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ELISA 技术在禽流感诊断研究中的应用
摘 要： 禽流感（AI）是目前禽类流行的主要疫病之一，给养禽业和人类健康带来了巨大危害。由于禽流感病毒血清型众多，致病疫情多样，因此，适时的检测和早期快速诊断是预防和控制禽流感的前提条件。ELISA 方法以其特异、 灵敏、 快速、 简便，可迅速检测大量样品，使用仪器设备少，利于基层操作等优点成为 AI 流行病学普查及早期快速诊断的最实用和有效的方法。

关键词： 禽流感 ELISA 诊断

禽流感（Avian Influenza，AI）是由 A 型流感病毒所引起禽类的感染和/或疾病综合征，1878 年首次发生于意大利，目前已在全世界广泛流行，被国际兽疫局确定为 A 类传染病。 禽流感病毒感染后引起的临床症状和病理变化， 因感染禽的种类、年龄、免疫状况、继发或混合感染状况、病程长短及感染毒株的毒力等不同而异，易与多种禽类疫病相混淆。 因此，诸多高致病性禽流感病毒感染致人死亡的事件使禽流感的防制工作提升到前所未有的公共卫生学高度。
禽流感疫情的多样性和公共卫生学意义，使得禽流感的早期、 快速诊断对于疫病的控制尤为重要，传统的鸡胚分离、琼脂扩散试验、血凝抑制试验（HI）等检测禽流感的方法，由于敏感性不高或检验时间较长， 不能满足基层检疫和疫病防制的需要，因此禽流感的确诊必需依赖实验室诊断。 ELISA 检测技术以其高敏感性、高特异性、经济、简便的特点，在畜禽疫病诊断和监测中发挥了重要作用。
1 间接 ELISA
1.1 基于全病毒的间接 ELISA
黄金海等[1]应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的禽流感病毒（H9N2 亚型 AIV）经处理后作为 ELISA 检测方法的包被抗原。并以不同的含量进行包被，建立了定量检测禽流感抗体水平的间接 ELISA 方法。该试验建立的 ELISA 方法不仅可检测出血清中禽流感抗体的 P/N 值，还可用回归方程算出 ELISA 效价，实现定量测定，这为检测鸡群的抗体水平， 制定合理的免疫程序提供了科学的依据。
1.2 基于核蛋白（NP）的间接 ELISA
禽流感核蛋白具有有型特异性，同型流感病毒核蛋白氨基酸具有很高的同源性，因而纯化重组蛋白可以用来代替全病毒作为 ELISA 的诊断抗原。用重组核蛋白作为抗原克服了常规全病毒抗原的许多不利之处， 整个生产过程中不涉及禽流感病毒，因此生物安全性好，不存在散毒的危险，而且生产成本低，易于规模化生产。
李海燕等[2，3]用表达禽流感病毒（AIV）核蛋白基因的杆状病毒感染 Sf9 昆虫细胞，以其表达产物制备抗原，建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（rNP_ELISA）。 根据对 140 份 SPF 鸡血清检测结果的统计分析，确定其判定标准为 OD 值大于0.15 的血清样品为阳性。 用 rNP_ELISA 检测 150 份SPF 鸡血清、194 份非免疫鸡血清及 30 份其它 15种鸡疫病阳性血清均为阴性； 检测 A 型 AIV 的 15个不同亚型 （H1-H15） 毒株的特异性血清均为阳性；对人工接种 AIV 的 SPF 鸡第 3d 即能检出抗体，到第 162d 试验结束时检测仍为阳性。 对 3 138 份鸡血清进行监测，rNP_ELISA 与全病毒间接 ELISA（AIV_ELISA）、琼脂扩散试验（AGP）及血凝抑制试验（HI）的符合率分别为 99.9%、97.1%、98.8%；并能 100%检出 AGP 阳性及疑似、HI 阳性的血清样品。 试验证明，rNP_ELISA 是检测 A 型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速、经济的血清学诊断技术。 其并将成熟的禽流感间接ELISA 快速诊断技术试剂盒化，该试剂盒与进口禽流感间接 ELISA 诊断试剂盒对同样血清样品检测，符合率为 100%。
吴仁蔚等[4]以 AIV 的 H9N2 亚型全长 NP 蛋白为包被抗原，建立了检测 AIV 抗体的间接 NP-ELISA方法。 对 263 份待检血清（包括临床收集的 243 份血清和 20 份 H9N2 亚型 AIV 免疫鸡阳性血清）进行检测，NP-ELISA 与琼脂免疫扩散试验 （AGP）的总符合率为 83.3%，与血凝抑制试验（HI）的总符合率为 92%。 异性试验表明，NP-ELISA 方法可以检测 H5、H7 和 H9 亚型 AIV 特异性抗体， 检测为阳性的血清样品能够被阳性鸡胚尿囊液阻断。敏感性试验证实 NP-ELISA 最早可以检测鸡感染后 7d 的血清样品，并于感染后 10d 确定 100%血清阳性，而AGP 检测直到首免后 21~28d 才出现部分血清阳性，HI 检测直到 10~14d 才出现部分血清阳性，并且 NP-ELISA 要比 HI 敏感 4~40 倍。将禽流感病毒核蛋白（NP）主要抗原域的基因片段（984bp）进行表达纯化，用纯化的重组蛋白作为包被抗原包被酶标板，建立的检测禽流感病毒抗体的间接 ELISA 方法能够区分携带 H5N1 禽流感病毒血凝素、 神经氨酸酶和鸡白介素-18 基因的禽痘病毒活载体疫苗免疫的免疫抗体和 AIV 全病毒免疫的抗体或自然感染抗体[5]。 因此，此方法可以作为该活载体疫苗的一种配套检测方法，区分该活载体疫苗免疫抗体和其他疫苗免疫抗体。以核蛋白（NP）为包被抗原建立的间接 ELISA是检测 AIV 血清型特异性抗体的一种特异、 敏感、快速、经济的血清学检测技术。 此技术不仅克服了以全病毒为包被抗原带来的危险，而且还可以区分活载体疫苗和其他疫苗免疫的区别，但是，不能区别灭活疫苗和自然感染所产生抗体。
1.3 基于血凝素（HA）的间接 ELISA
血凝素是位于病毒囊膜表面的一种蛋白质，具有亚型特异性，可以诱导特异性抗体的产生。因此，利用 HA 蛋白作为包被抗原， 可以直接鉴定到亚型，省时、省力、节约资源。将 H9N2 亚型禽流感病毒血凝素基因扩增、表达、 纯化后作为抗原包被酶标板建立的检测 H9 亚型禽流感抗体的间接 ELISA 方法， 特异性好，与H5、H7 亚型禽流感标准阳性血清没有交叉反应，同时与鸡其他疫病的标准阳性血清呈阴性反应[6]。 敏感性检测表明其阳性符合率、阴性符合率及总符合与进口试剂盒检测结果相比均为 100%。说明以 HA重组蛋白作为诊断 H9 亚型禽流感抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，可用于 H9 亚型禽流感抗体的检测。
1.4 基于非结构蛋白（NS1）的间接 ELISA
NS 基因编码 2 种蛋白质，即 NS1 和 NS2，其中NS1 蛋白在病毒复制及早期的抗病毒免疫应答中具有重要作用。 Skehel 进一步研究表明，NS1 蛋白在病毒复制的早期就大量表达，仅出现于病毒感染的细胞内， 且能诱导机体产生针对 NS1 蛋白的抗体。 这提示 NS1 蛋白可作为一种鉴别诊断标志，通过检测抗 NS1 蛋白的抗体来区分野毒感染和疫苗免疫，并可作为早期感染的依据。杨涛等[7]采用 RT-PCR 技术扩增了禽流感病毒（H5N1）的 NS1 基 因 ，以经过纯化的融合蛋白 MBP-NS1 蛋白为包被抗原，初步建立了间接 ELISA 检测方法，试验证明融合蛋白 MBP-NS1 能够与 H5N1 亚型 AIV 活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应， 而不能够与 H5N1亚型 AIV 灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。 这为今后建立完善的区分疫苗免疫与自然感染动物的ELISA 鉴别诊断方法奠定了基础。分别以 AIV A/goose/Guangdong/2000 （H5N1）的NS1 蛋白和 H5N2 亚型禽流感病毒的 NS1 蛋白作为包被抗原建立间接 ELISA 检测方法，检测人工感染 AIV 和灭活疫苗免疫的 SPF 鸡血清， 结果前者为阳性，后者为阴性[8，9]。 表明该方法能区分活毒感染和灭活疫苗免疫鸡群， 但不具有亚型特异型，具有 A 型流感的特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用，不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法，为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。
2 双抗体夹心 ELISA （DAS-ELISA）
肖运才等[10]以禽流感病毒（AIV）湖北分离株（H9N2 亚型）提纯物为免疫原，制备出鸡抗 AIV 和兔抗 AIV 抗体。 以纯化的鸡抗 AIV IgG 为包被抗体，兔抗 AIV IgG 为第 2 抗体，建立了检测 AIV 抗原的夹心 ELISA 法。结果表明，对已知的阳性样品，用夹心 ELISA 法测得的病毒滴度比血球凝集滴度高 16 倍以上，且能检出其它亚型的禽流感病毒；与其他禽类传染病病毒均无交叉反应，说明本方法有很高的特异性及敏感性。
罗青平等[11]以单克隆抗体 2H4 为捕获抗体包被酶标板，以纯化的兔血清为第 2 抗体，建立了快速检测 AIV H5N1 抗原的双抗体夹心 ELISA 方法。试验证明该方法对 AIV 的检测灵敏度达 4.5μg/ml，并与禽流感诊断金标准鸡胚分离鉴定作对比，结果显示 DAS-ELISA 方法与鸡胚分离鉴定符合率达98.2%； 并且与其他亚型及禽类常见病毒性疾病无交叉反应。 说明该方法具有简单、快速、敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于禽类群体 AIV H5N1 感染的早期检疫、实验室诊断的标准化及流行病学调查。
肖丹、王晓华等[12，13]以相似的方法建立了检测H5 亚型的双夹心 ELISA 方法，敏感性试、特异性检
验表明，该种方法均较 HI 试验敏感，且与其他病毒无交叉反应。
廖志勇等[14]以 H5 血凝素和携带 H5 全长基因的质粒免疫 Balb/c 小鼠制备 mAb，通过筛选建立了以单克隆抗体 H5M9 为捕获抗体，辣根过氧化物酶标记单克隆抗体 H5M11 为检测抗体的双抗体夹心ELISA；检测多株 H5N1 病毒和 H5 血凝素的最低检出值为 1/32 血凝单位， 检测 A 型流感病毒 H1N1、H3N2、B 型流感病毒以及 H7、H9 血凝素均为阴性。试验证明该方法是一种灵敏度高、特异性强的测定H5 抗原的 ELISA 捕获法， 可应用于禽流感病毒H5N1 感染的实验室早期诊断。
双抗体夹心 ELISA 方法的建立， 病毒的检出，不仅为禽流感病鸡群的临床检验提供了一种方便、敏感、快速的检测方法，而且为开展流病学调查研究奠定了很好的基础，为最终控制和消灭这种疾病提供可靠依据和技术保证，具有很高的使用价值。
3 Dot-ELISA以混合纤维素酯微孔滤膜为固相载体，用自制的禽流感全病毒抗原和酶标抗体，建立了禽流感抗体斑点-ELISA 检测法， 出现明显清晰的斑点者判为禽流感抗体阳性。 该方法对 SPF 鸡血清及新城疫、 传染性法氏囊病等其它 11 种鸡疫病阳性血清均为阴性，对不同亚型特异性的禽流感病毒（AIV）分型血清、琼扩（AGP）阳性血清及血凝抑制（HI）阳性而 AGP 疑似的血清样品均呈阳性； 对人工接种AIV 的 SPF 鸡第 3d 即能检出抗体阳性， 第 5~117d可全部检出[15]。
张春杰等[16]采用 AIV 灭活油乳苗（H9N2）对AIV 非免疫鸡进行接种并获取高免血清，取高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法，经过 Sephadex G25 层析柱提纯后获得纯度很好的 IgG。 将 IgG 应用过碘酸钠法标记辣根过氧化酶（HRP），制备禽流感酶标抗体 （IgG-HRP）， 建立了一种优化的 AIV 双抗夹心Dot-ELISA 检测法。 优化后的检测方法可在 2.5h 内诊断结果， 制备好的包被膜在 4℃下保存 2 个月不影响其效果。 而且敏感性提高了 3 倍，与新城疫病毒液、传染性支气管炎及减蛋综合症病毒液无交叉反应。
Dot-ELISA 采用混合纤维素酯膜或硝酸纤维素膜代替微量反应板， 即保留 ELISA 方法的特异性、敏感性，结果又不需要特殊仪器分析，可肉眼判定，大大缩短了诊断时间。 与间接 ELISA 法比较，不仅其特异性、敏感性、重复性相一致，而且结果可用肉眼判定，更适合现地禽流感抗体监测及流行病学调查。
4 抗原捕获 ELISA宋建领等[17，18]
采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体，研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA 检测方法， 用于检测 H5N1 和 H9N2 亚型禽流感病毒。 结果表明，采用高纯度的特异性多克隆抗体和单克隆抗体，建立的抗原捕捉 ELISA，可排除正常鸡胚组织或尿囊液的本底干扰，具有良好的敏感性、特异性、重复性和稳定性，可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。
王传彬等[19]用亲和层析法纯化抗禽流感病毒H5 亚型血凝素单克隆抗体，包被微量反应板，用于捕获病毒抗原，再用生物素标记的单抗和酶标亲和素来检测病毒血凝素抗原。 用该方法检测 H1-H15亚型 AIV 标准毒株和 H5、H7、H9 亚型 AIV 分离株，并与血凝和血凝抑制试验比较，评价其敏感性和特异性。 结果表明该 ELISA 反应体系能检出H5N3 标准株和所有 20 株国内 H5 亚型 AIV 分离株， 而与其他 14 个血凝素亚型的 AIV 标准株、15个 H9 亚型 AIV 分离株和 2 个 H7 亚型 AIV 分离株均无交叉反应。曹振等[20]以禽流感病毒（AIV）H5 亚型分离株 A/Chicken/Guangdong SZ/1 /00 （H5N1）作为免疫原，建立了通过生物素 - 亲和素放大系统的单抗-生物素捕获 ELISA 检测方法， 取得了与王传
彬[9]相似的试验结果。
另外，采用 H5（H7）亚型多克隆抗体（羊血清）作为捕获抗体，H5 （H7）亚型 HA 特异性单克隆抗体为检测抗体纯化，建立了检测 H5（H7）亚型禽流感病毒的抗原捕捉 ELISA 方法， 和其他禽类病毒以及其他亚型禽流感病毒均没有明显的交叉反应性[21，22]，说明该方法对 H5 （H7）亚型高致病性禽流感病毒具有很好的特异性。
5 小结
自 1994 年在广东省首次分离到 H9N2 亚型禽流感病毒以来，先后在家禽体内分离获得了 H5N1、H5N2（中国台湾）等多种禽流感病毒。 中国香港、泰国、 越南暴发的 H5N1、H9N2 亚型禽流感， 出现了病毒突破种间屏障感染人的病例，赋予了禽流感全新的公共卫生意义。
对于禽流感的防控措施， 主要有 2 种形式，一种是采取以扑杀和生物安全方法为主的防控措施另一种是采取扑杀、强制性免疫和生物安全方法相结合为主的扑灭措施，我国属于后者。因此，对于禽流感的及时监测、诊断，在禽流感的防控上就尤为重要。目前，对于禽流感的监控，主要是抗体的检测和病毒的分离两方面，ELISA 是 AI 流行病学普查
及早期快速诊断的一种有效和实用的方法。不同包被抗原的间接 ELISA 方法，不仅可以检测禽流感抗体水平， 还可以进一步区分不同亚型病毒感染，疫苗免疫还是活病毒自然感染产生的抗体。双抗体夹心 ELISA、抗原捕获 ELISA 方法的建立，自然感染病毒的查获，使得对于禽流感的诊断能进一步及早发现、能最大限度的缩小范围，及早控制疫情。 Dot-
ELISA 的建立可以使检测工作在基层检疫部门更容易的推广进行，更有利于禽流感的时时监控。 虽然目前国内建立了多种 ELISA 检测方法，但大多数还是停留在实验室研究阶段， 完善的、 商品化的ELISA 检测试剂盒还没有很好的开发推广；对于建立 ELISA 检测方法的抗原、抗体、信号放大系统、干扰因素去除等方面还有不尽完善的方面，这些都还有待改进。
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作者简介：
乔振国，

ELISA 技术
在禽流感诊断研究中的应用

日期：二〇一一年四月