黄连素通过重塑肠道菌群和调节PI3K_AKT信号通路改善多囊卵巢综合征小鼠的作用机制研究.pdf

352.疑难病杂志2 0 2 4年3月第2 3卷第3期Chin J Diffic and Compl Cas,March2024,Vol.23,No.3D01】10.396 9/j.i s s n.16 7 1-6 450.2 0 2 4.0 3.0 18黄连素通过重塑肠道菌群和调节PI3K/AKT信号通路改善多囊卵巢综合征小鼠的作用机制研究论著基础杨宇琦，吴丽娜，孙克，邢伟园，侯越，张丽文基金项目：上海市卫生健康委员会科研课题（2 0 2 0 4Y0392）；上海市闵行区自然科学研究课题（2 0 2 3MHZ040）作者单位：2 0 110 0 上海，复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科通信作者：张丽文，E-mail：18 918 17 7 8 19 16 3.c o m【摘要】目的探究黄连素（BBR)对多囊卵巢综合征(PCOS)小鼠肠道菌群的调节作用及其治疗机制。方法于2 0 2 1年6 月一2 0 2 2 年6 月在复且大学附属上海市第五人民医院实验动物中心进行实验。清洁级健康雌性C57BL/6J小鼠2 4只，随机选取6 只作为正常对照组，其余18 只应用来曲唑灌胃制备PCOS模型。造模成功后，将造模小鼠随机分为模型(PCOS)组、阳性药达英-35(0.2 mgkg-1d-)组和BBR(100kg-.d-)组，每组6 只，给予相应药物治疗14d。收集小鼠结肠内粪便,采用16 S rDNA测序检测肠道菌群;称小鼠体质量,观察小鼠阴道脱落细胞形态学改变;检测血清性激素和胰岛素水平;HE染色观察卵巢病理结构;免疫组化检测小鼠结肠Claudin-1、O c c lu d in表达；Westerm-blot检测卵巢组织PI3K/AKT通路相关蛋白表达。结果16 SrDNA测序结果显示,PCOS组肠道菌群多样性较正常对照组发生变化。在属水平，与正常对照组比较,PCOS组布劳特氏菌属、韦永氏球菌属、李生球菌属和梭形杆菌属等有害菌属丰度增加；BBR治疗后小鼠肠道菌群紊乱状态得到改善，乳酸菌属等有益菌属丰度增加。与正常对照组比较,PCOS组小鼠雌二醇（E,）、卵泡刺激素（FSH)和胰岛素敏感系数（ISI)水平降低（t/P=2.847/0.017，3.079/0.012,3.541/0.005），体质量和睾酮（T）、黄体生成素（LH）、L H/FSH、空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）、胰岛素抵抗指数（H0MA-IR)水平升高（t/P=4.782/0.013,4.626/0.001,5.703/0.001,2.578/0.028,4.156/0.002，3.255/0.009,7.439/0.001），动情周期紊乱，光镜下卵巢结构符合PCOS病理特征，Claudin-1、O c c l u d i n、p-PI 3K/PI 3K和p-AKT/AKT表达下降(t/P=3.806/0.003,3.795/0.004,13.474/0.001,17.285/0.001)。与PC0S组比较,达英-35组E,、FSH 和ISI水平升高（t/P=2.389/0.038,3.354/0.007,3.198/0.010），体质量和T、L H、L H/FSH、FI NS、HOMA-IR水平降低(t/P=3.133/0.011,3.416/0.007,4.596/0.001,2.327/0.042,2.908/0.016,6.096/0.001),动情周期和卵巢结构得到改善Claudin-1、O c c l u d i n、p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT表达升高（t/P=2.390/0.038,2.247/0.048，7.323/0.001,7.564/0.001);BBR组ISI水平升高（t/P=3.198/0.010），体质量和T、L H、L H/FSH、FPG、FINS、H0MA-IR水平明显降低（t/P=3.668/0.004,4.602/0.001,6.101/0.001,2.535/0.030,5.950/0.001,2.914/0.015,7.630/0.001），动情周期和卵巢结构得到改善，Claudin-1、O c c l u d i n、p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT表达升高（t/P=3.799/0.003,3.185/0.010，7.47 3/0.0 0 1,8.18 7/0.0 0 1）。结论来曲唑诱导的PC0S小鼠存在菌群失调,BBR通过调节肠道菌群分布可能有助于激活PI3K/AKT通路，改善肠道屏障功能,达到治疗PCOS的目的。【关键词】多囊卵巢综合征；黄连素；肠道菌群；PI3K/AKT信号通路；小鼠【中图分类号】R711.75Mechanism of action of flavopiridol to improve polycystic ovary syndrome by remodeling intestinal flora and regula-ting PI3K/AKT signaling pathway Yang Yuqi,Wu Lina,Sun Ke,Xing Weiyuan,Hou Yue,Zhang Liwen.Department ofObstetrics and Gynecology,Shanghai Fifth Peoples Hospital,Fudan University,Shanghai 201100,ChinaFunding program:Scientific Research Project of Shanghai Municipal Health and Wellness Commssion(20204Y0392);NaturalScience Research Project of Minhang District,Shanghai(2023MHZ040)Corresponding author:Zhang Liwen,E-mail:18918177819 Abstract Objective To investigate the regulatory effect of BBR on the intestinal flora of mice with polycystic o-vary syndrome(PCOS)and its therapeutic mechanism.Methods In June 2021-June 2022,experiments were carried out inthe Experimental Animal Center of Shanghai Fith Peoples Hospital Affiliated to Fudan University,24 clean-grade healthy fe-【文献标识码】A疑难病杂志 2 0 2 4年3月第2 3卷第3期Chin J Dific and Compl Cas,March 2024,Vol.23,No.3male C57BL/6J mice,6 mice were randomly selected as the normal control group,and the remaining 18 mice were used toprepare the PCOS model by letrozole gavage.After successful modeling,the modeled mice were randomly divided into themodel(PCOS)group,the positive drug daunin-35(02 mg kg*.d)group and the BBR(100 kg*1:d-)groups,6mice in each group,were given the corresponding drugs for 14 d.Feces were collected from the colon of the mice,and 16SrDNA sequencing was used to detect intestinal flora;mice were weighed,and morphological changes of vaginal exfoliatedcells were observed;serum sex hormone and insulin levels were detected;HE staining was used to observe the pathologicalstructure of the ovary;immunohistochemistry was used to detect the expression of Claudin-1 and Occludin in the colon ofmice;and Westerm-blot was used to detect the expression of proteins related to the PBK/AKT pathway in the ovary tis-sues.Results The 16S rDNA sequencing showed that the diversity of intestinal flora in the PCOS group was changedcompared with that in the normal control group.At the genus level,the abundance of harmful bacteria such as Blautia,Fu-sobacterium spp.,Coccidioides immitis,Coccidioides twins and Clostridium spp.was increased in the PCOS group comparedwith the normal control group,while the disordered state of the intestinal flora of the mice was improved by BBR,and theabundance of beneficial bacteria,such as Lactobacilus spp.,was increased.Compared with the normal control group,mice inthe PCOS group had reduced levels of estradiol(E2),folicle-stimulating hormone(FSH),and insulin sensitivity index(ISI)(t/P=2.847/0.0173.079/0.012,3.541/0.005),body mass and testosterone(T),luteinizing hormone(LH),LH/FSH,fasting glucose(FPG),fasting insulin(FINS),and insulin resistance index(HOMA-IR)levels were elevated(t/P=4.782/0.013,4.626/0.001,5.703/0.001,and 2578/0.028,4.156/0.002,3.255/0.009,7.439/0.001),disturbances in the motility cycle,light microscopicovarian structures consistent with PCOS pathology,and decreased expression of Claudin-1,Occludin,p-PI3K/PI3K,andp-AKT/AKT(t/P=3.806/0.003,3.795/0.004,13.474/0.001,17285/0.001).Compared with the PCOS group,E2,FSH,and ISIlevels were elevated(t/P=2.389/0.0383.354/0.007,3.198/0.010),and body mass and T,LH,LH/FSH,FINS,and HOMA-IR lev-els were decreased in the darbepoetin-35 group(t/P=3.133/0.011,3.416/0.007,4.596/0.001,2.327/0.042,2.908/0.016,6.096/0.001),improved motility cycle and ovarian structure,Claudin-1,Occludin,p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT expression was el-evated(t/P=2.390/0.038,2247/0.048,7323/0.001,7.564/0.001);BBR group ISI levels were elevated(t/P=3.198/0.010),andbody mass and T,LH,LH/FSH,FPG,FINS,HOMA-IR levels were decreased(t/P=3.668/0.004,4.602/0.001,6.101/0.001,2.535/0.030,5.950/0.001,2.914/0.015,7.630/0.001),improved motility cycle and ovarian structure,improved levels of Clau-din-1,Occludin,p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT expression was elevated(t/P=3.799/0.003,3.185/0.010,7.473/0.001,8.187/0.001).Conclusion Letrozole-induced PCOS mice have dysbiosis,BBR may help to activate the PI3K/AKT pathway andimprove the intestinal barrier function by regulating the distribution of intestinal flora to achieve the therapeutic purpose ofPCOS.Key words Polycystic ovary syndrome;Flavopiridol;Intestinal flora;PI3K/AKT signaling pathway;Mice多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS)是女性最常见的生殖内分泌疾病,也是育龄期女性不孕的重要原因 。PCOS发病机制较为复杂，其治疗方法具有局限性。因此，寻找有效的治疗药物至关重要。黄连素（berberine,BBR）是一种天然异喹啉生物碱,具有降糖、降脂和抗炎等有益作用。据报道,BBR对 PCOS显示出良好的临床疗效 2 ,但其具体机制尚未可知。研究表明，肠道菌群及其代谢产物失调与PCOS的生殖和代谢表型存在联系 34,靶向调节肠道菌群可改善PCOS5-6。由于BBR吸收率低，其分解代谢主要集中在胃肠道，可能有效调节肠道菌群和肠道黏膜屏障 7 。因此,本研究采用来曲唑诱导的PCOS小鼠模型,利用16 S rDNA 基因测序技术,研究BBR对PCOS肠道菌群的调节作用及可能机制，报道如下。353.1 材料与方法1.1材料（1)动物：清洁级健康雌性C57BL/6J小鼠2 4只，6 8 周龄，体质量15 2 0 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2020-0004。饲养在特定的无菌条件下，标准温度(222),相对湿度45%7 0%,光暗周期12/12 h，并给予自由饮水和标准饮食。屏障环境适应1周后进行后续实验。（2）试药试剂：来曲唑（货号H199991001）购自江苏恒瑞医药公司；达英-35（货号j20140114）购自德国拜耳公司；黄连素（批号B21449）购自上海源叶生物公司；睾酮（T，货号H090-1-1）、雌二醇（E2，货号H102-1-1）和促黄体生成素（LH,货号H206-1-2)购自南京建成公司;空腹胰岛素（FINS,货号ml060484）和卵泡刺激素（FSH，货号ml059034）ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物公司;HE检测试354.剂盒（货号G1003）购自武汉塞维尔生物公司；抗Oc-cludin（G B11140 1）、Cl a u d i n-1（G B140 6 6）抗体购自美国Servicebio公司；抗PI3K（42 55S）和PI3K-p85（42 92 S）抗体购自美国CST公司；抗AKT（a b 8 8 0 5）和AKT-pT30磷酸化抗体（ab32445）购自美国Abcam公司。（3）仪器设备：离心机（AXTCL16M）购自江苏恒诺仪器制造有限公司；切片机（RM2235）和石蜡包埋机（G1150H)购自德国徕卡公司;I-Sanger生信云平台(htps:/www.i- 0 2 1年6 月一2022年6 月在复旦大学附属上海市第五人民医院实验动物中心进行实验。采用随机数字表法将2 4只雌鼠分为正常对照组、模型（PCOS）组、阳性药达英-35(0.2 mgkg-1.d-1)组和 BBR(100 mgkg-1.d-1)组,每组6 只。除正常对照组外,其余小鼠均予以来曲唑(1 mgkg=1.d-1,溶于1%羧甲基纤维素)灌胃诱导PCOS模型，连续2 1d,正常对照组给予等容积0.9%氯化钠溶液。以第1次给来曲唑为第1天计算，第8 天开始连续每日取小鼠阴道上皮细胞涂片观察脱落细胞改变，分析动情周期变化，以阴道上皮细胞持续角化者为造模成功。造模成功后，第2 2 天开始给予相应剂量药物连续灌胃治疗 14 d,正常对照组和 PCOS组给予等容积0.9%氯化钠溶液。实验期间，每周监测小鼠体质量。实验结束后,禁食10 h后过量麻醉处死,收集血清、双侧卵巢和结肠作进一步分析。1.3观测指标与方法1.3.116SrDNA基因测序检测各组小鼠肠道菌群变化：实验结束后，收集各组小鼠粪便样本，按照文献8报道方法，从小鼠粪便样本中提取微生物基因组DNA。PC R扩增方法如下:9 8 2 min，随后在9 8 15s，5530 s，7 2 30 s 下循环2 5次，最后在7 2 延伸5min。使用正向引物338 F（5-A CT CCT A CCG-GACGCAGCA-3）和反向引物8 0 6 R（5-G G A C T A C H-VGGGTWTCTAAT-3）在7 2 下进行最终延长5min，制备文库（连接接头和指示剂）和纯化。微生物组生物信息学采用QIME22019.4进行，并根据官方教程(https:/docs.qime2.org/2019.4/tutorials/）进行轻微修改。基于操作分类单元（OTU）注释，结合门、纲、目、科、属等分类水平,生成相对丰度谱。采用Pearson相关系数矩阵进行UPGMA聚类,并在R统计软件包中开发自定义脚本生成热图，对差异较大的每个类群或 OTU进行评价。1.3.2血清激素水平测定：各组小鼠末次给药后，于眼眶后静脉丛采血0.5 1.0 ml,室温静置2 h后,4疑难病杂志 2 0 2 4年3月第2 3卷第3期Chin J Diffic and Compl Cas,March 2024,Vol.23,No.3离心收集上层血清。利用酶联免疫吸附法并按照试剂盒说明书检测血清激素水平：T、E2、FSH、L H 和FINS。1.3.3胰岛素代谢相关指标测定：上述血液以Hita-chi-7600自动生化分析仪测量空腹血糖（FPG）；分别根据公式 FINS（IU/ml）FPG（m m o l/L)/2 2.5 和1/FPG（m m o l/L）FI NS（IU/ml)计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感系数(ISI)。1.3.4HE染色检测小鼠卵巢病理结构:取各组小鼠卵巢组织,4下以4%多聚甲醛固定48 h，常规石蜡包埋，切片厚5m。利用HE染色试剂盒，并按照说明书步骤行HE染色。光镜下评估创面组织形态学变化。1.3.5结肠Occludin、Cl a u d i n-1表达：将结肠组织切片放人6 5烤箱烘烤30 min后，二甲苯脱蜡，酒精梯度复水。在0.0 1mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中煮沸2 0 min，抗原修复。3%H,0z封闭切片5min后，室温下山羊血清封闭15min，分别用紧密连接蛋白Oc-cludin 和 Claudin-1的特异性一抗(1:2 0 0)4下孵育过夜；次日，用生物素标记的山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶在室温下各孵育15min。3,3二氨基联苯胺（D A B）显色5min，苏木精复染。使用光学显微镜获得图像，阳性结果呈棕褐色，并进行蛋白定量分析。1.3.6Western-blot检测小鼠卵巢组织PI3K/AKT通路相关蛋白表达：各组小鼠卵巢组织在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中进行裂解，并利用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。2 0 g卵巢蛋白经10%SDS-PAGE电泳分离,并在10 0 V下转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上6 0 8 0 min。非特异性结合点在室温下用5%脱脂牛奶在三相缓冲盐水(TBS-T)中阻断1h后，用PI3K（1:50 0）、p-PI3K（1:30 0）、A K T(1:500)、p-A K T(1:30 0)和-actin(1:5000)的一抗孵育PVDF膜。次日,用辣根过氧化物酶标记的山羊抗免二抗(1:50 0 0)作为二抗,以-actin为内参,采用ImageJ软件进行定量分析。1.4统计学方法采用GraphPadPrism9.0绘图并利用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。符合正态分布计量资料以s表示，2 组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析并进行Mann-WhitneyU检验。P0.05为差异有统计学意义。2结 果2.1各组小鼠肠道菌群丰度和多样性比较2.1.1OUT分析及物种组成分析：正常对照组、PCOS组、达英-35组和BBR组特有的OTU数分别为9 49 9疑难病杂志 2 0 2 4 年3月第2 3卷第3期Chin J Dific and Compl Cas,March 2024,Vol.23,No.3(25.04%)，6 534(17.32%)、7 0 8 9(18.7 9%)和7 2 12（19.11%）。根据0 UT聚类的结果，可获得4组小鼠在门、纲、目、科、属、种水平的丰度信息，见表1。表14组小鼠肠道各级微生物分类群的数量Tab.1Number of microbial taxa at all levels of the intestinal tractof mice in the 4groups组别门纲目正常对照组50PCOS 组48达英-35组44BBR组452.1.2多样性分析：正常对照组、PCOS组、达英-35组和BBR组小鼠肠道菌群的Simpson指数分别为0.9862、0.47 2 3.0.8 8 7 6 和0.97 8 4,Shannon指数分别为9.0 8 9 2、3.2 341、8.6 7 2 8 和8.42 36,4组间Simpson 和 Shannon 指数比较，差异有统计学意义(P0.001)。2.1.3多样性分析：剔除远离总体的部分样本后，非加权主坐标分析(PCoA)结果表明,4组肠道菌群组成有明显差异。Axis1和Axis2轴对结果的解释度分别为7.3%和5.5%，见图1。0.2%992S1XY00.2#0.2图14组小鼠PCoA分析结果Fig.1 Results of PCoA analysis in the 4 group of mice2.1.4牛物种差异分析：2.1.4.1门水平菌群丰度比较4组小鼠肠道门水平菌群丰度比较（前2 0 位），菌群组成以厚壁杆菌门和拟杆菌门为主。正常对照组、PCOS 组、达英-35组和BBR组厚壁杆菌门占比分别为（7 2.542.36)%、(72.582.28)%、（7 6.8 13.2 3)%和(7 4.2 3 2.98）%，拟杆菌门占比分别为（2 5.8 7 1.6 7）%、355.(27.131.89)%、(2 1.6 7 1.6 2)%和(2 4.131.87)%。4组间厚壁杆菌门和拟杆菌门丰度比较差异无统计学意义（F/P=0.173/0.894,0.241/0.812）。2.1.4.2属水平菌群丰度比较在属水平上，与正常对照组比较,PCOS组小鼠中布劳特氏菌属（Blautia）、韦永氏球菌属（Veillonella）、李生球菌属（Gemella）和梭形杆菌属（Fusobacterium）的丰度增加，颤螺旋菌属科属8710287978091829700.2Axis17.3%种174215169219179214179233廖正常对照组PCOS组海达英-35组+BBR组0.4（H e l i c o b a c t e r）、粪球菌属（Coprococcus）和瘤胃球菌属99106104109（Ru m i n o c o c c u s）的丰度减少(P均 0.0 5）;与PCOS组比较，BBR组普氏菌属（Prevotell）、韦永氏球菌属（Ve i l l o n e l l a）、李生球菌属（Gemella）和梭形杆菌属（Fu s o b a c t e r i u m）的丰度降低，而布劳特氏菌属（Blau-tia）、颤螺旋菌属（Helicobacter）、瘤胃球菌属（Rumino-coccus）、乳酸菌属（Lactobacillus）、粪球菌属（Copro-coccus）、副杆菌属（Parabacteroides）、粪杆菌属（Faeca-libacterium）、罗氏菌属（Roseburia）、酪酸菌属（Butyr-icicoccus）、链球菌属（strecoccus）和帕拉普氏菌属（Pa-raprevotella)等有益菌属的丰度均增加（P均 0.0 5）。前15位有丰度差异的属水平菌群见图2。100%80%(%)snUo860%40%20%0%正常组PCOS组达英-35组BBR组图2 4组小鼠属水平肠道菌群丰度比较Fig.2Comparison of gut flora abundance at genus level in 4groups of mice2.2各组小鼠体质量比较达英-35组和BBR组小鼠末次给药时体质量分别为(16.23 0.87)g(22.76 3.23)g、(18.45 0.96)g和(17.8 8 0.43)g。与正常对照组小鼠比较,PCOS组小鼠体质量增加（t/P=4.782/0.013）；与PCOS组比较，达英-35组和BBR组小鼠体质量明显降低(t/P=3.133/0.011,3.668/0.004)。2.3各组小鼠发情周期比较小鼠月经周期呈现动w交正常对照组、PCOS组、356.情前期（P）、动情期（E）、动情间期（M）和动情后期（D）,4 5d 为1个性周期且规律出现;阴道涂片细胞学分析发现,正常对照组小鼠月经周期正常,PCOS组小鼠D期延长，提示无排卵；达英-35组和BBR组小鼠发情周期在治疗后逐渐恢复规律，见图3。2.4各组小鼠血清性激素水平比较与正常对照组比较,PCOS 组小鼠血清 T、L H 和 LH/FSH水平升高，E,和FSH水平降低(t/P=4.626/0.001,5.703/0.001,2.578/0.028,2.847/0.017,3.079/0.012)。与 PC0S组比较,达英-35组小鼠血清T、L H 和LH/FSH水平降低,E,和FSH水平升高（t/P=3.416/0.007,4.596/0.001,2.327/0.042,2.389/0.038,3.354/0.007),BBR组血清T、L H 和LH/FSH水平亦降低（t/P=4.602/0.001,6.101/0.001,2.535/0.030),但PC0S组和BBR组E2和FSH水平比较差异无统计学意义(t/P=1.031/0.327,1.623/0.136）,见表2。2.5各组小鼠胰岛素代谢相关指标水平比较常对照组比较,PCOS组小鼠FPG、FINS和HOMA-IR水平升高,ISI降低（t/P=4.156/0.002,3.255/0.009,7.439/0.001,3.541/0.005);与PCOS 组比较,BBR组 FPG、FINS 和 HOMA-IR 水平明显下调,ISI 上调(t/P=5.950/0.001,2.914/0.015,7.630/0.001,3.198/0.010）；达英-35组和PCOS组比较，FINS和HOMA-IR水平亦降低，ISI升高（t/P=2.908/0.016，疑难病杂志 2 0 2 4年3月第2 3卷第3期Chin J Diffic and Compl Cas,March 2024,Vol.23,No.36.096/0.001,3.194/0.010），而FPG差异无统计学意义（t/P=0.906/0.386），见表3。表3各组小鼠胰岛素代谢水平比较（n=6,s)Tab.3Comparison of insulin metabolism levels in mice in eachgroup of miceFPG组别(mmol/L)正常对照组3.310.8 9PCOS 组5.18 0.654达英-35组4.81 0.76BBR 组3.42 0.32bF值23.754P值0.001注与正常对照组比较，P0.05;与PCOS组比较，P0.05。2.6各组小鼠卵巢组织病理形态比较HE染色结与正果显示,与正常对照组比较,PCOS 组小鼠的卵巢形态发生了改变,卵巢皮质增厚,结构不均匀,无黄体或黄体数量极少,囊性卵泡体积增大,卵巢呈典型的多囊性改变,原始卵泡和初级卵泡数量明显减少。与PCOS组比较，达英-35组镜下可见卵巢皮质层略有变薄，黄体数量增多,卵泡体积变小;BBR组小鼠卵巢皮质层显著变薄,黄体数量明显增多，卵泡形态完整，排列整齐,见图4。FINS(IU/ml)6.03 0.948.45 1.56a6.17 1.12b6.13 1.17b13.5780.001ISI0.056 0.0210.024 0.007a 1.62 0.21a0.041 0.011b 1.03 0.11b0.048 0.017b.0.92 0.08b10.7070.001HOMA-IR0.76 0.1970.3460.001DDD12345678（d)正常对照组Tab.2Comparison of serum sex hormone levels in mice in each group of mice组别n正常对照组6PCOS 组6达英-35组6BBR组6F值P值注：与正常对照组比较，P0.05；与PCOS组比较，P0.05。12345678(d)12345678(d)PCOS组达英-35组注：P.动情前期；E.动情期；M.动情间期；D.动情后期。图3各组小鼠发情周期比较Fig.3 Comparison of estrous cycle of mice in each group表2 各组小鼠血清性激素水平比较（s)T(g/L)Ez(pmol/L)5.06 1.65157.32 26.6810.78 2.54a116.12 23.34a6.13 2.16b147.32 21.88b4.43 2.23b132.23 30.344.3846.1460.0160.0042345678(d)BBR组FSH(mIU/ml)LH(mIU/ml)5.54 1.786.89 0.762.67 1.4349.87 1.0345.42 1.41b7.34 0.87b3.92 1.236.43 0.92b9.03630.4940.0010.001LH/FSH1.24 0.322.69 1.341.35 0.44b1.24 0.41 b10.2140.001疑难病杂志 2 0 2 4 年3月第2 3卷第3期Chin J Dific and Compl Cas,March 2024,Vol.23,No.3357.正常对照组Fig.4 Comparison of histopathologic morphology of mouse ovary in each group(HE staining,100)2.7各组小鼠结肠组织Claudin-1和Occludin表达水平比较免疫组化结果显示，与正常对照组比较，PCOS组小鼠结肠组织Claudin-1和Occludin蛋白水平下降(t/P=3.806/0.003,3.795/0.004);与PC0S组比较,达英-35组和BBR组小鼠结肠组织 Claudin-1和Occludin表达均升高（t/P=2.390/0.038,2.247/0.048;3.799/0.003,3.185/0.010），见表4。表4各组小鼠结肠组织Claudin-1、O c c l u d i n 表达水平比较(元s)Tab.4 Comparison of the expression levels of Claudin-1 and Oc-cludin in the colonic tissues of mice in each group组别正常对照组PCOS组达英-35组BBR 组F值P值注：与正常对照组比较，P0.05；与PCOS组比较，P0.05。2.8各组小鼠卵巢组织PI3K/AKT相关蛋白表达比较与正常对照组比较,PCOS组小鼠卵巢组织p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低（t/P=13.474/0.001,17.285/0.001);与PC0S组比较，达英-35组和BBR组小鼠卵巢组织 p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(t/P=7.323/0.001,7.564/0.001;7.473/0.001,8.187/0.001),见表5。3讨论PCOS是育龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，患者面临排卵障碍引起的不孕症等疾病的更高风险 1。目前西医治疗PCOS的药物长期使用效果不佳,甚至会产生诸多不良反应。开发既能有效治疗PCOS且不良反应小的药物，并探索其作用机制，已成为当今PCOS研究的重要方向和热点。PCOS组注：黑色箭头所示为卵泡，红色箭头所示为黄体。图4各组小鼠卵巢组织病理形态比较(HE染色，10 0)比较(元s)Tab.5Comparison of the expression of PI3K/AKT pathway-relat-ed proteins in the colon tissues of mice in each group组别P-AKT/AKT正常对照组6PCOS 组6达英-35组6BBR 组6F值P值注：与正常对照组比较，P0.05；与PCOS组比较，bP0.05。根据PCOS 临床及病理特征,Kafali 等 9 首创的利nClaudin-1623.67 6.83612.16 2.87a619.86 7.35b622.91 6.31b7.9150.001达英-35组表5各组小鼠结肠组织PI3K/AKT通路相关蛋白表达1.04 0.050.51 0.08a0.66 0.02a0.87 0.09b0.77 0.03b0.93 0.11 b0.84 0