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1、 消毒剂消毒效果确定方案 姓名 职位 署名 日期 制订人 格式审核人 审核人 同意人 生效日期 TABLE OF CONTENTS 目录 1 PURPOSE AND SCOPE 目的和范围 4 2 OVERVIEW 概述 4 3 REGULATIONS, STANDARDS & REFERENCES 法规、标准和参考文献 4 4 RESPONS
2、IBILITIES AND TRAINING 职责和培训 4 5 PREPARATION 验证准备 5 6 VALIDATION TESTS 验证测试 6 7 DEVIATIONS & CHANGES 偏差和变更 10 8 ANNEXES 附件 11 9 VERSION 修订记载 11 1 目标和范围 1.1 目标 本方案目标是为了确定各洁净等级操作间及设备外表面根据要求消毒程序消毒能够达成消毒、预防污染目标，并在消毒剂使用期内能确保其消毒效力能符合要求。 1.2 范围 本验证方案适适用于QC洁净区墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、
3、桌椅等表 面和操作人员双手（手套）所用消毒。 本文件合并了方案和统计，当验证完成后，本文件将作为确定汇报附件。 2 概述 2.1 本企业确定用于仪器设备和洁净区表面消毒消毒剂有：XXXXXX。此次验证方案将选择以上X种消毒剂分别进行验证试验。 作用对象一样消毒剂每个月轮换使用，避免表面微生物产生耐药菌株。为了确定消毒剂消毒效力我们经过定量悬液试验和定量载体试验对消毒效果进行确定。 2.2 洁净区设施表面材质有彩钢板、不锈钢和玻璃三种，故定量载体试验选择彩钢板载片、不锈钢载片和玻璃裁片模拟洁净区设施表面进行验证试验。 3 法规、标准和参考文件 3.1 中国国家标准
4、 消毒和灭菌效果评价方法和标准 3.2 中国药典 第四部 4 职责和培训 4.1 职责 姓名 部门 职务 职责 4.2 Training 培训 上表中提及职员全部会参与验证实施，而且会在验证实施前经过培训。培训统计作为附件附入本方案。 5 验证准备 5.1 仪器/设备 此次验证需要使用到仪器/设备及其信息以下： 仪器名称 编号 校准使用期至 电热恒温水浴锅 生化培养箱 生化培养箱 生化培养箱 锥形瓶 试管 移液枪
5、 移液管 量筒 生物安全柜 脉动真空灭菌柜 5.2 标准物质、试药和试液 名称 浓度&等级 编号 使用期至 PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 0.1%卵磷脂+0.1%吐温80+0.1%蛋白胨缓冲液 5.3 菌种 微生物检验方法验证方案适用。 菌种 传代次数 编号 使用期至 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 5.4 培养基 培养基 批号
6、 灭菌批号 使用期至 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基 沙氏葡萄糖液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 6 验证测试 6.1 通用项目 6.1.1 培养基：按QS-QC-GAM-014《培养基配制标准操作规程》和QS-QC-GAM-013《培养基适用性检验标准操作规程》要求准备对应培养基，培养基适用性检验统计作为附件附入本方案。 6.1.2 消毒液：XXXXX 6.1.3 稀释剂为：PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。中和剂为：0.1%卵磷脂+0.1%吐温80+0.1%蛋白胨缓冲液 6.1.4 菌液准备 6.1.4.
7、1 菌液制备：见XXXX《菌种传代、保藏、使用和灭活标准操作规程》。 6.1.4.2 菌液计数确定：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌新鲜培养物用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成10-6、10-7、10-8三个浓度。枯草芽孢杆菌、白色念珠菌新鲜培养物用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成10-5、10-6、10-7三个浓度。 取黑曲霉新鲜培养物加入3~5ml含0.05%（ml/ml）吐温800.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后用带纱布移液管吸出孢子悬液至无菌试管。再用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成10-5、10-6、10-7三个浓度
8、每种菌各个浓度菌液分别取1ml至平皿中，同法平行制备两个平皿。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌平皿倾注15~20ml 45℃以下胰酪大豆胨琼脂培养基。白色念珠菌、黑曲霉平皿倾注15~20ml 45℃以下沙氏葡萄糖琼脂培养基。 6.1.4.3 胰酪大豆胨琼脂培养基平皿于30~35℃生化培养箱中培养，培养时间不超出3天，天天最少计数一次。沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿于20~25℃生化培养箱中培养，培养时间不超出5天，天天最少计数一次。依据各个浓度菌液计数情况推算出1ml浓菌悬液含菌数。统计见附件一《菌液含菌数计数统计》 6.1.5 中和剂确定试验 6.1.5.1 依据
9、菌液计数所得数据，将新鲜浓菌液用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成5*105~5*106CFU/ml工作菌液。 6.1.5.2 将配制好消毒液用不一样工作菌液进行以下分组试验。 组号 混合液A 混匀作用10min 混合液B 混匀作用10min 取混合液B或混合液B稀释溶液0.5ml平板计数（2皿/组） 取0.5ml工作菌液加入下列溶液中 取混合液A 0.5ml加入下列溶液 1 消毒剂4.5ml 稀释液4.5ml 混合液B、10-1 2 消毒剂4.5ml 中和剂4.5ml 混合液B、10-1 3 中和
10、剂4.5ml 稀释液4.5ml 10-2、103 4 中和产物4.5ml（消毒液和中和剂百分比为1:1） 稀释液4.5ml 10-2、10-3 5 稀释液4.5ml 稀释液4.5ml 10-2、10-3 6 稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿，作为阴性对照组 具体操作： 第一组：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液A0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min，取混合液B或浓度为10-1混合液B0.5ml注皿，各平行制备2皿。 第二组：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min
11、后，取混合液A0.5ml+中和剂4.5ml，混匀作用10min，取混合液B或浓度为10-1混合液B0.5ml注皿，各平行制备2皿。 第三组：取中和剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液A0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min，用稀释剂进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取对应稀释级0.5ml注皿，各平行制备2皿。 第四组：取消毒剂和中和剂1:1混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液A0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释剂进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取对应稀释级0.5ml注皿，各平行制备2皿
12、 第五组：取稀释液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液A0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释剂进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取对应稀释级0.5ml注皿，各平行制备2皿。 各组高浓度平皿编号为：1＃、2＃，低浓度平皿编号为：3＃、4＃。 第六组：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基各制备2皿。 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌、铜绿假单胞菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂培养基，倒置20～25℃培养5天计数计数，
13、逐日观察。 6.1.5.3 结果判定 试验结果应符合以下全部条件，判定所选中和剂合格：①第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。②第2组菌落数比第1组菌落数多，但显著少于第3、4、5组菌落数。③第3、4、5组有相同菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超出15%。计算公式以下： （3组间菌落平均数-各组菌落平均数）绝对值之和 误差率= ×100% 3×3组间菌落平均数 6.1.5.4 统计见附件二《中和剂确定统计》 6.2 消毒剂消毒效果确定 6.2.1 定量悬
14、液试验 6.2.1.1 依据菌液计数所得数据，将新鲜浓菌液用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成5*105~5*106 CFU/ml工作菌液。 6.2.1.2 将配制好消毒液用不一样工作菌液分别进行以下分组试验（试验反复3次）。 组号 混合液A 作用 时间 混合液B 作用 时间 取混合液B或混合液B稀释溶液1ml平板计数（2皿/组） 取0.5ml工作菌液加入下列溶液中 取混合液A 0.5ml加入下列溶液 试验组 消毒剂4.5ml 8min 中和剂4.5ml 10min 混合液B、10-1 消毒剂4.5ml 10mi
15、n 中和剂4.5ml 混合液B、10-1 消毒剂4.5ml 12min 中和剂4.5ml 混合液B、10-1 阳性对照 用稀释液将工作菌液进行10倍系列稀释 10-4、10-5 阴性对照 稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿，作为阴性对照组 具体操作： 试验组：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，分别混匀作用8min、10min、12min后，取混合液A0.5ml+中和剂4.5ml，混匀作用10min，取混合液B或浓度为10-1混合液B1ml注皿，各平行制备2皿。 阳性对照：用稀释液将工作菌液进行10倍系列稀释至10-4、10-5。取对应稀释级1
16、ml注皿，各平行制备2皿。 阴性对照：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基各制备2皿。 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌、铜绿假单胞菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂培养基，倒置20～25℃培养5天计数计数，逐日观察。 6.2.1.3 统计见附件三《消毒剂消毒效果确定定量悬液试验统计》 6.2.2 定量载体试验 6.2.2.1 所用载体：不锈钢、彩钢板、玻璃 6.2.2.2 将灭菌载体平放于灭菌平皿内，每个载体滴注定量菌液(载体回收菌量达5*105～5*106
17、cfu/片) 涂匀，放37℃培养箱待干。 6.2.2.3 将配制好消毒液用不一样染菌载体分别进行以下分组试验（试验反复3次）。 组号 混合液A 作用 时间 混合液B 作用 时间 取混合液B或混合液B稀释溶液1ml平板计数（2皿/组） 染菌载体 和消毒液作用后染菌载体 试验组 消毒剂5ml 8min 中和剂5ml 震荡50至80次 10min 混合液B、10-1 消毒剂5ml 10min 中和剂5ml 混合液B、10-1 消毒剂5ml 12min 中和剂5ml 混合液B、10-1 阳性对照 稀释剂5ml —— 中和
18、剂5ml 10-2、10-3 阴性对照 稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿，作为阴性对照组 具体操作： 试验组：取消毒剂5ml+染菌载体，分别混匀作用8min、10min、12min后，取和消毒液作用后染菌载体+中和剂5ml，震荡50至80次混匀作用10min，取混合液B或浓度为10-1混合液B1ml注皿，各平行制备2皿。 阳性对照：用稀释液替换消毒液同试验组操作。将混合液B用稀释剂进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取对应稀释级1ml注皿，各平行制备2皿。 阴性对照：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基
19、各制备2皿。 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌、铜绿假单胞菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂培养基，倒置20～25℃培养5天计数计数，逐日观察。 6.2.3 统计见附件四《消毒剂消毒效果确定定量载体试验统计》 6.2.4 各组高浓度平皿编号为：1＃、2＃，低浓度平皿编号为：3＃、4＃。 6.2.5 按不一样稀释度推算出每个样本存活菌数(cfu/mL)，计算出杀灭率。杀灭率计算公式以下： 阳性对照组-试验组平均值 杀灭率=
20、 ×100% 阳性对照组 6.3 结果判定：3次试验杀灭率均≥99.9%判为消毒合格。 7 偏差和变更 7.1 偏差登记 Number 编号 Description 描述 Result 结果 Attachments 附件 Recorded by/Date: 登记人/日期： Reviewed by/Date: 复核人/日期： 7.2 变更登记 Number 编号 Description 描述 Result 结果
21、 Attachments 附件 Recorded by/Date: 登记人/日期： Reviewed by/Date: 复核人/日期： 8 ANNEXES 附件 8.1 附件一《菌液含菌数计数统计》 8.2 附件二《中和剂确定统计》 8.3 附件三《消毒剂消毒效果确定定量悬液试验统计》 8.4 附件四《消毒剂消毒效果确定定量载体试验统计》 9 修订记载 Version 版本号 Issue Date of Previous Version 上版生效时间 Document History 变更历史 Department 部门 Drafted by 起草人 01 N/A 不适用 Initial 初始版本
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