两种不同HPV检测方法在宫颈癌筛查中的诊断效能比较.pdf

172024,14(3)医师在线 第 14 卷 第 3 期论著两种不同 HPV 检测方法在宫颈癌筛查中的诊断效能比较脱晋，金东玲，羿爱华，张茗大连市妇女儿童医疗中心（集团），辽宁大连 116000【摘要】目的 探讨人乳头状瘤病毒（HPV）核酸检测试剂盒（杂交捕获-化学发光法）（商品名：DH3）HPV-DNA 检测与 Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测在宫颈癌筛查中的准确度。方法 选取 2017 年 8 月 2022 年 2 月在大连市妇女儿童医疗中心（集团）春柳院区宫颈疾病诊疗中心进行宫颈癌筛查的女性共 583 例，同时行液基细胞学检查（TCT）、DH3 HPV-DNA 检测及 Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测，TCT 结果为 ASCUS 及以上或同时合并 HPV 阳性或 HPV 持续阳性、以及 TCT 持续呈 ASCUS 改变者转诊行阴道镜检查，在异常部位行宫颈活检，必要时进行颈管搔刮。以组织病理学结果为金标准，比较两种 HPV 检测方法的准确性。结果 583 例受检者中，DH3 HPV-DNA 检测阳性率为 50.1%（292/583）、Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测阳性率为 60.7%（354/583），两者阳性率比较，差异有统计学意义（P 0.001）。随着病变级别的加重，两种 HPV 检测阳性率均升高。在组织病理学诊断为 LSIL 及 LSIL-的患者中，DH3 HPV-DNA 和 Aptima HPV E6/E7 mRNA 的阳性率分别为 36.6%和 49.3%，两者比较，差异有统计学意义（P 0.001）。在组织病理学诊断为 HSIL 的患者中，DH3 HPV-DNA 和 Aptima HPV E6/E7 mRNA 的阳性率分别为 94.7%和 98.5%，两者比较差异无统计学意义。DH3 HPV-DNA 和 Aptima HPV E6/E7 mRNA 诊断 HPV 的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为 94.8%、63.4%、43.8%、97.6%，98.5%、50.7%、37.6%、99.1%，两者比较，Aptima HPV E6/E7 mRNA 的灵敏度和阴性预测值均高于 DH3 HPV-DNA 检测方法，但差异无统计学意义（P 0.05）。DH3 HPV-DNA 特异度高于 E6/E7 mRNA 检测方法，差异具有统计学意义（P0.001）。DH3 HPV-DNA与Aptima HPV E6/E7 mRNA检测HPV的一致率为81.8%（477/583），Kappa值为0.636，一致性尚好。结论 两种 HPV 检测方法进行宫颈癌筛查的效能相当，结合 TCT 检查可以提高宫颈癌筛查的准确度。【关键词】HPV 检测方法；宫颈癌筛查；准确度随着人们生活水平的提高以及对自身健康状况的重视，越来越多的人会主动进行健康体检，其中很多女性会选择进行宫颈癌筛查。这是因为宫颈癌在发展中国家的发病率一直居高不下，据世界卫生组织/国际癌症研究署（World Health Organization/International Agency for Research on Cancer，WHO/IARC）2020 年统计数据显示，宫颈癌是女性第四大恶性肿瘤，全球新发宫颈癌病例 60.4 万，死亡 34.2 万，其中 88.1%的新发病例和91.4%的死亡病例发生在中、低收入国家1。目前的研究已经明确，持续性的高危型人乳头瘤病毒（High risk Human Papilloma Virus，Hr-HPV）感染是宫颈癌发生的必要条件，WHO 在 2021 年发布的预防宫颈癌：宫颈癌前病变筛查和治疗指南中指出 Hr-HPV 检测通常包括 14 种型别：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型2。而关于宫颈癌筛查的方法，中国优生科学协会阴道镜和宫颈病理学分会（Chinese Society for Colposcopy and Cervical Pathology of China Healthy Birth Science Association，CSCCP）、美国阴道镜与子宫颈病理学会（American Society of 基金项目：大连市医学科学研究计划项目（1811082）Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）及 WHO 均建议进行新柏氏液基细胞学检查（Thinprep Cytologic Test，TCT）和 Hr-HPV 的联合筛查，或者是单独进行 Hr-HPV 筛查，可见Hr-HPV 检测准确的重要性。传统的 HPV 检测是以 HPV 的 DNA 片段为检测目标，而2012 年由美国食品药品管理局批准的 Aptima HPV 检测技术，是目前基于 HPV 致癌基因 E6、E7 病毒信使 RNA（mRNA）的新一代宫颈癌筛查技术。人乳头状瘤病毒（HPV）核酸检测试剂盒（杂交捕获-化学发光法）（商品名：DH3）HPV-DNA检测是国内第一家获批的杂交捕获技术的核酸检测技术，2014年批准使用，它使用全长 8 000bp RNA 探针针对 HPV 全基因组进行检测，可避免因基因片段丢失引起的假阴性。两种检测方法均对 14 种 Hr-HPV 进行检测，而且都对 HPV16、18 进行进一步分型检测，这两种检测方法孰优孰劣，需要更多的临床数据来验证它们的诊断准确性。本课题通过研究近期在我院宫颈病变诊疗中心进行宫颈癌筛查的妇女，同时行 TCT、DH3 HPV-DNA 和 Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测，检测结果分两组进行评价：DH3 组（TCT 联合 DH3 HPV-DNA）、E6/E7 组（TCT 联合 Aptima HPV E6/E7 mRNA），并对检测结果阳性的患者进行阴道镜下活检，以组织病理学结果为金标准，分析两种 HPV 检测方法在2024医师在线杂志 第3期-拼.indd 172024医师在线杂志 第3期-拼.indd 172024/3/18 15:58:332024/3/18 15:58:33182024,14(3)医师在线 第 14 卷 第 3 期论著宫颈癌筛查中的效能，为临床合理选择 Hr-HPV 的检测方法提供参考依据。1 资料与方法1.1 一般资料选取 2017 年 8 月 2022 年 2 月在大连市妇女儿童医疗中心（集团）春柳院区宫颈疾病诊疗中心进行宫颈 TCT 检查，同时接受 DH3 HPV-DNA 方法及 Aptima HPV E6/E7 mRNA 方法进行Hr-HPV感染筛查的590例检查者为研究对象，最终7例失访，实际入组病例为 583 例，年龄 22 65 岁。排除标准：就诊前有子宫切除史、妊娠患者、盆腔脏器恶性肿瘤或其他严重疾病史。所有入组者均签署知情同意书，本研究经过大连市妇女儿童医疗中心（集团）伦理委员会批准。1.2 方法（1）取材：受试者采样前至少 48 h 内没有性生活、未进行阴道冲洗、阴道上药及经阴道的妇科检查、避开月经期进行取样。三种检测均使用专用采样器，先将采样器置于宫颈口，再顺时针旋转 3 5 圈采样。（2）TCT 检查：取样后将取样刷放入新柏氏专用保存液瓶中，反复将取样刷推至瓶底 10 次，然后用力旋转取样刷，使采集到的细胞尽可能地释放到保存液中，由病理科医生进行细胞病理学检查。TCT 结果参照 2014 TBS（The Bethesda System）（第三版）诊断标准分为：NILM（Negative for intraepithelial lesion or malignancy，无上皮内病变或恶性病变）、ASCUS（Atypical squamous cells of undetermined significance，不能明确意义的非典型鳞状上皮细胞）、ASC-H（Atypical squamous cells，cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，不能排除高度鳞状上皮内病变的非典型鳞状上皮细胞）、LSIL（Low-grade squamous intraepithelial lesion，低度鳞状上皮内病变）、HSIL（High-grade squamous intraepithelial lesion、高度鳞状上皮内病变）、AGC（Atypical gladular cells，非典型腺细胞）、AIS（Adenocarcinoma in situ，原位腺癌）、SCC（Squamous cell carcinoma，鳞状细胞癌）、ADCA（Adenocarcinoma，腺癌）。根据“2017ASCCP 阴道镜检查标准：基于风险的阴道镜实践”3，将 TCT 结果分为低风险和高风险，其中低风险结果包括：NILM、ASCUS 和 LSIL，高风险结果包括 ASC-H、HSIL 和 AGC。本研究将 TCT 结果分三类进行分析：LSIL 及LSIL-（包括 ASCUS、NILM）、ASC-H/HSIL 和 AGC。（3）Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测：与 TCT 使用同一份宫颈细胞保存液，按照Aptima样本转移试剂盒内的说明书所述，将 1 ml 经全自动细胞检测检测系统（ThinPrep 2000）处理之前或以后的细胞学样本转移入 Aptima 样本转移管内。使用全自动核酸检测系统（Panther System）进行检测，检测试剂盒的临界值设定为 0.50 S/CO，超过这个数值则判断为阳性。本检测方法定性检测 14 种型别 HPV 的 E6/E7 mRNA，14 种型别包括 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和 68 型。如检测阳性，则继续检测是否存在 HPV16、18/45 型感染，其余11 种不分型。（4）DH3 HPV-DNA 检测：取样后将刷头放入装有保存液的小瓶中。采用杂交捕获-化学发光法，使用全长 RNA 探针针对HPV全基因组进行检测。Cut-off值1.0 pg/ml判断为阳性。本检测方法可检测 14 种高危型 HPV，包括 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和 68 型，自动分出 HPV16/18 型感染，其余 12 种不分型，但均提示病毒载量相对值。（5）阴道镜检查：采用光电一体阴道镜（Leisegang），由高年资专职阴道镜医生进行操作，根据醋酸及碘试验结果在异常区域多点活检，必要时进行宫颈管搔刮（Endocervical curettage，ECC）。以组织病理学诊断作为宫颈病变诊断的金标准。若阴道镜检查未见明显高级别病变，且阴道镜评估满意，则定义为组织病理学正常。（6）组织病理学检查：均由本院经验丰富的病理医生承担。组织学阅片由两位病理医生一起阅片，当诊断出现困难时，可加做 P16 及 Ki67 免疫组化协助诊断。组织病理学结果归为三类：LSIL 及 LSIL-、HSIL 和宫颈癌。其中 HSIL 包括宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN）2 级、CIN 3 级、阴道上皮内瘤变（Vaginal intraepithelial neoplasia，VaIN）2级、VaIN 3 级、外阴上皮内瘤变（Vuval Intraepithelial neoplasia，VIN）2 级、VIN 3 级及宫颈 AIS。如果不同部位有不同的病理诊断级别，以级别最高者作为最后诊断。1.3 统计学分析采用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，计数资料以例数和率例（%）表示，组间比较采用2检验；当出现任一格子理论频数 5 的时候，采用连续性校正2检验。检测一致性采用Kappa检验，Kappa值0.4，表示一致性差；0.4Kappa值 0.75，表示一致性一般；如果 Kappa 值 0.75，表示一致性较好。P 0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 两组一般资料比较583 例 受 检 者 中 DH3 HPV-DNA 检 测 阳 性 率 为 50.1%（292/583）、Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测阳性率为 60.7%（354/583），两者阳性率比较，差异具有统计学意义（2=13.343，2024医师在线杂志 第3期-拼.indd 182024医师在线杂志 第3期-拼.indd 182024/3/18 15:58:332024/3/18 15:58:33192024,14(3)医师在线 第 14 卷 第 3 期论著P 0.001）。本研究中，Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测漏诊 HSIL 病变2 例、DH3 HPV-DNA 检测漏诊 HSIL 病变 7 例，组织病理学诊断均为 CIN 2 级病变，没有 CIN 3 级及宫颈癌漏诊。漏诊病例的TCT 结果分析见表 1。此外，在经组织病理学确诊的病例中，合并 VaIN 者 28 例、合并 VIN 者 5 例。2.2 不同 TBS 分级受检者 DH3 HPV-DNA 和 Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测阳性率比较随着TBS分级的升级，两种HPV检测方法的阳性率均升高。在低风险（LSIL 及 LSIL-）细胞学筛查结果中，两者阳性率比较，差异具有统计学意义（P=0.001）；在细胞学筛查结果为高风险（ASC-H/HSIL）和 AGC 中，两者阳性率比较，差异无统计学意义（P 0.001）。详见表 2。2.3 不同级别组织病理学结果 DH3 HPV-DNA 和 Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测阳性率比较随着组织病理学病变级别的加重，两种 HPV 检测方法的阳性率均升高。在 LSIL 及 LSIL-，两者阳性率比较，差异具有统计学意义（P0.001），而在HSIL及宫颈癌中，两者阳性率比较，差异无统计学意义（P 0.001）。详见表 3。2.4 两种 HPV 检测方法诊断 HPV 的效能比较Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测 HPV 的灵敏度和阴性预测值均高于 DH3 HPV-DNA 检测方法，但差异无统计学意义（P0.05）。DH3 HPV-DNA 检测 HPV 的特异度高于 Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测方法，差异具有统计学意义（P 0.001）。详见表 4。2.5 两种 HPV 检测结果的一致性分析两种 HPV 检测结果均为阳性的患者共 270 例，均为阴性的患者共207例，总一致率为81.8%（477/583），Kappa值为0.636，说明两种 HPV 检测方法一致性尚好。结果见表 5。3 讨论宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率，早发现、早诊断、早治疗至关重要。Hr-HPV 的持续感染是宫颈癌的主要致病因素4，也是宫颈癌筛查中重要的检测组成。对于初筛人群，追求高灵敏度及阴性预测值，以减少漏诊率及保证发现尽量多的 CIN 2 级患者；对于转诊人群，追求表 1 两种检测方法漏诊 HSIL 病变的 TCT 结果分析（例）检测方法ASCUSLSILASC-HHSILAGCDH3 HPV-DNA21211Aptima HPV E6/E7 RNA1-1-表 2 不同 TBS 分级两种 HPV 检测方法阳性率比较 例（%）TBS 分级DH3 HPV-DNA检测阳性Aptima HPV E6/E7 mRNA检测阳性2值P值LSIL 及 LSIL-（n=486）218（44.9）269（55.3）10.7040.001ASC-H/HSIL（n=85）70（82.4）78（91.8）3.3420.068AGC（n=12）4（33.3）7（58.3）1.5100.219表 3 不同组织病理学病变级别两种 HPV 检测方法阳性率比较 例（%）病变级别DH3 HPV-DNA检测阳性Aptima HPV E6/E7 mRNA检测阳性2值P值LSIL 及 LSIL-（n=448）164（36.6）221（49.3）14.797 0.001HSIL（n=132）125（94.7）130（98.5）1.8410.175宫颈癌（n=3）3（100.0）3（100.0）表 4 两种 HPV 检测方法诊断效能比较检查方法组织病理检查(例）合计(例）灵敏度（%）特异度（%）阳性预测值（%）阴性预测值（%）阳性阴性DH3 HPV-DNA(例）94.863.443.897.6阳性128164292阴性7284291合计135448583Aptima HPV E6/E7 mRNA(例）98.550.737.699.1阳性133221354阴性2227229合计1354485832值1.83914.7972.6080.983P值0.175 0.0010.1060.322表 5 两种检测结果的一致性分析DH3 HPV-DNA 检测Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测合计阳性阴性阳性27022292阴性84207291合计3542295832024医师在线杂志 第3期-拼.indd 192024医师在线杂志 第3期-拼.indd 192024/3/18 15:58:332024/3/18 15:58:33202024,14(3)医师在线 第 14 卷 第 3 期论著高的特异度及阳性预测值，以减少漏诊率及减少转诊至阴道镜活检的患者数量5。HPV 是由个 8 000 碱基对组成的双链小 DNA 病毒，HPV基因组分为三个区域：上游调控区（URR）、早期区（E1E8）、晚期区（L1 L2）。有研究发现，发生宫颈癌前病变时，HPV病毒基因组在E1和E2区之间断裂，导致E1下游的部分区域缺失，包括 L1、L2、E2、E4 和 E5 区，同时 E6、E7 基因作为 HPV病毒的致癌基因，它们的转录 mRNA 所表达的蛋白是导致宫颈癌的关键因素，基因编码产物 E6、E7 蛋白联合发挥作用，可抑制 P53 蛋白功能，从而抑制细胞凋亡，E7 蛋白还可通过抑制视网膜母细胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein，pRb）使细胞周期失控，使细胞无限增殖，从而发生癌变6。理论上分析，检测HPV mRNA 比检测 DNA 具有更高的特异度。Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测技术采用转录介导的扩增技术（TMA 技术），以 E6/E7 mRNA 为检测目标，与传统检测DNA 的 HPV 试剂相比，Aptima HPV E6/E7 mRNA 检测具有相同的灵敏度和更高的特异度。且研究发现 Aptima E6/E7 mRNA的表达与宫颈病变程度呈正相关7。Oliveira 等8 在普通人群中比较 E6/E7 mRNA 和杂交捕获二代（HC2）两种检测方法，显示前者灵敏度明显低于后者，而特异度远高于后者。本 研 究 中，Aptima HPV E6/E7 mRNA 检 测 HPV 的 灵敏度和特异度分别为 98.5%和 50.7%，DH3 HPV-DNA 检测HPV 的灵敏度和特异度分别为 94.8%和 63.4%，两者相比，灵敏度相当，DH3 HPV-DNA 检测的特异度更高，差异具有统计学意义，与国内外大部分研究结果不符，而与 Shen 等9 的研究结果相似。通常认为，组织病理学确诊的 LSIL 是 HPV 游离感染状态的表现，只有以整合形式存在于宿主细胞内时，才会大量转录E6/E7 mRNA 并生成 E6/E7 癌蛋白，引起真正的癌前病变和宫颈癌。但在本研究中，无论是低风险的细胞学筛查 LSIL-的结果，还是组织病理学确诊的 LSIL-的研究显示，Aptima E6/E7 mRNA检测的阳性率均高于 DH3 HPV-DNA 检测，差异具有统计学意义（P 0.001），与理论研究不符，这其中的原因还有待于更大量的研究去探讨和论证。本研究有漏诊 HSIL 的病例，如果结合 TCT 检测可以明显减少漏诊病例。根据本研究的结果发现，两种 HPV 检测方法检测进行宫颈癌筛查的效能相当，临床工作中要科学对待 Aptima E6/E7 mRNA 的阳性结果，避免过度解读。还要结合 TCT 检查结果、患者既往宫颈癌筛查史及既往宫颈 HPV 感染相关病变手术史，适时转诊阴道镜，避免过度转诊及避免漏诊。本研究也有一定的局限性：本研究样本量较小，可能需要方法规范、质控严格的多中心、大样本研究才能得出更有力的结论。本研究的对象是宫颈门诊筛查及复诊的人群，HPV 阳性率相对普通人群可能会有一定程度的升高。总之，我国 HPV 检测方法及产品厂家众多，这使得临床医生在面对 HPV 检测的选择及检测结果上充满了困惑，如何更加规范 HPV 检测技术，也许是我们今后需要面临的重大挑战。参考文献1王临虹,赵更力.子宫颈癌综合防控指南(第2版)M.北京:人民卫生出版社:1-2.2WHO.WHO guideline for screening and treatment of cervical pre-cancer lesions for cervical cancer prevention(Second edition)EB/OL.(2021-6-6)2022-11-22.https:/www.who.int/publications/i/item/9789240030824.3Wentzensen N,Schiffman M,Silver MI,et al.ASCCP Colposcopy Standards:Risk-Based Colposcopy PracticeJ.J Low Genit Tract Dis,2017,21(4):230-234.4吴永茂,吴季兰,练惠织,等.HPV癌基因E6/E7 mRNA在宫颈癌及癌前病变诊断中的临床价值J.中国妇幼保健,2020,35(2):349-351.5吕江涛,周德平,杨君等.两种HPV检测方法在宫颈癌筛查中准确性比较的Meta分析J.现代妇产科进展,2017,26(2):91-95.6张生枝,邵华江,马建婷.人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA与宫颈病变关系的研究进展J.上海交通大学学报(医学版),2014,34(5):754-758.7张魏芳.高危型人乳头瘤病毒早期蛋白E6和E7调控细胞周期的机制研究D.山东:山东大学,2010.8Oliveira A,Verdasca N,Pista.Use of the NucliSENS EasyQ HPV assay in the management of cervical intraepithelial neoplasiaJ.J Med Virol,2013,85(7):1235-1241.9Shen Y,Gong J,He Y,et al.Quantivirus HPV E6/E7 RNA 3.0 assay(bDNA)is as sensitive,but less specific than Hybrid Capture 2 testJ.J Virol Methods,2013,187(2):288-293.2024医师在线杂志 第3期-拼.indd 202024医师在线杂志 第3期-拼.indd 202024/3/18 15:58:332024/3/18 15:58:33