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定性免疫学检验性能验证与质量控制 CNAS-CL39：2012医医学学实实验验室室质质量量和和能能力力认认可可准准则则在临床免疫学检验领域的应用说明：在临床免疫学检验领域的应用说明：检检验验方方法法和和程程序序的的分分析析性性能能验验证证内内容容应应参参考考试试剂剂盒盒说说明明书书上上明明确确标标示示的的性性能能参参数数进进行行验验证证，至至少少应应包包括括：检检出出限限、符符合合率率（采采用用国国家家标标准准血血清清盘盘或或临临床床诊诊断断明明确确的的阴阴阳阳性性样样品品各各2020份份或或与与其其他他分分析析方方法法比比对对），精精密密度度（包包括括重重复复性性和和批批间间精精密密度度）；并并应应明明确确检检验验项目的预期用途，如项目的预期用途，如筛查筛查、诊断诊断、确认确认。一、定性免疫试验的性能验证一、定性免疫试验的性能验证n筛查试验筛查试验n诊断试验诊断试验n确认实验确认实验nC50C50nC5C5nC95C95性能验证相关概念性能验证相关概念n一一份份样样本本，在在多多次次重重复复实实验验中中各各有有50%50%的的几几率率获获得得阳阳性性或或阴阴性性的的结结果果时时该该分分析析物物的的浓浓度度。对对特特定定试试剂剂，C50C50一旦确定，是恒定不变的。一旦确定，是恒定不变的。临界点（临界点（C50）浓度的定义）浓度的定义C50n一一份份样样本本，在在多多次次重重复复实实验验中中有有95%95%的的几几率率获获得得阴阴性结果时该分析物的浓度。性结果时该分析物的浓度。C5浓度的定义浓度的定义C5n一一份份样样本本，在在多多次次重重复复实实验验中中有有95%95%的的几几率率获获得得阳阳性结果时该分析物的浓度。性结果时该分析物的浓度。C95浓度的定义浓度的定义C95n质控品：商用或自备，含阳性和阴性。质控品：商用或自备，含阳性和阴性。nC50C50和和C5C5（C50-20%C50-20%）及及C95C95（C50+20%C50+20%）浓浓度度样样本本：用于用于重复性及最低检出限重复性及最低检出限验证，不少于验证，不少于4040次检测量。次检测量。n临临床床样样本本或或血血清清盘盘：用用于于准准确确性性验验证证，不不少少于于5050份份阳性和阴性样本。阳性和阴性样本。性能验证的样本准备性能验证的样本准备n纯定性试验纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性检测方法的不精密度。检测方法的不精密度。n量值化定性试验量值化定性试验：以：以COICOI（cut-off Indexcut-off Index）或）或S/COS/CO比值作为分析方法的精密度评价指标。比值作为分析方法的精密度评价指标。（一）不精密度的验证（一）不精密度的验证n定性测定精密度分析质量指标为定性测定精密度分析质量指标为C5-C95C5-C95浓度区间浓度区间（亦即（亦即“灰区灰区”），），这一区间范围这一区间范围C5020%C5020%。纯定性测定不精密度的评估方法纯定性测定不精密度的评估方法分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线两种不同方法的不精密度曲线比较两种不同方法的不精密度曲线比较n检检测测试试剂剂或或系系统统的的说说明明书书可可能能会会注注明明分分析析物物的的临临界界浓度，但需验证。浓度，但需验证。n如如果果临临界界浓浓度度未未知知，则则可可以以将将阳阳性性样样本本进进行行一一系系列列稀稀释释，然然后后将将他他们们进进行行重重复复检检测测以以确确定定能能够够获获得得50%50%阳阳性性和和50%50%阴阴性性结结果果的的那那个个稀稀释释度度，这这一一稀稀释释度度的的分分析物浓度即为临界点（析物浓度即为临界点（C50C50）。）。如何获得如何获得“临界点（临界点（C50）”n制备评价用样本制备评价用样本 制备制备3 3份样本：一份浓度为份样本：一份浓度为C50C50，一份为，一份为C50+20%C50+20%，一份为，一份为C50-20%C50-20%。每份样本的体积需保证每份样本的体积需保证4040次或更多次重复检测的次或更多次重复检测的需要。需要。n评价方法评价方法 每份样本检测每份样本检测4040次，确定每一份样本结果为阳性次，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。和阴性的百分比。纯定性试验不精密度评价步骤纯定性试验不精密度评价步骤-20%-20%+20%+20%浓度范围在浓度范围在C5-C95C5-C95区间之内；用该方法检测，浓度超过区间之内；用该方法检测，浓度超过C50C5020%20%的样本的样本检测结果不一致；此结论错误率检测结果不一致；此结论错误率5%5%，需使用更宽浓度范围的样本（如，需使用更宽浓度范围的样本（如30%30%）进行）进行另外的试验。另外的试验。不精密度评价结果判断不精密度评价结果判断-1-20%-20%+20%+20%浓度范围包含了浓度范围包含了C5-C95C5-C95区间；用该方法检测，浓度超过区间；用该方法检测，浓度超过C5020%C5020%的样本的样本检测结果一致检测结果一致不精密度评价结果判断不精密度评价结果判断-2用该方法检测，用该方法检测，C50+20%C50+20%的样本检测结果一致，的样本检测结果一致，C50-20%C50-20%的样本不一定能得到一致结的样本不一定能得到一致结果；需要用低于果；需要用低于C50C50更大百分率浓度的样本（如更大百分率浓度的样本（如-30%-30%）进行补充试验。）进行补充试验。不精密度评价结果判断不精密度评价结果判断-3用该方法检测，用该方法检测，C50-20%C50-20%的样本检测结果一致，的样本检测结果一致，C50+20%C50+20%的样本不一定能得到一致结的样本不一定能得到一致结果；需要用高于果；需要用高于C50C50更大百分率浓度的样本（如更大百分率浓度的样本（如+30%+30%）进行补充试验。）进行补充试验。不精密度评价结果判断不精密度评价结果判断-4n有些定性免疫测定，如有些定性免疫测定，如ELISAELISA等，样本的测定结果等，样本的测定结果可以可以COICOI（cut-off Indexcut-off Index）或）或S/COS/CO比值来表示，检测比值来表示，检测系统或试剂厂家会在其试剂说明书中给出试剂的批内系统或试剂厂家会在其试剂说明书中给出试剂的批内和批间变异，这对于对实验室评价试剂的精密度以及和批间变异，这对于对实验室评价试剂的精密度以及评估其室内质控的批间变异结果有参考价值。评估其室内质控的批间变异结果有参考价值。n分为批内精密度评估和批间精密度评估分为批内精密度评估和批间精密度评估数值化定性免疫测定的精密度评价方法数值化定性免疫测定的精密度评价方法n操作者必须熟悉检测系统工作原理，了解并掌握仪操作者必须熟悉检测系统工作原理，了解并掌握仪器的操作步骤和各项注意事项，应在评估阶段维持仪器的操作步骤和各项注意事项，应在评估阶段维持仪器的可靠和稳定。器的可靠和稳定。n用于评估试验的样本一般常采用临床实验室收集的用于评估试验的样本一般常采用临床实验室收集的血清血清(浆浆)样本；当实验室收集的样本不稳定或不易得样本；当实验室收集的样本不稳定或不易得到时，也可考虑使用稳定的、以蛋白质为基质的商品到时，也可考虑使用稳定的、以蛋白质为基质的商品物质，如物质，如校准品或质控品校准品或质控品。精密度评估的基本原则（精密度评估的基本原则（1）n评估精密度时，应至少评估两个浓度水平样本的精评估精密度时，应至少评估两个浓度水平样本的精密度。密度。n所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少有有一个浓度在医学决定水平一个浓度在医学决定水平左右，在定性测定，左右，在定性测定，即为即为接近临界水平的浓度接近临界水平的浓度。精密度评估的基本原则（精密度评估的基本原则（2）n评评估估方方法法：三三个个不不同同浓浓度度的的样样本本，在在一一个个测测试试批批内内重重复复进进行行至至少少2020次次检检测测，计计算算所所得得S/COS/CO值值的的均均值值和和SDSD，计算批内，计算批内CV%CV%。n质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。n判判断断结结论论：应应试试剂剂说说明明书书所所标标明明的的批批内内变变异异。ELISAELISA的批内变异的批内变异CV%CV%应应10%10%。批内精密度的评估批内精密度的评估n评评估估方方法法：三三个个不不同同浓浓度度的的样样本本，在在1010天天以以上上时时间间内内单单次次重重复复进进行行至至少少2020批批检检测测，计计算算所所得得S/COS/CO值值的的均均值和值和SDSD，计算批间，计算批间CV%CV%。n质量控制：质量控制：n判判断断结结论论：应应试试剂剂说说明明书书所所标标明明的的批批间间变变异异。ELISAELISA的批间变异的批间变异CV%CV%应应15%15%。批间精密度的评估批间精密度的评估n检检测测限限（limit limit of of detectiondetection）是是指指检检测测方方法法可可检检测测出出的的最最低低被被测测量量浓浓度度，也也称称检检测测低低限限（lower lower limit limit of of detectiondetection）或或最最小小检检出出浓浓度度（minimum minimum detectable detectable concentrationconcentration），有有时时也也称称为为分分析析灵灵敏敏度度（analytical sensitivityanalytical sensitivity）。）。n如如前前所所述述，分分析析物物浓浓度度位位于于C5-C95C5-C95区区间间之之外外（小小于于C5C5或或大大于于C95C95）时时，候候选选方方法法对对同同一一样样本本的的重重复复性性检检测测将将得得到到相相同同结结果果。因因此此，C95C95代代表表了了某某一一试试剂剂可可以以测出的最低被测量浓度测出的最低被测量浓度。（二）检出限的验证（二）检出限的验证n样样本本选选择择：评评估估试试剂剂分分析析灵灵敏敏度度所所使使用用的的样样本本，如如检检测测项项目目有有国国家家参参考考品品，则则可可使使用用国国家家参参考考品品或或经经国国家家参参考考品品标标化化的的参参考考品品进进行行检检测测，如如没没有有国国家家参参考考品品，则则使使用用可可以以溯溯源源或或量量化化的的样样本本，如如国国际际标标准准物物质质，或或与国际标准物质溯源的样本。与国际标准物质溯源的样本。n验验证证方方法法：处处于于测测定定下下限限浓浓度度（C95C95）的的样样本本，重重复检测复检测2020次，应至少有次，应至少有1818次以上为阳性反应。次以上为阳性反应。检出限的验证方法检出限的验证方法 验证方法及指标：验证方法及指标：以以与与临临床床诊诊断断、金金标标准准方方法法和和标标准准血血清清盘盘的的检检测测比比较较来来评评价价，常常以以敏敏感感性性（包包括括临临床床敏敏感感性性）/特特异异性性（包包括括临临床床特特异异性性）和和阳阳性性符符合合率率/阴阴性性符符合率合率来表示。来表示。（三）准确度验证（三）准确度验证n临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率 （即出现（即出现阳性结果和确定患者患病）。阳性结果和确定患者患病）。n临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。临床特异性和临床敏感性临床特异性和临床敏感性试剂的检测结果试剂的检测结果共计共计分析物阳性分析物阳性分析物阴性分析物阴性阳性结果数阳性结果数TPFPTP+FP阴性结果数阴性结果数FNTNFN+TN共计共计TP+FNFP+TNTP+FP+FN+TN敏感性敏感性100%特异性特异性100%阳性预测值阳性预测值100%阴性预测值阴性预测值100%符合率符合率100%TP分析物存在时检测结果为阳性的数量。分析物存在时检测结果为阳性的数量。FP分析物不存在时结果为阳性的数量。分析物不存在时结果为阳性的数量。TN分析物不存在时检测结果为阴性的数量。分析物不存在时检测结果为阴性的数量。FN分析物存在时检测结果为阴性的数量。分析物存在时检测结果为阴性的数量。敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值的计算敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值的计算n作作为为筛筛查查试试验验，检检测测的的敏敏感感性性应应95%95%；作作为为诊诊断断试试验验，检检测测敏敏感感性性和和特特异异性性均均应应95%95%；作作为为确确认认试试验验特特异性应异性应98%-99%98%-99%。定性免疫检验项目敏感性、特异性要求定性免疫检验项目敏感性、特异性要求如果没有可用的诊断标准，则需提供待评价试剂与某如果没有可用的诊断标准，则需提供待评价试剂与某一已验证方法进行比较的结果，在这种情况下，则不一已验证方法进行比较的结果，在这种情况下，则不能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率和阴能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率和阴性符合率。性符合率。这种计算反映的并非方法的准确度，而是待评价试剂这种计算反映的并非方法的准确度，而是待评价试剂和已验证方法的一致性程度。和已验证方法的一致性程度。阳性符合率和阴性符合率阳性符合率和阴性符合率待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算阳性符合率和阴性符合率的计算阳性符合率和阴性符合率的计算待评价试剂的检测结果待评价试剂的检测结果已验证方法已验证方法+-+ab-cd共计共计a+cb+d阳性符合率阳性符合率=a/(a+c)100%=a/(a+c)100%。阴性符合率阴性符合率=d/(b+d)100%=d/(b+d)100%。总符合率总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)100%=(a+d)/(a+b+c+d)100%。n第三方质控品第三方质控品n检测系统配套质控品检测系统配套质控品n自制质控品自制质控品质控品的来源质控品的来源二、检验结果质量的保证二、检验结果质量的保证-室内质控室内质控n基基质质：应应尽尽量量选选择择人人血血清清基基质质，动动物物源源性性的的基基质质由由于于人人体体内内有有大大量量的的异异嗜嗜性性抗抗体体的的存存在在引引起起假假失失控控。稀稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。n稳稳定定性性：有有效效期期为为6 6个个月月以以上上,实实验验室室应应对对有有效效期期进进行验证。行验证。质控物的选择质控物的选择n质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少一个批号至少半年半年的实验量。每分析批至少安排一个的实验量。每分析批至少安排一个弱阳性弱阳性和一个和一个阴性阴性质控质控(高值阳性血清只用于监控高值阳性血清只用于监控“HOOKHOOK效应效应”)。检测位置不能固定而应随机放置。检测位置不能固定而应随机放置。n试剂盒所设的试剂盒所设的阴、阳性内对阴、阳性内对照照是用来计算是用来计算CUT OFFCUT OFF值值及有效性判断标准及有效性判断标准，只能在同批号试剂内使用，只能在同批号试剂内使用，不不能作为质控指标能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试质控必须是可以监控到不同批号试剂间的变化的剂间的变化的外对照。外对照。质控物的选择质控物的选择n阴性质控品阴性质控品：特定项目人阴性血清混合物（若为：特定项目人阴性血清混合物（若为ELISA质控品浓度宜质控品浓度宜倍临界值左右）倍临界值左右）n阳性质控品阳性质控品：特定项目人阳性血清混合物：特定项目人阳性血清混合物oANA 1:1000oanti-dsDNA 1:100或以上或以上oanti-ENA 中强度阳性：若组合式检测，至少有中强度阳性：若组合式检测，至少有2个项目为阳性个项目为阳性质控物的选择质控物的选择n弱阳性质控品弱阳性质控品：oELISA：临界值：临界值24倍的样本倍的样本oIIF:比临界值高比临界值高1个滴度。特定项目人阳性血清或阴阳个滴度。特定项目人阳性血清或阴阳性血清混合物。性血清混合物。nANA：1：1001:320，ANA荧光模型：均质型，颗荧光模型：均质型，颗粒型，核仁型，或胞浆型等（可以每粒型，核仁型，或胞浆型等（可以每6个月变换，存储质控个月变换，存储质控品至少有品至少有2个模型）个模型）nanti-dsDNA：1:101:32nanti-ENA：低度阳性或：低度阳性或临界值临界值24倍的样本倍的样本（若组合式（若组合式检测，至少有检测，至少有2个项目为弱阳性）个项目为弱阳性）质控物的选择质控物的选择1 1 收收集集阳阳性性血血清清(无无明明显显溶溶血血、黄黄疸疸、脂脂血血及及污污染染血血清清)到到一一定定量（至少够本室使用量（至少够本室使用6 6个月以上）；个月以上）；2 2 传染性病原体需经传染性病原体需经5656、1010小时灭活后使用；小时灭活后使用；生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；4 4 稀释：用正常人血清稀释；稀释：用正常人血清稀释；5 5 定定值值：与与定定值值参参考考品品进进行行对对比比、求求值值，无无参参考考品品时时选选择择在在2 2-4 4倍倍Cut OffCut Off值值附近的阳性值；附近的阳性值；6 6 分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20-20冻存备用；冻存备用；7 7 稳定性及瓶间差评价。稳定性及瓶间差评价。自制质控品自制质控品n不同保存条件下：不同保存条件下：2-82-8：CVCV值值（滴滴度度符符合合率率）、累累计计CVCV值值（符符合合率），稳定期率），稳定期 -70 -70：CVCV值、累计值、累计CVCV值，稳定期值，稳定期 室温：室温：CVCV值、累计值、累计CVCV值，稳定期值，稳定期1 1）均一性评估：同批号质控品随机抽取）均一性评估：同批号质控品随机抽取5 5支支（瓶），（瓶），80%80%符合为合格。符合为合格。2 2）稳定性评估：评估）稳定性评估：评估1 1周，周，1 1月，月，3 3月，月，6 6月，月，1 1年年。有。有效期一般可标定为效期一般可标定为1 1年。年。质控品稳定性的评价质控品稳定性的评价o纯定性试验：纯定性试验：如免疫印迹、免疫金标等，除膜条如免疫印迹、免疫金标等，除膜条本身的内对照外：本身的内对照外：n每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。个水平进行质控。n质控判定规则质控判定规则o阴性质控品的检测结果为阴性阴性质控品的检测结果为阴性o弱阳性质控品的检测结果为弱阳性弱阳性质控品的检测结果为弱阳性纯定性试验的质控要求纯定性试验的质控要求如：抗如：抗ENA抗体谱检测抗体谱检测o以滴度或稀释度判定的试验：如间接免疫荧光法、凝集试验以滴度或稀释度判定的试验：如间接免疫荧光法、凝集试验等。等。n每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。平进行质控。n质控判定规则：质控判定规则：o阴性质控结果为阴性阴性质控结果为阴性o弱阳性质控结果在弱阳性质控结果在靶值上下一个滴度或稀释度靶值上下一个滴度或稀释度纯定性试验的质控要求纯定性试验的质控要求如：ANA、ANCA等o用数值判定结果的试验：如用数值判定结果的试验：如ELISAELISA等。等。n浓度：弱阳性质控品浓度宜在浓度：弱阳性质控品浓度宜在2 24 4倍临界值左右，阴性倍临界值左右，阴性质控品浓度宜质控品浓度宜0.50.5倍临界值左右（两个水平）。倍临界值左右（两个水平）。n频次：频次：ELISAELISA应每板做质控。应每板做质控。n质控判定规则：至少利用其多规则中一个偶然误差及一个质控判定规则：至少利用其多规则中一个偶然误差及一个系统误差规则。系统误差规则。12s警告，警告，13s和和22s失控失控。数值化定性试验的质控要求数值化定性试验的质控要求n发现问题发现问题n分析问题产生的原因分析问题产生的原因n采取纠正措施加以改进，进而预防采取纠正措施加以改进，进而预防n验证和追踪验证和追踪 避免同样的问题出现第二次！避免同样的问题出现第二次！失控原因分析及处理失控原因分析及处理n阳阳性性质质控控品品失失控控的的常常见见原原因因:加加样样不不准准、温温育育时时间不稳定、偶然误差。间不稳定、偶然误差。n阴阴性性质质控控品品的的常常见见失失控控原原因因：污污染染、洗洗板板不不干干净净、标本间的交叉污染。标本间的交叉污染。n处处理理措措施施：一一次次性性吸吸头头的的使使用用，洗洗板板机机的的维维护护，洗洗液液的的定定期期更更换换，温温育育温温度度和和温温育育时时间间的的保保证证，加样器及酶标仪的校准，荧光显微镜的维护等。加样器及酶标仪的校准，荧光显微镜的维护等。失控原因分析及处理失控原因分析及处理n对对没没有有开开展展室室间间质质评评的的检检验验项项目目，实实验验室室应应通通过过与与其其他他至至少少2 2个个以以上上实实验验室室比比对对的的方方式式判判断断检检验验结结果果的的可接受性，并应满足如下要求：可接受性，并应满足如下要求：（a a）规定比对实验室的选择原则；规定比对实验室的选择原则；（b b）样品数量：至少样品数量：至少5 5份份，包括阴性和阳性；，包括阴性和阳性；（c c）频率：至少频率：至少每年每年2 2次次；（d d）判定标准：应有判定标准：应有80%80%的结果符合要求；的结果符合要求；（e e）结结果果不不一一致致时时，应应分分析析不不一一致致的的原原因因，必必要要时时，采采取取有有效效的的纠纠正正措措施施，并并定定期期评评价价实实验验室室间间比比对对对对其其质质量量的的改改进进作用，保留相应的记录。作用，保留相应的记录。三、三、室间质评与实验室比对室间质评与实验室比对 如如果果采采用用手手工工操操作作或或同同一一项项目目使使用用两两套套以以上上检检测测系系统统时时.，应应至至少少每每年年1 1次次进进行行实实验验室室内内部部比比对对，包包括括人人员员和和不不同同方方法法/检检测测系系统统间间的的比比对对，至至少少选选择择2 2份份阴阴性性标标本本(至至少少1 1份份其其它它标标志志物物阳阳性性的的标标本本)、3 3份份阳阳性性标标本本(至至少少含含弱弱阳阳性性2 2份份)进进行行比比对对，评评价价比比对对结结果果的的可可接接受受性性。出出现现不不一一致致，应应分分析析原原因因，并并采采取取必必要要的的纠纠正正指指施施，及及时时评评估估纠纠正正指指施施的的有有效效性性，有有相应的记录。相应的记录。比比对对记记录录应应由由实实验验室室负负责责人人审审核核并并签签字字，并并应应保留至少保留至少2 2年年。实验室内部比对实验室内部比对THANKSTHANKS医学资料仅供参考,用药方面谨遵医嘱