发酵豆粕和豆粕替代部分鱼粉...和免疫相关基因表达量的影响_徐粒潇.pdf

doi:10.7541/2023.2022.0493发酵豆粕和豆粕替代部分鱼粉对银鲑幼鱼生长性能、血清生化指标、肝脏抗氧化能力和免疫相关基因表达量的影响徐粒潇 何楚景 刘永强 许 剑 童 潼*杨秋月 王佳婧 张 琴*(广西民族大学海洋与生物技术学院,广西多糖材料与改性重点实验室,广西海洋微生物资源产业化工程技术研究中心,广西民族大学海洋生物资源保护与利用校级重点实验室,南宁 530006)摘要:为探究发酵豆粕和豆粕替代部分鱼粉对银鲑(Oncorhynchus kisutch)幼鱼生长性能、血清生化指标、肝脏抗氧化能力和免疫相关基因mRNA表达量的影响,试验设置4种等氮等脂等能的饲料(粗蛋白约为42%、粗脂肪约为15%):对照组为:添加41%鱼粉的饲料(FM组;鱼粉蛋白占比27%);试验组分别为在FM组中用豆粕替代部分鱼粉(SM组;鱼粉蛋白占比17%,豆粕蛋白占比10%)、在FM组中用豆粕和发酵豆粕混合替代部分鱼粉(FSM5组;鱼粉蛋白占比17%,豆粕蛋白占比5%,发酵豆粕蛋白占比5%)、在FM组中用发酵豆粕替代部分鱼粉(FSM10组;鱼粉蛋白占比17%,发酵豆粕蛋白占比10%),饲养体重为(102.250.24)g的银鲑幼鱼10周。生长结果表明,FSM10组的增重率、特定生长率、日增重率、肥满度与对照组没有显著差异(P0.05);FSM5组特定生长率、增重率和日增重显著低于对照组(P0.05),但显著高于SM组(P0.05)。肌肉成分结果显示,各组水分、灰分和粗蛋白没有显著差异(P0.05),SM组的粗脂肪显著低于对照组(P0.05);FSM5组血清葡萄糖、白蛋白和总蛋白含量显著低于对照组(P0.05),但显著高于SM组(P0.05)。肝脏抗氧化能力试验结果表明,FSM10组超氧化物歧化酶和过氧化氢酶酶活显著高于对照组(P0.05),丙二醛含量显著低于对照组(P0.05);FSM5组过氧化氢酶酶活和还原型谷胱甘肽含量显著高于SM组(P0.05),丙二醛含量显著低于SM和对照组(P0.05),但显著低于FSM10组(P0.05)。肝脏免疫和炎性相关基因试验结果表明,FSM10组sod-3、lyz、tlr-3和c3基因mRNA表达量显著高于对照组(P0.05);各组间il-6和hsp-70基因mRNA表达量无显著差异(P0.05);FSM5组lyz和tlr-3基因显著高于SM组。综上所述,在试验条件下,使用发酵豆粕替代10%鱼粉蛋白对银鲑生长性能和血清成分没有不良影响,对肝脏抗氧化能力和免疫基因表达具有积极的促进作用,因此可以在银鲑饲料中使用发酵豆粕替代10%的鱼粉蛋白。关键词:发酵豆粕;生长性能;血清生化指标;抗氧化能力;基因表达;银鲑幼鱼中图分类号:S965.1 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2023)09-1374-12 银鲑(Oncorhynchus kisutch),是鲑鳟中最有养殖前景的新品种,近几年开始在中国推广养殖。目前,中国养殖银鲑主要是以投喂配合饲料为主,为了缩短养殖周期以提高经济效益,现阶段银鲑商业第 47 卷 第 9 期水 生 生 物 学 报Vol.47,No.9 2023 年 9 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAS e p.,2 0 2 3 收稿日期:2022-12-08;修订日期:2023-01-13基金项目:山东省重大科技创新工程项目(2019JZZY020710);广西民族大学引进人才科研启动项目(2018KJQD14);广西创新驱动发展专项资金项目(桂科AA17204044);广西民族大学相思湖青年学者创新团队项目(2018RSCXSHQN02)资助 Supported by theShandong Provincial Key Research and Development Programs(2019JZZY020710);Scientific Research Foundation for theIntroduced Talents of Guangxi Minzu University(2018KJQD14);Innovation Driven Development Special Fund Project ofGuangxi(AA17204044);Innovation Team Fund Project of Young Xiangsi Lake Scholars of Guangxi Minzu University(2018RSCXSHQN02)作者简介:徐粒潇(1998),男,硕士研究生;主要从事水生动物营养与饲料研究。E-mail:通信作者:童潼(1982),男,助理研究员;E-mail: 张琴(1982),女,研究员;E-mail:*为共同通信作者饲料中鱼粉(FM)仍处于较高水平,一般在40%50%左右1,这种方式不仅成本高昂2,而且过量投喂的饲料沉积在水底容易造成水体环境污染,暴发疾病等3。在如今水产饲料行业追求低成本、营养精准化的大背景下,寻找适宜的蛋白源替代鱼粉对于银鲑产业的发展极为重要。目前,在鲑鳟饲料鱼粉的替代研究中,主要使用植物蛋白(如大豆蛋白、棉籽粕蛋白等)4,5、昆虫粉6及一些家禽副产物7作为替代源,而使用豆粕的研究相对较少。与上述材料相比,豆粕(SM)来源广泛、易于获取、质量稳定且价格低廉,被认为是替代鱼粉的优良选择。然而豆粕中的抗营养因子会阻止养殖动物对蛋白质的吸收811,严重制约了豆粕在饲料中的添加量。为了提高养殖动物的饲料消化率及对饲料中营养物质的利用率,研究必须对豆粕中抗营养因子的活性进行钝化或者消除,使豆粕成为一种优质植物蛋白源,以提高动物生产性能。发酵豆粕(FSM)通过生产益生菌和益生元,提高动物的抗氧化能力、营养物质消化率和免疫功能。发酵豆粕的粗蛋白含量较未发酵豆粕有所提升,必需氨基酸的组成结构也更为合理12。近年来,国内外已有许多研究表明,采用发酵豆粕替代鱼粉不会对水产动物生长产生负面影响1316。因此本研究使用植物乳酸菌发酵豆粕和豆粕替代饲料中不同比例的鱼粉蛋白,制备4种等氮等脂等能饲料,对银鲑幼鱼进行为期10周的养殖试验,以银鲑幼鱼生长性能、血清生化指标、肝脏抗氧化能力和肝脏免疫相关基因表达量为指标,从生长性能、抗氧化酶活及基因转录水平角度讨论发酵豆粕和豆粕替代部分鱼粉蛋白对银鲑幼鱼生长、抗氧化机能及免疫机制的影响,以期为银鲑配合饲料的研发优化和银鲑养殖业的健康发展提供理论依据。1 1 材料与方法 1.11.1 饲料制备试验豆粕(SM)由潍坊康科润生物科技有限公司友情提供,发酵豆粕(FSM)的制备在广西民族大学海洋生态学实验室完成,营养水平及抗营养因子含量由上海璠瑞科技有限公司测定(表 1)。以往的研究表明,饲料中植物蛋白对鱼粉蛋白的替代量以不超过10%为宜1719,试验据此制备了4种等氮等脂等能的饲料(表 2),对照组为添加41%鱼粉的饲料(FM组 鱼粉蛋白占比27%);试验组分别为在FM组中用豆粕替代部分鱼粉(SM组 鱼粉蛋白占比17%,豆粕蛋白占比10%)、在FM组中用豆粕和发酵豆粕混合替代部分鱼粉(FSM5组 鱼粉蛋白占比17%,豆粕蛋白占比5%,发酵豆粕蛋白占比5%)、在FM组中用发酵豆粕替代部分鱼粉(FSM10组 鱼粉蛋白占比17%,发酵豆粕蛋白占比10%)。饲料制备方法如下:所有原料按配方量称取,固体原料均匀混合后,经过超微粉碎后过60目筛;将超微粉碎后的固体原料与配方量部分鱼油、大豆油混合均匀;通过调质器调质熟化,然后用膨化机膨化挤压制成粒径为35 mm的颗粒,最后在鼓风干燥箱内烘干;将配方量剩余部分鱼油通过真空后喷涂工艺,将液体均匀喷涂在饲料颗粒表面即可。1.21.2 饲养管理试验于辽宁省本溪市虹鳟鱼良种场进行,试验用银鲑幼鱼苗购买自该场,试验开始前用暂养饲料(粗蛋白42%、粗脂肪15%)暂养2周,停止投喂24h后,挑选外观正常、体质健康,初重为(102.250.24)g的银鲑幼鱼240尾,随机平均分成4组,每组设3个重复,每个重复20尾,放养于网箱中(1.0 m1.0 m1.2 m),每个网箱间隔1 m。在试验期间每天分别于8:00、12:00和16:00饱食投喂,根据摄食情况及时调整投饲量。在整个试验期间,水温1018;水中溶氧量6.0 mg/L,养殖周期为10周。1.31.3 样品采集养殖周期结束前将鱼禁食24h,捞取各网箱鱼,称重并记录每组鱼的总重量和存活尾数,以计算生长指标。分别从各网箱中随机挑选6尾银鲑,使用MS-222进行麻醉,使用无菌注射器从尾部静脉采表 1 豆粕和发酵豆粕营养组成及抗营养因子含量Tab.1 Nutritional composition and anti-nutritional factor contentof soybean meal and fermented soybean meal指标Index豆粕Soybean meal发酵豆粕Fermented soybean meal营养水平Nutrient level粗蛋白Crude protein(%)43.280.2151.210.33粗脂肪Crude lipid(%)1.840.051.930.09抗营养因子Anti-nutritional factor胰蛋白酶抑制因子Trypsin inhibitors(mg/g)66.131.3615.150.58大豆球蛋白Glycinin(mg/g)141.131.7330.541.44-伴大豆球蛋白-Conglycinin(mg/g)105.011.7437.241.50脲酶Urease(U/g)8.010.181.900.159 期徐粒潇等:发酵豆粕和豆粕替代部分鱼粉对银鲑幼鱼生长性能、血清生化指标、肝脏抗氧化能力和免疫相关基因表达量的影响1375集全血,4静置12h,4000g低温离心15min,小心采集上层淡黄色的血清样品,用于血清生化指标检测。精确分离肝脏等组织,用生理盐水快速漂洗后用吸水纸吸干水分并记录重量,随后置于液氮中快速冷冻,在80环境中储存,用于计算肝体比、脏体比,测定肝脏抗氧化能力及免疫相关基因mRNA相对表达量。用无菌的解剖刀和解剖剪取银鲑背鳍上的肌肉,剔除鱼皮及鱼刺,用吸水纸擦干后置于80中保存,用于体成分测定。1.41.4 样品分析生长结果计算(Weight gain rate,WGR,)=(g)-(g)(g)100(Specific growth rate,SGR,/d)=ln(g)-ln(g)(d)100(Daily growth rate,DGR,g/d)=(g)-(g)(d)(Condition factor,CF,g/cm3)=(g)(cm)3100(Hepatosomatic index,HSI)=(g)(g)100(Viscerosomatic index,VSI)=(g)(g)100(Survival rate,)=100体成分测定水分含量采用105烘箱干燥恒重法(GB/T 6435-2014)测定,粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432-2018)测定,粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433-2006)测定,粗灰分含量采用550灼烧法(GB/T 6438-2007)测定。血清及肝脏生化指标测定血清生化指标、肝脏抗氧化能力采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定,其中葡萄糖(GLU)采用葡萄糖氧化酶法;总胆固醇(T-CHO)采用COD-PAP法;白蛋白(ALB)采用溴甲酚绿法;总蛋白(TP)采用BCA法;碱性磷酸酶(AKP)采用微量酶标法;谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)采用微板法。超氧化物歧化酶(SOD)采用WST-1法;丙二醛(MDA)采用TBA法;过氧化氢酶(CAT)采用钼酸铵法;还原型谷胱甘肽(GSH)采用微板法。基因mRNA表达量在肝脏免疫相关基因表达量测定实验中,提取肝脏总RNA、反转录和qPCR反应均采用湖南艾科瑞生物工程有限公司所生产的试剂盒进行。检测基因有超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,sod-3)、溶菌酶(Lyso-zyme,lyz)、补体C3(Complement C3,c3)、热休克表 2 饲料组成及营养水平(%干饲料)Tab.2 Composition and nutrient levels of diets(%dry diet)原料名称Ingredient组别GroupFMSMFSM5 FSM10鱼粉Fish meal41.50 26.00 26.0026.00豆粕Soybean meal022.80 10.960发酵豆粕Fermenter soybean meal009.9519.41鸡肉粉Chicken powder10101010虾粉Shrimp powder10101010面粉Flour17.88 17.64 17.8417.84淀粉Starch 3.02 3.01 3.01 3.01纤维素Cellulose 7.1 0 1.5 3.1 鱼油Fish oil 4.01 4.21 4.21 4.21大豆油Soybean oil 4.01444磷酸二氢钙Ca(H2PO4)2 1.01 1.01 1.01 1.01矿物质预混物Vitamins premixa 0.52 0.52 0.52 0.52维生素预混物Minerals premixb 0.52 0.52 0.52 0.52氯化胆碱 Choline chloride 0.3 0.3 0.3 0.3 维生素C Vitamin C 0.1 0.1 0.1 0.1 营养水平Proximate composition粗蛋白Crude protein(%)41.98 41.72 41.7041.81粗脂肪Crude lipid(%)15.22 15.35 15.2415.31总能Gross energy(MJ/kg)18.24 18.58 18.4918.44注:a每千克矿物质预混料含有(mg/kg):AlK(SO4)212H2O,123.7;CaCl2,17879.8;CuSO45H2O,31.7;CoCl26H2O,48.9;FeSO47H2O,707.4;MgSO47H2O,4316.8;MnSO44H2O,31.1;ZnSO47H2O,176.7;KCl,1191.9;KI,5.3;NaCl,4934.5;Na2SeO3H2O,3.4;Ca(H2PO4)2H2O,12457.0;KH2PO4,9930.2;b每千克维生素预混料含有(IU or g/kg):视网膜棕榈酸,10000 IU;VD3,4000 IU;膜接合生育醇,75.0 IU;甲萘醌,22.0 g;盐酸硫胺素,40.0 g;核黄素,30.0 g;D-泛酸,150.0 g;盐酸吡哆醇,20.0 g;内消旋肌醇,500.0 g;生物素,1.0 g;叶酸,15.0 g;抗坏血酸,200.0 g;烟酸,300.0 g;VB12,0.3 gNote:acomposition(mg/kg mineral premix):AlK(SO4)212H2O,123.7;CaCl2,17879.8;CuSO45H2O,31.7;CoCl26H2O,48.9;FeSO47H2O,707.4;MgSO47H2O,4316.8;MnSO44H2O,31.1;ZnSO47H2O,176.7;KCl,1191.9;KI,5.3;NaCl,4934.5;Na2SeO3H2O,3.4;Ca(H2PO4)2H2O,12457.0;KH2PO4,9930.2;bcomposition(IU or g/kg vitamin premix):retinal palmitate,10000IU;cholecalciferol,4000 IU;-tocopherol,75.0 IU;menadione,22.0 g;thiamineHCl,40.0 g;riboflavin,30.0 g;D-calciumpantothenate,150.0 g;pyridoxineHCl,20.0 g;meso-inositol,500.0g;D-biotin,1.0 g;folic acid,15.0 g;ascorbic acid,200.0 g;niacin,300.0 g;cyanocobalamin,0.3 g1376水 生 生 物 学 报47 卷同源70 kD蛋白(Heat shock cognate 70 kD protein-like,hsp-70)、Toll样受体3(Toll like receptor 3,tlr-3)、Toll样受体7(Toll-like receptor 7,tlr-7)和干扰素6(Interleukin-6,il-6)。基因扩增引物的设计及合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成,具体序列见表 3。qPCR使用两步法完成,具体步骤如下:95、10s、1个循环;62、30s并采集荧光值、40个循环;95熔解曲线检测反应特异性。设置参照基因-actin,根据2Ct计算法进行相对定量后,分析肝脏中基因相对表达量。1.51.5 数据处理及分析使用SPSS 22.0软件对所有数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA),若差异达到显著水平(P0.05)则用Duncan氏法进行差异显著多重性比较,结果以平均值标准误(meanSE)表示。2 2 结果 2.12.1 发酵豆粕和豆粕替代鱼粉对银鲑幼鱼生长性能的影响如表 4所示,FSM10组SGR、WGR和DGR与FM组没有显著差异(P0.05),FSM5组次之(P0.05),SM组显著低于其他各组(P0.05)。FSM10组与FM组、FSM5组CF没有显著差异(P0.05),但显著高于SM组(P0.05)。各组间HSI、VSI和成活率没有显著差异(P0.05)。2.22.2 发酵豆粕和豆粕替代鱼粉对银鲑幼鱼肌肉组成的影响如表 5所示,各组体成分中的水分、粗灰分和粗蛋白差异不显著(P0.05);而SM组粗脂肪显著低于FMS10组和FM组(P0.05),但与FSM5组没有显著差异(P0.05),FM、FSM5和FSM10组粗脂肪没有显著差异(P0.05)。2.32.3 发酵豆粕和豆粕替代鱼粉对银鲑幼鱼血清生化指标的影响如表 6所示,FSM10组血清GLU和TP与FM组表 3 银鲑各检测基因与-actin参照基因引物序列Tab.3 Primer pairs of test genes and-actin genes for coho salmon基因Gene引物序列Primer sequence(53)扩增长度Amplicon size(bp)登录号Accession No.-actinTGACCCAGATCATGTTTGAGACC146XM_031811226.1CTCGTAGATGGGTACTGTGTGGGsod-3GGGAGCCTGCTACATGGTAATGC108XM_020497014.2CCTTCTTCTCTGCTGTCGATGATGGlyzGCTGTTGTTGTTCTCCTGCTTGTG109XM_020457770.2TGTTTCCAGCGTAGCCATCCATTCc3GAGGAAAGGTGAGCCAGATG106XM_031786592.1TGTGTGTGTCGTCAGCTTCGhsp-70CCCCTGTCCCTGGGTATTG121XM_020485729.2CACCAGGCTGGTTGTCTGAGTtlr-3GCCCTATGTCGTTCGTCCATGTG146XM_020497175.2GTTGGCGATGTTGTTGTTGCTGAGtlr-7GGTATGGAGAAGGCAGTCTGTTTGG106XM_020458752.2CCATGCTAAGGTACGCCAGGTTGil-6AGAGGACCTGTCTGCCAGTG82XM_020507339.2AACGCTGGTCTTCCTCTCCC表 4 发酵豆粕和豆粕替代鱼粉对银鲑幼鱼生长、成活率及脏器指数的影响Tab.4 Effects of replacing fish meal with fermented soybeanmeal and soybean meal on the growth indices,survival rate andviscerosomatic index of juvenile coho salmon组别GroupFMSMFSM5FSM10初始体质量IBW(g)102.170.44102.330.60102.330.73102.170.44终末体质量FBW(g)342.248.66a267.467.40c308.927.78b357.296.05a特定生长率SGR(%/d)1.730.03a1.370.03c1.580.04b1.790.02a增重率WGR(%)234.967.96a161.316.19c201.907.85b249.684.61a日增重DGR(g/d)3.430.12a2.360.10c2.950.11b3.640.08a肥满度CF(g/cm3)0.930.00a0.920.00b0.930.00ab0.930.00a肝体比HSI1.260.041.240.041.290.021.360.05脏体比VSI10.190.7011.460.5911.330.7210.250.49成活率SR(%)96.673.3391.671.6793.331.6796.671.67注:同一行相同右上角含有相同英文上标字母或无上标表示无显著差异(P0.05);下同Note:In the same row,values with different small lettersuperscripts are significantly different(P0.05),the WGR,SGR and DGR of the FSM5 diets were significantly lower than that of the FM controlgroups but significantly higher than that of the SM diets(P0.05).There was no significant dif-ference in moisture,crude ash,crude protein among groups(P0.05),but the crude fat of the SM diets was signific-antly lower than that of the FM control groups(P0.05)and therewere no significant differences in alkaline phosphatase(AKP),aspartate aminotransferase(GOT)and alanine amino-transferase(GPT)among groups(P0.05),but the GLU,ALB,TP of the FSM5 diets were significantly lower than theFM control diets but higher than the SM diets.The activities of superoxide dismutase(SOD)and catalasehe(CAT)ofthe FSM10 diets were significantly higher than that of the FM control groups(P0.05).The malondialdehyde(MDA)of the FSM10diets were significantly lower than that of the FM control groups(P0.05).The CAT and G-SH of FSM5 of diets wewhigher than the SM diets but the MDA wew lower than it.The SOD of FSM5 were lower than FSM10 but have not sig-nificant differences with the FM control diets.The relative mRNA expression of gene sod-3,lyz,tlr-3 and c3 of theFSM10 diets were significantly higher than that of the FM control groups(P0.05).There were no sig-nificant differences in the relative mRNA expression of gene il-6 and hsp-70 among groups(P0.05).The relativemRNA expression of gene lyz and tlr-3 of FSM5 diets were higher than SM diets.Overall,under the experimental con-ditions,using fermented soybean meal replace 10%fish meal protein had no significant differences on growth perfor-mance and hematology of juvenile coho salmon,but had positive effect on liver antioxidant capacity and immune re-lated gene mRNA expression.Therefore,fermented soybean meal could be used instead of 10%fish meal protein in ju-venile coho salmon diets.Key words:Fermented soybean meal;Growth performance;Hematology;Antioxidant activities;Gene expression;Coho salmon(Oncorhynchus kisutch)9 期徐粒潇等:发酵豆粕和豆粕替代部分鱼粉对银鲑幼鱼生长性能、血清生化指标、肝脏抗氧化能力和免疫相关基因表达量的影响1385