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PCR技术及习题
PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反映
1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA合成方向是从子链5'端自3'端延伸。事实上就是在体外模仿细胞内DNA复制过程。DNA复制需要引物，其重要因素是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反映过程是：变性→复性→延伸
类似于DNA天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反映环节构成：
①模板DNA变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，以便它与引物结合，为下轮反映作准备；
②模板DNA与引物退火（复性）：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；
③引物延伸：72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。

3、成果：上述三步反映完毕后，一种DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数增多，DNA分子就以2n形式增长。PCR反映过程都是在PCR扩增仪中完毕。
4、细胞被DNA复制与PCR技术比较：

细胞内DNA复制
体外DNA扩增（PCR）
不同点
解旋
在解旋酶作用下边解旋边复制
80～100℃高温解旋，双链完全分开
酶
DNA解旋酶、DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶
引物
RNA
DNA、RNA
温度
体内温和条件
高温
相似点
①需提供DNA模板
②四种脱氧核苷酸为原料
③子链延伸方向都是从5'端到3'端
知识点拨：
1、DNA分子复制人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋构造，称为复性。
复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。
2、PCR含义是多聚酶链式反映。
3、PCR技术反映条件：①稳定缓冲溶液环境（普通使用Tris-Cl缓冲液，原则为10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间）；②DNA模板；③合成引物（2个）；④四种脱氧核甘酸；⑤DNA聚合酶；⑥温控设备
4、PCR技术最突出长处是迅速、高效、灵活、易于操作。
5、TaqDNA聚合酶特点是：耐高温。

知识拓展：
1、DNA聚合酶不可以从头合成DNA，只能从DNA3'端开始延伸DNA链，因而DNA复制需要引物。
2、引物：引物是PCR特异性反映核心，PCR 产物特异性取决于引物与模板DNA互补限度。理论上，只要懂得任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补寡核苷酸链做引物，运用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
3、PCR引物设计原则：
（1）PCR引物普通长15-25碱基，其中G＋C约占50%。
（2）引物之间不能互配形成双链构造，引物内部也不能形成发夹构造。
（3）引物3’末端必要与目片段完全相配。
（4）引物5’末端可以不与目片段互补，可以包括内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反映中，这些序列会被同样合成
习题训练
1．聚合酶链式反映(PCR技术)是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA生化技术，反映系统中涉及微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量4种脱氧核苷酸及ATP等。反映中新合成DNA又可以作为下一轮反映模板，故DNA数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。

微量DNA样品
DNA互补链分离开为单链
以单链为模板合成子代DNA
循环重复

（1）某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则通过PCR仪五次循环后，将产生 个DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸数量至少是 个。
（2）分别以不同生物DNA样品为模板合成各个新DNA之间存在差别，这些差别是 。
（3）请指出PCR技术与转录过程三个不同之处：
① 。
② 。
③ 。

2．通过DNA重组技术使原有基因得以改造动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中具有人体蛋白质，下图表达了这一技术基本过程，在该工程中所用基因“剪刀”能辨认序列和切点是一G↓GATCC一，请回答

（1）从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因酶是 。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要酶是 。
（2）请画出质粒被切割形成黏性末端过程图。

（3）人体蛋白质基因之因此能“插入”到羊染色体内，因素是
，“插入”时惯用工具是 。

3．下面甲图中DNA决定某一多肽链中酪氨酸和丙氨酸过程示意图，乙图示样品 DNA经PCR技术(聚合酶链式反映)扩增，可以获取大量DNA克隆分子。分析回答：

（1）甲图中具有 种核苷酸；丙氨酸遗传密码子是 。该图表达了DNA中遗传信息 过程。
（2）有一种贫血症是血红蛋白分子一条多肽链上，一种酪氨酸被一种苯丙氨酸所代替导致。此种贫血症主线因素是 ，即 发生了变化。
（3）乙图“PCR”与人体内DNA复制相比有何特殊之处? 。
（4）当前要通过“PCR”得到甲图中DNA片段1024个克隆片段，则至少要向试管中加入 个腺嘌呤脱氧核苷酸。