率、含水率等为干预手段强化修复水平。异位修复则往往需要添加外源微生物并结合人为手段对转移污染土壤进行修复。1.1原位修复技术1.1.1生物通风生物通风是一种强迫氧化的微生物降解方法,其目的是创造好氧条件来促进原位生物降解。因此生物通风通常采用相对较低的空气速率,以延长气体在土壤中的停留时间5。刘沙沙等6 通过土柱模拟,研究了生物通风技术修复柴油浓度污染土壤,结果表明,经3个月的生物通风后,柴油的半衰期为6 0.0 5d,总石油烃最终去除率达到了6 5.3%,其中起主要去除作用的是柴油挥发和生物降解。1.1.2生物刺激和生物强化生物刺激是指向石油污染的土壤中投加石油降解菌生长所需的 N、P等营养元素以及H,02、0,等电子受体，将土壤中的C:N:P调整至适合微生物修复的比例,刺激微生物的生长来达到增加土著微生物生物量，从而达到加第2 期速降解石油污染物的目的。生物强化技术是通过投加一种或几种具备高效石油降解能力的菌株至污染土壤中,从而加快土壤中石油的去除。其核心是投加的菌体需具备高活性和环境竞争力。在实际石油污染土壤修复中，生物强化技术往往与生物刺激相结合。Suja等7 采用生物强化和生物刺激手段联合修复石油污染土壤，向土壤中添加MC1、M C 2 和MC3组成的菌群，同时添加矿物质盐、无机盐培养基和适量的氮磷钾肥,并向土壤中注人空气和释放氧气的化合物,经过7 7 d的处理后发现10%的MC3配合无机盐培养基的处理效果最好，石油烃降解率最高达到了7 9%。邓振山等8 用一株蜡状芽孢杆菌结合生物刺激技术治理石油污染土壤，结果显示处理2 0 d后降解率达到8 0%，实验数据还表明生物刺激在修复前期效果明显优于生物强化。1.1.3生物喷射生物喷射与生物通风类似,起主要去除作用的是微生物的降解，但不同的是生物喷射几乎不能靠污染物的挥发达到去除目的，而是通过饱和区内高的含氧率降解部分有机物。这项技术已经被应用于土壤中苯系物的修复。Kao 等9 对苯系物污染的土壤进行为期10 个月的生物喷射修复,苯系物的去除率超过了7 0%，并且发现影响苯系物降解速率的相关参数有pH、CO,浓度、Fe+浓度、微生物数量和氧化还原电位。1.1.4生物食生物食是利用微生物修复饱和区有机污染物的一种原位修复技术。这种方法通过将污染的地下水抽出并加入氧气、营养物质、降解微生物、表面活性剂等,刺激土著微生物降解石油类有机污染物，再回灌到受污染的土壤中达到生物降解的目的。此方法可以用来减少溶解在地下水以及潜水面之上的毛细上升区中的石油类有机污染物。但研究此方法的文献记载不多，几乎没有实际工程应用。1.2异位修复技术1.2.1生物堆法生物堆法会将污染土壤堆放至一处，通过通人气体、添加调理剂、投加营养成分、控制含水率等方法提高土壤中好氧微生物的降解作用。Kamnikar101将肥与锯木屑混合制成有机肥，利用生物堆法以2 0%的投加量处理42 0 m被燃料油和柴油污染的土壤，既肥能够为微生物提供营养物质，锯木屑可以保持温度并具有一定堆积孔隙,有利于0 2 和CO2的迁移交换,结果表明处理70d苯、甲苯及二甲苯被全部去除。1.2.2生物反应器此方法是将受污染的土壤挖掘出来和水混合搅拌成泥浆，并接种微生物进行修复的方法。以连续流搅拌反应器和土壤泥浆序批式反应器二种最为常见,类似于水处理中的 CSTR张钊：石油污染土壤微生物修复技术及机理研究进展415和 SBR。K u y u k i n a 等制作了一个3m的土壤泥浆反应器，他在0.4m的石油污染土壤中加入1200L自来水搅拌均匀成30%（g/g）的泥浆,以空压机提供氧气，搅拌速率为2 0 r/min温度控制在1830,每周添加2 kg肥料,处理8 周后石油含量由4.9 g/L降低到了0.6 g/L。1.2.3预制床法预制床修复法是通过搭建不渗漏的土壤放置平台，铺以沙子、石子,再将污染土壤置于平台上，添加营养物质、水分或表面活性剂并定期翻动以维持微生物生长。Liu等12 采用预制床的手段对胜利油田的油泥进行2 30 d的生物修复，添加有机肥、粗砂、锯末处理的土壤石油烃去除率为46%，而自然降解组仅有15%的石油烃去除率，石油烃的去除效果明显提高。2微生物修复的作用机理2.1石油烃的吸收机理微生物吸收石油烃的模式大致有3种：直接吸收。由于土壤存在一定的水分含量,有些微生物可以直接吸收溶解在其附近水相的有机物，但大多数有机物的水溶性微乎其微，只有少部分物质能够通过直接吸收的方式供微生物吸收。接触吸收。细胞与石油烃直接接触，微生物能够通过改变自身形态等调控方式实现对石油烃的吸附，但如果含油率过高，石油组分的有机相会形成厚厚的一层油膜,影响微生物的与之接触。强化吸收。某些微生物能够产生生物表面活性剂或乳化剂增强石油烃在水中的分散系,降低物质的疏水性，从而更容易地吸收有机物13-16。微生物产生的生物表面活性剂可以极大程度的提高疏水性物质的降解程度。Witgens 等17 证明铜绿假单胞菌内存在编码鼠李糖基转移酶链 B 的 rhlB 基因,在降解石油烃时会表达并产生鼠李糖脂,有利于微生物接触底物，提高底物的利用率。Ambust 等18 有着相似的结论，他们发现假单胞菌Pseudomonas sp.SA3在降解石油烃时能够产生鼠李糖脂,以降低石油和水之间的表面张力和石油的疏水性,形成乳状液，提高石油的降解效率。Feng等19 研究证明了槐糖脂极大地促进了污染土壤中石油烃的生物降解,槐糖脂加强TPH从污染土壤中的解吸并促进了跨膜运输,TPH的生物利用度明显提高，除此之外实验结果还表明槐糖脂和其他生物表面活性剂还可以作为碳源，通过共代谢作用对难降解石油组分进行生物降解，促进微生物的生长，这符合很多学者认为的糖脂类表面活性剂具备降解石油污染物作用的研究结论。2.2石油烃进入细胞的转运机理石油烃进人细胞的过程涉及到物质在环境与细胞间的迁移、微生物的吸附作用、跨膜运输和细416胞膜结构的改变等2 0-3。Sikema 等2 4 指出石油烃会对微生物细胞产生影响，细胞内外蛋白质结构发生变化,从而改变细胞膜的性质，破坏细胞膜的迁移和能量转化作用,同时胞外酶的活性也会受到一定程度的抑制。Eguchi 等2 5认为微生物降解有机化合物与生物体细胞膜和相关降解酶的性质密切相关。降解的整个过程分为3个步骤,先是细胞膜通过吸附作用接触底物，然后底物穿过细胞膜进人细胞内,细胞膜的穿透率直接影响微生物对底物的吸收利用程度,最后进人膜内的底物与胞内分泌的降解酶结合，发生酶促反应，达到去除污染物的目的。由此可见，土壤中的石油降解微生物首先要和底物进行接触。石油中绝大多数组分的水溶性很低,但许多利用石油烃作为碳源的微生物可以分泌脂肪酸、酯类、蛋白质和胞外聚合物等各种生物表面活性物质，以便利于微生物与烷烃的直接接触2 6。Zosim 等2 7 的研究得出细菌分泌的胞外聚合物具备乳化作用，而且可以改变细胞膜的通透性和黏性,有利于微生物对石油烃的吸附。2.3石油组分的降解机理2.3.1烷烃的降解直链烷烃可被微生物直接降解,其微生物的降解大多通过氧化作用实现，烷烃末端先被氧化成醇,再氧化成相应的酸随后完成矿化作用。许多霉菌和酵母菌降解烷烃的第一次氧化产物为仲醇,随后会氧化为酮，出现这些中间产物就是典型的亚末端氧化。少数情况下，直链烷烃的降解途径也存在特殊情况,如 GeiBdorfer 等2 8 研究发现Acinetobactersp.M1的Finnerty途径在双加氧酶的作用下，依赖分子氧、黄素腺嘌呤二核苷酸和Cu?+生成过氧化醇、过氧醛等完成降解作用。Singh等2 9 研究了烷烃的富马酸降解途径，即在烷烃的末端或亚末端添加富马酸经碳骨架重排后再发生氧化降解。支链烷烃虽然因结构等原因通常比直链烷烃更难降解，但降解原理与直链烷烃相似,都是先在单加氧酶的催化下氧化末端氢原子，生成对应的醇,之后在一系列脱氢酶的作用下生成支链脂肪酸,最后通过矿化作用生成 CO,和H,O。环烷烃的降解类似于饱和链烃的亚末端氧化降解途径,最后开环生成脂肪酸30,只是降解比饱和烷烃更加困难，这里不多做赘述。2.3.2多环芳烃的降解多环芳烃(PAHs)的降解要难于烷烃，不论是在好氧条件下还是厌氧条件下,其降解的难易程度多取决于PAHs 的溶解度、环的数目、取代基的数目、取代基的种类、取代基的位置以及杂环原子性质有关31,降解所遵循的规律大概如下132 31(1)降解微生物的种类对各种PAHs 的降解有明显差异。应用化工(2)低环的PAHs容易被土壤环境中的细菌降解。而高环PAHs具备抗生物降解的性质,很难被微生物直接降解，往往需要以共代谢的方式去除。(3)当苯环结构中增加三个甲基后,其疏水性明显提高,严重降低可生物降解性。(4)增加PAHs 的饱和程度会显著降低生物降解度。（5)微生物多样性有利于微生物种类间的协同作用,能够提高 PAHs的生物降解性。(6)降解过程初期的环氧化是降解过程的最耗时的一步,其之后的降解过程在三环和三环以上进行得很迅速,环氧化的快慢是影响降解周期最重要的因素。(7)PAHs 氧化菌属于有助于降解的功能菌,配合PAHs降解菌投加至污染场地会增加降解速度，是提高生物修复效率的重要手段。(8)PAHs的降解大多数属于好氧降解，且已有应用实例，但厌氧降解仍未得到广泛研究,厌氧降解菌相较于好氧降解菌种类很少。一般环数较多的多环芳烃是通过共代谢作用实现生物降解的。以芪的共代谢降解机理为例,芘在有易降解物质如苯、萘等作为外加碳源时，它们可以成为微生物生长代谢的一级基质,在此前提下,本身为难降解物质的芘可作为二级基质，通过共代谢的方式被微生物利用。一级基质的加人会促使微生物密度增加，提高菌密度和微生物以及其产生的酶活性,并刺激菌在降解易利用碳源的同时提高对芪的降解效果。2.4降解相关的功能基因部分微生物降解石油烃的功能基因及相关酶见表1。由表1可知,石油烃降解的代谢途径中很多相关基因是由质粒编码的，且目前已研究的多数质粒来自假单胞菌属。Ma等40 对6 株假单胞菌进行了质粒消除实验，得出了相关多环芳烃降解基因不在染色体上而在质粒上的结论。Worsey等41研究证明恶臭假单胞菌Pseudomonasputida mt-2的TOL质粒pWWO编码包括甲苯、间二甲苯和对二甲苯在内的几种芳香烃氧化分解代谢所需的所有酶。但也有研究证明相关石油烃降解基因可能是在染色体上发挥作用的。王双燕42 利用第二代测序技术（Ne x t-G e n e r a t i o n Se q u e n c i n g,NG S）对一株假单胞菌DY123-6 进行来了全基因组测序,获得了菌株的全基因组序列,结果显示菌株DY123-6 含有一个环状基因组（3.5Mb，G+C 含量6 3.7 4%），但不含质粒，通过比较基因组学分析，获得了编码降解多环芳烃的双加氧酶基因,这些基因具备降解联苯、菲和萘能力，这说明降解基因也可能位于染色体上。第53卷第2 期表1.微生物降解功能基因及相关酶3Table 1 Microbial degradation offunctional genes and related enzymes降解底物功能基因alkBalkH,alkJ烧烃alkKalkT苯bed硫苏、doxA,doxB,doxD茶、菲doxF茶（上游doxJ途径）nahAanahBnahcnahDnahEnahFnahGnahHnahl水杨酸盐nahN(下游途径)nahL芳香烃nahonahMnahknahJphdAphdBphdDphdEphdFphdGphdH菲phdKphdlphdJ3展望土壤微生物修复相较于废水生物处理起步较晚，仍以理论研究为主，实际应用较少，修复周期相比于物化方法较长。并且微生物修复石油污染物的机理还存在不明确之处,微生物降解相关的转运机理、调控机理、基因的编码位置等还需要更深层次的研究。另外，由于石油污染物的复杂性，微生物自身的修复能力十分有限，对总石油烃的去除率不能达到较高的处理水平。针对这些问题，深化研究可以从如下三个方面展开：(1)根据污染土壤的实际环境情况，可适当结合固定化手段强化微生物修复技术，提高修复效率。张钊：石油污染土壤微生物修复技术及机理研究进展相关酶烷烃羟化酶醛脱氢酶脂酰CoA合成酶红素氧还蛋白还原酶苯双加氧酶萘双加氧酶水杨醛脱氢酶异构酶NAP还原酶顺二氢二醇萘脱氢酶1,2-二羟基萘脱氢酶2-羟基-色烯基-2-羧酸盐异构酶2-羟基-亚苄基丙酮酸盐醛缩酶水杨醛脱氢酶水杨酸盐羟化酶儿茶酚双加氧酶2-羟基黏康酸半醛脱氢酶2-羟基黏康酸半醛水解酶2-氧4-戊烯酸盐水合酶4-羟基-2-戊酮酸醛缩酶乙醛脱氢酶草酰巴豆酸盐脱羧酶2-羟基黏康酸盐异构酶双加氧酶压基双加氧酶压基铁氧化还原蛋白还原酶二氢二醇脱氢酶双加氧酶nahE水合酶-醛缩酶乙醛脱氢酶2-羧基苯甲醛脱氢酶1-羟基-2-萘双加氧酶反-2-羧基苯亚甲基丙酮酸盐水合酶-醛缩酶417(2)通过宏组学和示踪技术等现代手段分析微生物的降解代谢方式,明确石油烃的转运过程和降解酶的调控机理,利用分子技术手段确定降解相关功能基因的具体位置和诱导机制。(3)对高效石油降解微生物进行质粒拼接,构建基因工程菌，提高微生物修复水平的上限。参考文献：1 STRONG P J,BURGESS J E.Treatment methods forwine-related and distllery wastewaters:A review J.Bioremediation 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