氟苯尼考的高效液相色谱检验方法.doc

武汉轻工大学
毕业论文

论 文 题 目：鸡血浆中氟苯尼考高效液相色谱检测办法
Development of a HPLC for determination
of florfenicol in chicken plasma

姓 名： 吕阳
学 号：
院 （系） 动物科学与营养工程学院
专 业 动物生物技术
指引教师 刘宇

6月1日

目 录
摘 要 1
Abstract 2
第一章 绪 论 3
1氟苯尼考研究进展 3
1.1氟苯尼考药物信息 3
1.2氟苯尼考临床应用 4
1.3氟苯尼考检测办法 5
2研究目与意义 6
3研究内容 6
第二章 实验研究 7
1 材料与办法 7
1.1实验材料 7
1.2实验动物 7
1.3实验办法 7
2 成果与计算 8
2.1波长选用 8
2.1工作曲线 10
2.2回收率与精密度 10
2.4 HPLC检测图谱 11
3讨论 13
第三章 结论与建议 14
1 结论 14
2创新点 14
3有待进一步研究问题 14
参照文献 15
致 谢 16

摘 要

本文建立了鸡血浆中氟苯尼考含量高效液相色谱检测办法，办法线性范畴为1.0～200 µg/ml，线性方程为y = 50x + 170000（r =0.9994），回收率达到86.3%～98.5%，办法定量限最低为0.1 µg/ml，日内与日间相对原则偏差均不大于5%。本法色谱柱使用Waters 04590型Symmetry-C18柱（4.6×150 mm,5μm），柱温为30℃，流动相使用乙腈：水=27:73（V:V），进样量10 µL，流速1.0 ml/min，紫外检测波长为230nm。经验证，本办法具备简便快捷、定量精确，线性关系良好，回收率较高等长处，可觉得氟苯尼考药物代谢动力学研究提供定量根据和检测基本。

核心词： 氟苯尼考，高效液相色谱，鸡

Abstract

This paper established the chicken florfenicol in plasma of high performance liquid chromatography (HPLC) method，the linear relationship between the absorbance and concentration of tilmicosin was in the range of 1.0 to 200μg/ml with a minimum detection limit of 0.1μg/ml (r = 0.9997)，the linear equation：y = 12674x + 16319，the recoveries ranged from 86.3% to 98.5%，the values of intra-day relative standard divination and inter-day relative standard divination were less than 5%.Waters 04590 Type Symmetry-C18 column (4.6 × 150 mm，5μm) was used in the analysis,a mixture of acetonitrile-water,at a flow rate of 1.0 ml/min was used as mobile phase，passing through the column at 30 ℃. Ultraviolet detection was performed at the wavelength of 230nm.

Key words：High Performance Liquid Chromatography,Florfenicol，Chicken

绪 论

1 氟苯尼考研究进展

1.1 氟苯尼考药物信息
氟苯尼考（florfenicol）[1]又称作为氟甲砜霉素，由于其拥有广泛抗菌谱，在体内极易吸取，分布较为广泛，治疗剂量下未发现毒副作用，防治效果明显，对于敏感菌所引起动物细菌性疾病具备极佳治疗效果，广泛应用于养殖业中，是兽用药物中当前正在广泛推广使用一种新型氯霉素类广谱抗菌药。现如今，氟苯尼考已经在水生动物、禽类、猪、反刍动物以及其她畜禽细菌性疾病[2]防止和治疗中广泛使用，当前国内已经通过了该药审批。
1.1.1 性状与构造
纯净氟苯尼考性状为结晶性粉末，白色或类白色，无臭。在普通状况下，在有机溶剂中溶解度较高，溶解在水中剂型大多为混悬液。氟苯尼考在二甲基甲酰胺中溶解度极高，溶解于甲醇，溶剂为冰醋酸时略微溶解，水或氯仿时中溶解度极低[3]。浓度为0.5%氟苯尼考水溶液酸碱度大概在4.5～6.5范畴内[4]。
市场上出售氟苯尼考商品名称（国际通用）多数称之为Florocol和Nuflo[5]。氟苯尼考化学式为C12H14Cl2FNO4S ，其相对分子质量为358.22，化学构造式[6]如图1：
图1 氟苯尼考构造式

1.1.2 药效学
氟苯尼考是属于氯霉素类广谱抗菌药，与氯霉素（CHL）和甲砜霉素（THI）具备相似作用机理和抗菌谱，它可以与细菌有效地特异性结合，可以通过减少有关酶活性从而使肽链延伸受到抑制作用，进而干扰甚至丧失了细菌合成蛋白质功能[7]。然而，构造修饰与改造令氟苯尼考与CHL和THI相比，明显增强了安全性和有效性。在构造上，氟苯尼考用氟原子取代了CHL和THI中丙烷链上第3个碳原子位置上羟基，从而对菌体蛋白乙酰化反映产生阻碍和抑制作用，进而使氟苯尼考不受有关酶影响，避免了药物灭活。因而，氟苯尼考不容易浮现由质粒介导耐药性，并且对于大量具有耐CHL基因病原体，氟苯尼考仍旧敏感。氟苯尼考对于大多数细菌都具备杀灭或抑制作用，同步对于厌氧革兰氏阳性菌和阴性螺旋体，以及立克次氏体，阿米巴原虫等都具备较为明显抗菌作用[5]。
1.1.3 药动学
氟苯尼考在机体内见效快，持续时间长。依照研究者实验得出，肌肉注射氟苯尼考1小时后来，血液中药物浓度可以达到治疗浓度，1~3 小时后便可以达到高峰期血药浓度。只需一次给药，有效血药浓度便可以维持48~72小时以上，并且不会浮现骨髓抑制和再生障碍性贫血危害。氟苯尼考在体内分布广泛，可以透过血脑屏障来抑制和治愈动物细菌性脑膜炎，相比于其她抗菌药，氟苯尼考可具备极强治疗效果。在机体内，某些器官氟苯尼考药物浓度较高，血药浓度可以达到治疗效果，重要通过肝脏、肾脏代谢，少量药物可以随粪便由体内排出。依照动物种类和给药方式不同，氟苯尼考药物代谢动力学会有略微差别。
1.1.4 耐药性
由于临床上氟苯尼考用法不当，如今已经开始浮现氟苯尼考耐药菌株，应当即刻引起人们广泛关注。1996 年，Kim 等研究人员第一次发现并且命名了一种可以耐氟苯尼考基因pp-Flo，依照DNA序列分析显示得出，pp-Flo基因有47.4%几率与非酶介导导氟苯尼考耐药基由于同源基因。在此之后，研究者又陆续地克隆出了各种不同氟苯尼考耐药基因，重要是从沙门氏菌、大肠杆菌以及葡萄球菌属中得到，涉及Flo、Flor、FexA 和Cfr等基因。总体来讲，依照当前研究成果，重要有Flo、Flor、FexA、以及Cfr 和pp-Flo[9]这五种可以耐氟苯尼考基因。

1.2 氟苯尼考临床应用
氟苯尼考如今已经广泛投入使用在各种水生动物（涉及鱼、虾、蟹、鲍、贝等在内）养殖业中。氟苯尼考可以明显地防止和治疗各种急性、慢性细菌性疾病，例如黄尾鱼假核性巴氏杆菌病及链球菌病、大西洋鲑鱼疖病[9]、黄尾鱼巴氏杆菌感染、鳗迟钝性爱德华氏菌感染、以及鲑杀鲑弧菌性感染[10]等。
在猪养殖业中，在防止和治疗猪喘气病、胸膜肺炎与沙门氏菌病，涉及大肠杆菌性下痢、萎缩性鼻炎以及猪丹毒、猪肺疫和无乳综合症等在内疾病中，氟苯尼考具备明显防治效果。对于猪胸膜肺炎放线杆菌，氟苯尼考最小抑菌浓度（MIC）范畴在0.20~1.56 µg/mL之间，它对于猪胸膜肺炎放线杆菌最佳抑菌浓度是0.39 µg/mL。相比较于阿莫西林（AMX）以及恩诺沙星这两种药物，氟苯尼考对猪链球菌病治愈率[11]明显高于两者。
氟苯尼考同样广泛地用于防止和治疗牛细菌性疾病[2] ,且防治效果是其她同类药物所不能及。氟苯尼考可以用于防治牛呼吸系统疾病[12] 、牛肠炎[13] 、牛无名热[14]。单独使用氟苯尼考时，可以明显地抑制溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和嗜血杆菌三种引起牛呼吸道疾病重要病原体，可以明显地治疗牛呼吸道感染疾病[15]。值得一提是，各成长阶段肉牛都可以使用氟苯尼考注射剂。
当前，氟苯尼考在禽类养殖业细菌性疾病防治中占有着举足轻重地位。依照研究者实验证明，按照1∶5比例，药物浓度50 µg/mL来配伍甲氧苄啶（ TMP ）和氟苯尼考两种药物，即每毫升药液中具有氟苯尼考42 微克，甲氧苄啶8 微克，可以极佳治愈鸡大肠杆菌病[16]。每12 小时以20~40 µg/kg剂量肌肉注射给药或者口服给药氟苯尼考一次，持续使用三天，可以较好治疗鸡多杀性巴氏杆菌病，且效果较为明显[17]。使用氟苯尼考可明显地防止和治疗鸭传染性浆膜炎，实验表白，将氟苯尼考用于同一种群中浮现临床症状病鸭，传染性浆膜炎治愈率平均可以达到96.8%；将氟苯尼考用于同一种群中尚未浮现临床症状鸭种（假定健康鸭），其传染性浆膜炎平均防止有效率达到了97.1%[18]。如果使用氟苯尼考与多西环素（DOX）复方制剂，效果相称于甚至高于单独配方氟苯尼考可溶性粉[19]。该复方制剂可以有非常效地抑制鸡大肠杆菌感染且缓和病鸡临床症状，并可以明显减少鸡由大肠杆菌感染引起发病和死亡几率，且在一定限度上，该制剂可以减少成活鸡体重下降。
1.3 氟苯尼考检测办法
当前，用于检测动物性食品中氟苯尼考含量办法重要使用气象或液相色谱与色谱质谱联用法，其中高效液相色谱法与液相色谱-质谱联用法最为广泛。固然依照条件、目、用途不同，当前也惯用其她氟苯尼考检测办法，其中重要有电位法、分光光度法、酶联免疫吸附法（ELISA）、胶束电动毛细管色谱法等。
1.3.1 气象色谱（GC）与液相色谱法（LC）
使用GC与LC法进行氟苯尼考含量测定期，提取样品中氟苯尼考药物残留重要提取液普通使用乙酸乙酯与甲醇、以及乙腈和丙酮等有机溶剂，其中，乙酸乙酯提取效率最高[19]。惯用固相萃取柱有C18柱[20]、HLB柱[19]、MCX柱[21]或Florisil柱[22]等。
在使气象色谱法分析之前，需要进行样品前解决反映-硅烷化和酰化，以此来生成热稳定性强并且容易挥发衍生物，普通需要使用氢火焰离子检测器（FID）或者电子捕获检测器（ECD）[23]来检测衍生化反映完毕之后样品，。
使用液相色谱法检测时，色谱柱普通使用是C18柱，检测器普通使用二极管阵列检测器（PDA）[19]、紫外检测器（UVD）[20]或者荧光检测器（FLD）[21]。相比于其她分析办法，高效液相色谱法操作简便，定量精确，成果稳定且消耗时间短，但同步该办法具备敏捷度不高，并且无法提供待测物构造信息缺陷。
1.3.2 气象色谱-质谱联用法（GC-MS）和液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/MS）
气象色谱-质谱联用法与气象色谱法同样，需要进行衍生化过程，但需要避免水分浮现，水存在会减少衍生化效率，生成产物不稳定。因而，使得GC-MS法前解决过程极为复杂。
与之相比，液相色谱-串联质谱联用法具备敏捷度高、选取性好、定量精确以及简便快捷、抗干扰长处，是氟苯尼考含量较为抱负检测办法。使用液相色谱-串联质谱联用法分析不同基质样品时,有时会浮现对基质抑制作用。故而，使用LC-MS/MS检测时，定量办法需要使用内标法，也可以采用以基质来匹配原则曲线法办法来，通过此办法可以提高LC-MS/MS分析办法精确度和精密度[24]。然而，液相色谱-串联质谱联用法仪器并不普遍，且成本较高，无法得到普及。
1.3.3 其她办法
a.电位法
电位法要将样本在乙醇中溶解，再加入氢氧化钠溶液进行加热回流，经稀释后来，加入稀硝酸，然后使用银-玻璃电极进行滴定。电位法是电化学分析领域重要研究方向之一，该办法定量稳定而精确，但由于其消耗时间过长，操作较为繁琐，不适合迅速分析检测。
b.分光光度法
由于氟苯尼考在紫外光区具备吸取特性，可以通过浓度与在特定波长处氟苯尼考光吸取度之间关系，来计算和分析动物性食品中残留氟苯尼考含量。使用分光光度法检测分析操作简便，消耗时间短，但由于干扰因素比较多，导致分光光度法精确度较低，并且专属性较差。
c.酶联免疫吸附法（ELISA）
酶联免疫吸附法是一种先进可靠分析检测办法，该办法理论基本是应用了抗原与抗体具备可逆性特异性结合反映，效果明显。近几年来，国内市场已经发行了试剂盒应用于氟苯尼考含量测定，这些试剂盒敏捷度较高，检测浓度最低可以达到0.5ppb。酶联免疫吸附法具备着敏捷度高、特异性强、并且操作简便、耗时较短，定量与成果精确而稳定等特点和长处，可以合用于氟苯尼考含量大批量、迅速检测。但值得一提是，该办法需要进行抗原与抗体阳性拟定。
d.胶束电动毛细管色谱法
胶束电动毛细管色谱法是通过在缓冲溶液中加入各种表面活性剂，从而形成带电荷胶束。胶束电动毛细管色谱法把色谱技术与电泳技术有机结合起来，吸取了两种办法长处。该办法既克服了毛细管区带电泳法（CZE）难以分离中性离子局限性，又能弥补高效液相色谱法（HPLC）无法同步测定复杂成分中中极性粒子和非极性粒子缺陷，可以在较短时间内完毕复杂组分分离测定。

2 研究目与意义

依照当前研究，关于氟苯尼考含量检测办法，检测对象大多为水产动物、猪、牛等，鸡血浆中氟苯尼考含量检测办法国内未见报道，国外报道大多数采用是气象色谱-质谱联用法（GC-MS）和液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/MS），但是这两种办法对色谱仪器规定与条件较为严格，检测成本较高，不利于推广。为此，本文通过改进国外办法，建立鸡血浆中氟苯尼考高效液相色谱检测办法，可觉得开展对氟苯尼考在鸡体内药物代谢动力学研究提供定量办法，可觉得使用氟苯尼考治疗鸡细菌性疾病提供科学理论根据。

3 研究内容

建立鸡血浆样品前解决办法和鸡血浆中氟苯尼考HPLC测定办法。

实验研究
1 材料与办法
1.1 实验材料
仪器： Waters 1525高效液相色谱分析仪（配Waters 2475荧光检测器，2497检测器，717 自动进样器）（美国Waters公司）；
PHS-3C型精密pH计；
电子分析天平；
氮气吹干仪(上海济成分析仪器有限公司)；
冷冻离心机Biofuge Stratos；
TGL-16C型高速离心机（德国Heraus公司）；
抽滤瓶（滤膜0.45µm）；
滤器（0.225µm）；
Jcx-50G超声波清洗机（山东济宁超声电子仪器厂）；
药物： 氟苯尼考原则品，99.76 % （Schering-Ploug h公司）
乙腈，色谱纯 ；
乙酸乙酯，色谱纯 ；
氢氧化钠，分析纯 ；
磷酸，分析纯；（北京鹏彩精细化工有限公司）；
1.2 实验动物
肉鸡，购自三益家禽育种有限公司
分两组进行实验，每组三只
重量：均重2kg
1.3 实验办法
1.3.1 色谱条件及流动相
本办法色谱柱使用Waters 04590型Symmetry-C18柱（ 4.6×150 mm，5μm），柱温保持30℃，使用230nm作为检测波长，使用乙腈与水混合伙为流动相，乙腈：水=27：73（V:V），流速为1.0 mL/min，进样量设定为10 µL。使用0.225 µm滤膜过滤。
1.3.2 给药与样本采集
以5mg/kg剂量在鸡腋下肌肉注射给药，给药后分别在0,2,4,6,12h于翼下静脉采血2-3ml，置于经由1%肝素钠润洗离心管中，以r/min转速离心10min之后，吸取上层血浆液置于塑料管中，在﹣20℃下冷冻保存待用。
1.3.3 样本解决
① 量取1 ml血浆于15 ml离心管；
② 加1 ml 0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲液，旋涡混匀；
③ 加4 ml乙酸乙酯,6000r/min离心15min，吸取上层置于10 ml离心管；
④ 重复上一步，提取并合并；
⑤ 50 ℃水浴氮气蒸发吹干；
⑥ 加入流动相1ml，旋涡混匀；
⑦ 吸入1.5 ml Eppendorf 管，13000r/min离心20 min；
⑧ 吸取上层清液于2ml棕色进样瓶，进样10μl 进行检测。
1.3.4 检测波长
氟苯尼考原料和制剂紫外检测波长已见采用223、224、225、226 、230、254和 262nm等几种。鉴于短波长易受各种因素干扰，230nm可满足对本品含量测定规定。本办法选用230nm作为检测波长，在这一波长下，辅料对氟苯尼考测定干扰限度最小。
不同波长色谱图见图2、图3、图4、图5、图6和图7
1.3.5 工作液配备及工作曲线绘制
取空白组鸡血浆5份，分别加不同体积氟苯尼考储备液于血浆中，使血样浓度依次为1，2.5，25，50，100，200 μg/mL，按1.3.3进行血样解决，绘制工作曲线。
1.3.6 数据测定
a.检测限与定量限：取空白鸡血浆五分，按“1.3.3 血浆样品前解决办法”解决样品，再按1.3.1 条件进行高效液相色谱测定，测得基线噪音值，之后求其平均值。
b.精确度与精密度：取空白血浆三分，分别加不同体积氟苯尼考储备液于血浆中，使血样浓度分别为50，100，200 μg/mL，按照“1.3.3样本解决”办法进行样品前解决过程，计算回收率。各浓度原则液需在同一天内重复测定5次，日间持续测定3天，计算色谱峰面积日内、日间相对原则偏差（RSD）

2 成果与计算
2.1 波长选用
不同波长色谱图如下

图2 氟苯尼考色谱图（223nm）

图3 氟苯尼考色谱图（224nm）

图4 氟苯尼考色谱图（225nm）

图5 氟苯尼考色谱图（226nm）

图6 氟苯尼考色谱图（230nm）

图7 氟苯尼考色谱图（254nm）

图8 氟苯尼考色谱图（262nm）

经考察，本法选用230nm作为色谱检测波长，在这一波长下，辅料对氟苯尼考测定干扰限度最小。

2.2 工作曲线
用1.3.4办法进样检测，并用建立坐标系，进行线性回归，横坐标为待测物氟苯尼考浓度，纵坐标为待测物氟苯尼考峰面积。计算得出，直线回归方程为y = 50x + 170000，有关系数r = 0.9994。此办法定量限为0.1 µg/mL。依照这一成果可以得出，在1~200 µg/mL范畴内氟苯尼考浓度与峰面积线性关系良好。氟苯尼考工作曲线见图9。

图9 氟苯尼考工作液峰面积与浓度关系

2.3 回收率与精密度
按照处方物料配比，精准称取氟苯尼考对照品，加入处方比例辅料，并混合均匀。取混合测试样，配80,100,120 μg/mL 3种浓度水平溶液，按供试品测定办法测定氟苯尼考浓度，重复测定3次，与氟苯尼考原则品溶液比较，按外标法计算办法回收率，成果表白：氟苯尼考在鸡血浆中回收率为86.3%～98.5 %。成果见表1。
表1 血浆中氟苯尼考回收率（n = 5）
添加浓度（µg/mL）
平均实测浓度（µg/mL）
平均回收率（%）
80
85.7
86.3
100
95.3
98.5
120
104.9
87.5

按1.3.6“精密度测定”项进行样品分析测得了日内与日间相对原则偏差（RSD）。成果见表2。
表2 血浆中氟苯尼考日内、日间RSD

2.4 HPLC检测图谱
通过对流动相组分与比例，以及柱温、检测波长等方面来进行色谱条件优化，拟定了测定样色谱条件。氟苯尼考0,2,4,6,12h采集样本溶液检测图谱见图3-7。依照成果显示，氟苯尼考在约为5.6-6 min时间内保存，药物色谱峰峰形良好，没有明显干扰峰浮现。

图10 0h血样检测图谱

图11 2h血样检测图谱

图12 4h血样检测图谱

图13 6h血样检测图谱

图14 12h血样检测图谱

3 讨论

本实验采用离心、过滤、氮吹办法进行鸡血浆样品前解决，操作简朴快捷，且回收率较高。采用高效液相色谱法来测定鸡血浆中氟苯尼考含量，依照测定成果表白，办法精确度高、精密度好。
本办法简便快捷，重现性良好、敏捷度较高、样品回收率高，样品测定过程使用时间较短。鸡血浆中氟苯尼考高效液相色谱检测法最低检测限为0.1 µg/mL，非常合用于氟苯尼考在鸡体内药物代谢动力学研究。

结论与建议

1 实验结论

本实验建立了用高效液相色谱法测定氟苯尼考办法，使用高效液相色谱仪，仪器较为普及，血样解决操作简便易行，干扰因素较少，回收率较高，具备良好实用性。本办法线性范畴为1.0～200 µg/mL（r = 0.9997），线性方程：y = 12674x+ 16319，最低定量限0.1 µg/mL，办法回收率为86.3 ～98.5%，日内、日间相对原则偏差均不大于5%，可觉得氟苯尼考在鸡体内药物代谢动力学研究提供检测基本。

2 创新点

本实验建立了合用于鸡血浆中氟苯尼考高效液相色谱法测定办法，办法简便且操作性强，为其在兽医临床上药代动力学及其她应用研究打下坚实基本。

3有待进一步研究问题

依照建立鸡血浆中氟苯尼考检测办法，进行实际样品中氟苯尼考检测以及在鸡体内药物代谢动力学研究。

参照文献

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致 谢

本论文由刘宇教师指引完毕，于选题、实验设计、方案拟定与实行等方面，教师倾注了大量心血。刘教师渊博知识、敏锐思维、严谨治学和恭谦处世态度、精益求精敬业精神都令我由衷赞叹，获益匪浅。

同步，本文由研究生徐磊协助指引，文章思路、构造与审视均由徐磊师兄细心协助与改正。

感谢父母养育之恩、师长哺育之恩与同窗手足之情伴我度过大学生涯，顺利完毕论文与学业。

以此，特向教师、同窗予以崇高敬意与诚挚感谢！