WB注意项目及常见问题.doc

WB注意事项及常见问题
注意事项
一、 样本搜集
1. 组织样本
标准上要求用户或我们技术员把组织分切剪碎至研磨管（依据试验需要通知她们取多少组织），并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于-80℃保留。具体详情参考“组织样本搜集注意事项.doc”；
2. 细胞样品
标准上要求用户或我们技术员不要用胰酶把细胞消化下来，尤其是分选对象是膜蛋白时，具体详情参考“细胞样品搜集注意事项.doc”；
二、 总蛋白提取
1. 组织样品
具体详情参考“组织样本搜集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，假如分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；
2. 细胞样品
具体详情参考“细胞样品搜集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，假如分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；
三、 蛋白样本保留
裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片沉淀通常-20℃保留以防万一，提取好蛋白样品分装2份，一份加入上样缓冲液变性后-20℃保留，一份直接-20℃保留；
四、 蛋白变性
提取好总蛋白取一部分（不是全部）加入上样缓冲液进行加热变性（100℃，5min），变性好蛋白应该-20℃保留，冻融后不再需要加热变性；
五、 SDS-PAGE
1. 浓缩胶胶浓度通常为5%，用于压沉样品；
2. 分离胶胶浓度取决于分析对象分子量大小，详情见Western Blotting 全攻略.pdf第4页；
3. 分离胶和浓缩胶高度比为8:3；
4. 电泳结束后，应立即用清洗洁净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；
5. 电泳结束后，应立即冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，造成电泳丝腐蚀；
6. 清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝；
六、 转膜
1. 注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶叠放位置，以确保正确转印方向；
2. 注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶相对大小，以免造成短路；
3. 转印结束后，应立即取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封闭液，这么能够避免膜上杂质残留或膜变干造成背景高问题；
4. 转印结束后，应立即冲洗转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，造成电泳丝腐蚀；
5. 转印结束后，应立即用水泡洗海绵垫和滤纸，以免盐离子沉积，造成转膜时短路，并放在篮子上晾干，假如海绵垫和滤纸不立即晾干，轻易造成海绵垫和滤纸内部结构破坏；
七、 封闭
1. 进行封闭时，应加入足量封闭液（以完全覆盖膜为底限），并确保整个封闭过程中，膜和封闭液充足接触，避免长时间离开封闭液，尤其进行4℃静止封闭过夜时，一定要加入足量封闭液和确保平坦放置；上述注意事项关键为了避免膜变干，造成背景升高；
八、 一抗杂交
1. 一抗稀释百分比：第一次使用时参考具体抗体说明书提议稀释百分比，并依据实际试验结果进行调整；
2. 杂交条件：假如是室温孵育，最少确保孵育1-2小时，并放置脱色摇床上进行摇摆，假如是4℃孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇摆；
3. 应使用专用一抗稀释液进行稀释，使用后进行回收并4℃保留，假如回收稀释抗体用沉淀或长菌，应丢弃；
九、 一抗杂交后洗膜
1. 通常使用标准TBST缓冲液，假如判定因为是一抗原因造成背景过高，能够把NaCl浓度提升到500 nM (标准为150nM);
2. 通常洗涤3次，每次10min，假如判定因为是一抗原因造成背景过高，能够把洗涤次数提升到4-6次；
十、 二抗杂交
1. 二抗稀释百分比：第一次使用时参考具体抗体说明书提议稀释百分比，并依据实际试验结果进行调整；
2. 杂交条件：通常室温孵育，孵育1小时即可（时间延长会产生非特异杂交，从而造成背景过高），并放置脱色摇床上进行摇摆（一定要避免膜变干，不然背景其高）；
3. 应使用封闭液进行稀释，使用后进行不回收；
十一、 二抗杂交后洗膜
1. 通常使用标准TBST缓冲液，假如判定因为是一抗原因造成背景过高，能够把NaCl浓度提升到500 nM (标准为150nM);
2. 通常洗涤3次，每次10min，假如判定因为是一抗原因造成背景过高，能够把洗涤次数提升到4-6次；
十二、 拍照
1. 注意选择曝光时间，同时兼顾工作效率，因选择连续拍照模式，这么总有一个何时曝光时间；
十三、 汇报单整理
1. 原始图片；
2. 对比度和亮度调整图片；
3. 图片说明：上样次序；
4. 灰度值：原始值，数据标准化（同一个样品目标蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值），相对表示量（试验样品数据标准化比值除以参考样品（问用户）数据标准化比值），参考样品相对表示量一定为1；
5. 试验方法：正确一抗，二抗，稀释百分比；
常见问题
一、 没信号
1. 膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：试验失败？抗体失效？；重新进行试验，重新稀释抗体；
2. 膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：试验样品降解？试验样品无该蛋白表示？转膜效率过低？；重新进行试验，复核查找上述原因，以寻求对策；
二、 背景过高
1. 目标条带以外区域有信号，假如是片状，甚至整块膜，通常是封闭不好，膜变干，一抗非特异杂交或二抗非特异杂交造成；假如是条纹状，通常是因为膜上有压痕造成，假如是点状，通常是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充足浸泡；
三、 杂带
1. 目标带以外信号条带为杂带，通常因为一抗特异性不好所造成，假如目标带比杂带信号强，可经过减低一抗稀释百分比，并缩短杂交时间处理；假如目标带比杂带信号弱，在不减低一抗稀释百分比前提下，缩短杂交时间；并提升TBST缓冲液NaCl浓度提升到500 nM；
2. 杂带假如和目标带位置相距较远，能够不优化试验，直接裁剪即可，杂带假如和目标带位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳时间，已经采取上述处理方法；
四、 目标带弱
1. 一抗效价低：提升一抗稀释百分比，提升杂交时间，降低洗膜次数，提升曝光时间，提升上样量；
2. 转膜效率低：检测转膜试剂和耗材，优化转膜条件；
五、 复合问题
上述问题往往同时出现，首先客观冷静分析问题所在，针对问题采取对应策略，有些策略可能相互矛盾，应以处理关键问题为主；