定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究本科论文.doc

天津科技大学研究生学位论文
(申请硕士学位)

定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究
STUDY ON DIRECTELY TANSFORM SACCHAROMYCES CEREVISIAE FOR ACCUMULATE PYRUVIC ACID

专业名称：发酵工程
指导教师：高年发 教授
研究生姓名：邓旭衡
申请学位级别：工学硕士
论文提交日期：2011年1月

分类号：Q751 学校代码：10057
密级：（秘密、机密、绝密 研究生学号：08809005

定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究
Study on Directly Transform Saccharomyces Cerevisiae for Accumulate Pyruvic Acid

专业名称：发酵工程
指导教师姓名：高年发 教授
研究生姓名：邓旭衡
申请学位级别：工学硕士
论文提交日期：2011年1月
论文课题来源：自选
学位授予单位：天津科技大学

天 津 科 技 大 学
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摘 要
丙酮酸是一种重要的有机酸，它广泛地应用于化工原料、药物及农用化学试剂的生产和研究中。目前生产丙酮酸的方法主要有化学合成法、生物催化法和生物发酵法。化学合成法、酶催化法合成具有原料难得、结构复杂、成本较高，不适于大规模生产，而且合成的丙酮酸酸多为外消旋混合物等缺点，因此利用微生物法合成丙酮酸酸成为发展趋势。发酵法生产丙酮酸的主要研究思路和目标是：（1）减少丙酮酸的进一步降解及转化；（2）加快发酵底物葡萄糖的酵解速度，提高生产强度。
酿酒酵母作为一种研究和应用最为广泛的真核微生物，发酵生产乙醇具有极好的优势。在厌氧条件和溢出代谢情况下，经糖酵解生成的丙酮酸几乎全部或大部分流向生产乙醇的支路，从而产生乙醇的积累；同时酵母细胞具有较高的耐受性，可以积累较高浓度的乙醇。通过合理利用产乙醇的代谢流向，将乙醇的代谢流引向丙酮酸的积累，为丙酮酸的生产提供了新的思路。本论文就是研究定向阻断酿酒酵母丙酮酸的进一步代谢，从而积累丙酮酸。
以菌株S. cerevisiae Y2为出发菌株，把pdc1基因敲除片段用电穿孔转化法转化到出发菌株S. cerevisiae Y2中，在含G418抗性的YEPD平板上筛选转化子，通过PCR验证得到pdc1基因的敲除菌株S. cerevisiae Y21△。然后把pdc5基因敲除菌株敲除片段用醋酸锂转化法转入到S. cerevisiae Y21△中，在YNBG平板上筛选转化子，通过PCR验证得到pdc1和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y21△5△。然后用southern blot进一步验证S. cerevisiae Y2 pdc1和pdc5基因的缺失。为比较丙酮酸脱羧酶基因敲除后酶活的变化，分别测定S. cerevisiae Y2，S. cerevisiae Y21△和S. cerevisiae Y21△5△的丙酮酸脱羧酶的活性，结果发现S. cerevisiae Y21△和S. cerevisiae Y21△5△的丙酮酸脱羧酶的活性较S. cerevisiae Y2分别减少了31%和98%。
对基因敲除菌株和出发菌株进行简单发酵实验，结果发现丙酮酸的产量有显著提高，S. cerevisiae Y2，S.cerevisiae Y21△和S. cerevisiae Y21△5△的发酵120h的丙酮酸产量分别为1.24g/L、2.894g/L、9.264g/L。为进一步提高S. cerevisiae Y21△5△的丙酮酸产量，对其种子培养基、发酵培养基和发酵条件进行了优化，优化后种子培养基为（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨10，酵母粉5，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，醋酸钠2，玉米浆0.5%，pH 5.6；优化后发酵培养基为（g/L）：葡萄糖80，蛋白胨20，酵母粉10，醋酸钠2.5，玉米浆1%， KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，金属离子母液5mL，pH5.6；最佳发酵条件为：种龄26h、接种量12%、装液量70mL/250mL三角瓶，发酵96h。S. cerevisiae Y21△5△在最佳发酵条件下丙酮酸的积累量为24.85g/L，比优化前提高168%。
关键词：丙酮酸；基因敲除；酿酒酵母；代谢工程；丙酮酸脱羧酶

ABSTRACT
Pyruvic acid is an important organic acid, which widely used in production and research of chemical raw materials, pharmaceutical and agricultural chemical reagents medicin and agrochemicals. Currently, the methods for product pyruvic acid include chemical synthesis, biocatalysis and biological fermentation. However, the common chemical synthesis and enzymatic synthesis are not suitable for mass production of pyruvic acid because they thave many shortcomings: the raw materials are rare, complex, costly and the products always is a racemic mixture, so the use of microbial synthesis of pyruvic acid is a trend. The main ideas and objectives of fermentative production of pyruvic acid are: (1) to reduce the further degradation and conversion of pyruvate; (2) To accelerate the glycolysis rate of fermentation substrate: glucose, increase production intensity.
Saccharomyces cerevisiae is the most thoroughly investigated and the most widely used eukaryotic microorganism, which has excellent advantages for fermentation production of ethanol. In anaerobic conditions and overflow metabolism, the pyruvate generated by glycolysis almost all or most of the slip flow to produce ethanol, resultied in the accumulation of ethanol; while yeast cells have a high tolerance on ethanol so it can be accumulated to a higher concentration. Through correct design of the flow of ethanol metabolism, change alcohol metabolism flow toward to the accumulation of pyruvate provides a new way for producr pyruvate. This paper is to study the directional blocking further metabolism of pyruvate in S. cerevisiae to accumulate pyruvate.
The pdc1 knockout fragment was transformed into S. cerevisiae Y2 by using electroporation, transformants were screened on YEPD plates containing G418 resistant and were validated by PCR to get the pdc1 gene disrupted strain S. cerevisiae Y21△. Then the pdc5 gene knockout fragment was transformed into the Y21△ by lithium acetate, transformants were screened on YNBG plates and were validated by PCR to get the S. cerevisiae Y21△5△ with both pdc1 and pdc5 gene disrupted. The dispruption of pdc1 and pdc5 gene were further validated by southern blot. To compare the changes of pyruvate decarboxylase activity in gene knockout, the PDC activity of S. cerevisiae Y2, Y21△ and Y21△5△ were measured. The resilts showed the PDC activity of S. cerevisiae Y21△ and Y21△5△ were respectively reduced by 31% and 98% compared to S. cerevisiae Y2.
Throgh the simple fermentation we found the yield of pyruvic acid of S. cerevisiae Y2, Y21△and Y21△5△ is 1.24g/L, 2.894g/L, 9.264g/L in 120h, respectively. To further enhance the pyruvate production of S. cerevisiae Y21△5△, the seed medium, fermentation medium and conditions were optimized. The optimal seed medium is (g/L): glucose 30, peptone 10, yeast extract 5, KH2PO4 1, MgSO4·7H2O 0.5, sodium acetate 2, corn steep liquor 0.5%, pH 5.6; the optimal fermentation medium is (g/L): glucose 80, peptone 20, yeast extract 10, sodium acetate 2.5, corn steep liquor 1%, KH2PO4 1, MgSO4·7H2O 0.5, metal ions liquor 5mL, pH5.6; the optimal culture conditions is: seed age 26h, 12% inoculum, medium volume 70mL/250mL flask, culture for 96h. In the end, S. cerevisiae Y21△5△ accumulated 24.85g/L pyruvate at the optical condition, which increased by 168% compared to the condition before optimization.
Key words: pyruvic acid, gene knockout, Saccharomyces cerevisiae, matabolic enginerring, pdc gene

目 录
1 前 言..………………………………………………………………………………… ..………..1
1.1 丙酮酸简介………………………………………………………………………………….1
1.2 丙酮酸(盐)及其衍生物的应用……………………………………………………………1
1.2.1 在化工制药领域 …………………………………………………………...1
1.2.2 在食品保健领域 …………………………………………………………...1
1.2.3 其他方面的应用………………………………………………………….…2
1.3 丙酮酸（盐）的生产方法 ………………………………………………….……2
1.3.1 化学催化合成法 …………………………………………………………...2
1.3.2 生物催化法 …………………………………………………………….…..2
1.3.3 微生物发酵法 ……………………………………………………………...3
1.4 发酵法生产丙酮酸研究现状及发展趋势 ……………………………………….4
1.5酿酒酵母代谢 ……………………………………………………………………..6
1.5.1酿酒酵母……………………………………………………………….…… 6
1.5.2酿酒酵母菌株改造……………………………………………………….… 7
1.5.3酿酒酵母的葡萄糖代谢 …………………………………………………....9
1.5.4酿酒酵母的丙酮酸代谢 ……………………………………………….….12
1.5.5 调节丙酮酸代谢节点上的代谢流量 ……………………………….……15
1.6 酿酒酵母生产丙酮酸可行性分析 ……………………………………………...16
1.7 基因敲除 ………………………………………………………………………...16
1.8本课题立题依据及研究内容 ……………………………………………………17
1.8.1立题依据 ……………………………………………………………….….17
1.8.2主要研究内容 ……………………………………………………….…….18
2 材料与方法 ………………………………………………………………………...…19
2.1 实验材料 ………………………………………………………………………...19
2.1.1 菌种和质粒 ………………………………………………………….……19
2.1.2 主要试剂 ………………………………………………………….………19
2.1.4 培养基和溶液 ……………………………………………………….……21
2.2分析方法 …………………………………………………………………………23
2.2.1酿酒酵母细胞浓度测定 …………………………………………….…….23
2.2.2丙酮酸含量测定 ……………………………………………………….….23
2.2.3葡萄糖浓度测定 ………………………………………………………….23
2.3实验方法 …………………………………………………………………………23
2.3.1酿酒酵母生长曲线的绘制 …………………………………………….….23
2.3.2大肠杆菌质粒提取 …………………………………………………….….23
2.3.3质粒NotⅠ酶切 …………………………………………………………..24
2.3.4酶切片段回收 …………………………………………………………….24
2.3.5酿酒酵母的转化 ………………………………………………………….24
2.3.6酿酒酵母基因组提取 …………………………………………………….25
2.3.7酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活性测定 ……………………………………….25
2.3.8 Southern blot …………………………………………………………….…25
2.3.9引物合成和PCR扩增 ……………………………………………………26
2.3.10酿酒酵母的培养方法 ……………………………………………….…...30
3结果与讨论 ………………………………………………………………………...…...31
3.1酿酒酵母Y2 的pdc1基因的敲除 ………………………………………………31
3.1.1酿酒酵母Y2生长曲线的测定 ……………………………………………31
3.1.2电击穿孔法转化酿酒酵母Y2 ………………………………………….….31
3.1.3酿酒酵母转化子Y21△的筛选与鉴定 ……………………………….……32
3.1.4转化子遗传稳定性 …………………………………………………….….33
3.2酿酒酵母Y21△的pdc5基因的敲除 ……………………………………………..33
3.2.1醋酸锂转化法转化酿酒酵母Y21△ …………………………………….…33
3.2.2酿酒酵母转化子Y21△5△的筛选和验证 …………….…………………..33
3.2.3转化子遗传稳定性 ………………………………………………….…….35
3.3 酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活力测定 ……………………………………………...36
3.3.1蛋白质浓度标准曲线 ……………………………………………….…….36
3.3.2酿酒酵母Y2，Y21△，和Y21△5△丙酮酸脱羧酶活性比较 ………….…..36
3.4 Southern blot 验证酿酒酵母基因敲除菌株 ……………………………………37
3.4.1酿酒酵母基因组酶切 …………………………………………….……….37
3.4.2探针的标记 ………………………………………………………….…….37
3.4.3杂交和检测 ……………………………………………………….……….38
3.5酿酒酵母发酵产酸实验 …………………………………………………………39
3.5.1丙酮酸测定 ………………………………………………………….…….39
3.5.2摇瓶产酸实验 ……………………………………………………….…….41
3.6 酿酒酵母Y21△5△丙酮酸发酵的优化 ………………………..………………..42
3.6.1 Y21△5△生长曲线的绘制 ………………..……………………….……….42
3.6.2种子培养基的优化 …………………………………………….………….43
3.6.3发酵培养基的优化 …………………………………………….………….44
3.6.4发酵条件的优化 …………………………………………….…………….50
4 结 论 …………………………………………………………….………………..…54
5 展 望 …………………………………………………………………………...……55
6 参考文献 …………………………………………………………………………...…56
7 攻读硕士学位期间发表论文情况 ……………………………………………………64
8 致 谢 …………………………………………………………………………..……65

III

天津科技大学硕士学位论文
1 前 言
1.1 丙酮酸简介
丙酮酸[1]（pyruvic acid）,又名2-氧代丙酸(2-oxopropanoic acid)、α-酮基丙酸(a-ketopropionic acid)或乙酰甲酸，化学结构式为:CH3COCOOH，分子量:85.06，为无色至浅黄色粘稠状透明液体，有乙酸的气味，沸点为165℃(分解)，易溶于水，与乙醇、乙醚等混溶，丙酮酸很不稳定，暴露于空气中颜色变暗，加热时缓慢聚合，易与卤化物、醛类、氮化物等发生反应，而且极易氧化，弱的氧化剂如Fe2+、H2O2都能将丙酮酸氧化成乙酸并放出CO2。丙酮酸除具有羧酸和酮的性质外，还具有α-酮酸的性质，丙酮酸是最简单的α-酮酸，属于羧基酸。
丙酮酸是一种很弱的有机酸，天然存在于薄荷和蔗糖发酵液中，为生物体内葡萄糖分解代谢的中间产物，它连接着糖酵解、三羧酸循环、发酵产酸产醇、糖原异生、转氨作用等一系列重要的代谢途径，是细胞代谢过程中关键的具有枢纽性地位的中间物质。许多代谢途径可以通过丙酮酸这一共同的中间产物而联系起来。
1.2 丙酮酸(盐)及其衍生物的应用
丙酮酸，由于它同时含有羧基和酮基，属α-酮酸，因而反应性强，可参与多种化学反应，在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。近年来丙酮酸的开发应用己成为国内外研究的热点，因此新的用途不断被开发出来。
1.2.1 在化工制药领域
丙酮酸及其盐是一类重要的有机化工中间体，在有机合成工业中有广泛的应用，用于酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴；合成L-半胱氨酸、L-亮氨酸、维生素B6和B12等[2]，丙酮酸乙酯在构成杂环化合物方面性能优越，是农药合成中难以取代的原料和中间体，它被广泛应用于杀菌剂和除草剂的合成，是合成乙烯系聚合物、氢化阿托品酸、谷物保护剂等多种农药的起始原料[3]。
1.2.2 在食品保健领域
GB2760-1996规定丙酮酸为酸味添加剂，具有很好的防腐保鲜功能，可应用于食品及酿酒工业，目前国内少量用于饲料和果酒的保存中。近年来丙酮酸钙的减肥作用被人们发现，继而其作用研究越来越热。其减肥的作用机理主要包括三个方面：①细胞内的各种物质的循环利用；②Na+-K+-ATP酶的活性运输作用；③交感神经系统表现兴奋性，加速脂肪酸代谢[4]。丙酮酸钙有效减肥的同时，它也是一种良好的钙补充剂，含钙量约为20%。它进入人体后，在胃里生成丙酮酸和游离Ca2+，均极易被吸收，丙酮酸直接进入细胞有机代谢，不会增加肝肾的负担，不影响机体对蛋白质的贮存。Hollemam等研究发现丙酮酸及丙酮酸乙酯具有抗氧化作用，可以减少氧自由基的产生，是有效的活性氧清除剂[5]。丙酮酸乙酯能够通过降低细胞内还原性谷胱甘肽水平来介导抗炎[6]。
1.2.3 其他方面的应用
丙酮酸是测定伯醇及仲醇的重要试剂，是脂肪族胺的显色剂等，它还广泛应用于生物技术诊断试剂、检测试剂。在细胞培养方面，丙酮酸与乳酸组成抗氧化剂，降低对细胞的伤害；而且它自身是动物细胞培养的重要底物。丙酮酸也可以用在传感器方面，与乳酸锂构成人工胰脏，作为体外传感器测定葡萄糖的含量。
1.3 丙酮酸（盐）的生产方法
丙酮酸作为一种化工产品，早已实现了工业化生产，丙酮酸的生产方法主要有化学催化合成法、生物催化法和微生物发酵法。
1.3.1 化学催化合成法
工业生产中主要应用的有两种：酒石酸法和乳酸(盐)催化氧化法。
1.3.1.1 酒石酸法
Howard and Frasert[7]于1932年开发，沿用至今；该法采用酒石酸与焦硫酸钾混合加热，酒石酸脱水脱羧生成丙酮酸。该工艺操作简单，但是存在着产率低，环境污染严重，生产成本高等问题，缺乏竞争力。为此，在很长一段时间内，丙酮酸的价格居高不下，应用也受到限制。以丙酮酸在食品工业中的应用为例，尽管它是一种很有潜力的酸味剂，但由于其在价格上与其它有机酸相比过于昂贵。因此，几乎没有厂家愿意在饮料或食品中添加丙酮酸来改善风味。因而限制了丙酮酸的生产规模的扩大。目前北京化工厂和上海试剂一厂均采用此法生产丙酮酸。
1.3.1.2 乳酸(盐)催化氧化法[8] [9]
用乳酸作原料氧化脱氢一步法生产丙酮酸是最理想的，这也是目前研究的方向。其反应式为：
CH3CHOHCOOH+1/2O2→CH3COCOOH+H2O(1)
但是从乳酸直接制取丙酮酸非常困难，这是因为在一般情况下，乳酸中C-C键断裂形成乙醛和二氧化碳比氧化脱氢形成丙酮酸要容易得多，其反应式为：
CH3CHOHCOOH+l/2O2→CH3CHO+CO2+H2O(2)
因此选择合适的催化剂成为人们研究的重点。以Pb/Pd/C体系[10]作催化剂，产率和选择性较为理想，成本不高，已逐渐为国内外越来越多的企业所采用。
1.3.2 生物催化法
生物催化法转化生成丙酮酸主要包括两种类型：酶法转化和全细胞催化。酶法生产所涉及到的酶都是与丙酮酸代谢有关的酶，如：酒石酸脱水酶、甲醛脱氢酶、过氧化酶和乙醇酸氧化酶、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶等。可用于酶法生产丙酮酸的底物有乳酸、酒石酸、富马酸等。酶法生产丙酮酸具有反应混合物组成简单，底物转化率较高，后续分离提取费用低和操作简单等优点，因此成为近几年来丙酮酸生产研究的热点。休止细胞法是先培养微生物，收集细胞，利用微生物细胞内的一系列酶(如EMP途径酶系)完成由底物(如葡萄糖)生产丙酮酸的过程。完整细胞酶法是利用微生物中某一特定功能的酶完成由底物向丙酮酸的转化。相比较酶催化法，全细胞催化是利用培养基质中的细胞体消耗底物合成丙酮酸，底物除了某些细胞特殊要求外，大多数底物如葡萄糖、甘油、延胡索酸、1,2-丙二醇等都可以用来生产丙酮酸。Cooper[11]描述了利用醋酸杆菌 (Acetobacter sp.)将D-乳酸氧化制备丙酮酸，转化率虽然很高但D-乳酸价格昂贵，实现工业化有困难。
相对化学合成来说，酶或细胞的固定化有许多优势，如培养基质的成分简单、下游处理相对简单等，但在工业应用中仍存在许多问题，比如说，酶法转化中需要使用昂贵的电子受体，这使其广泛应用受到了极大限制。休止细胞法中固定化细胞的重复利用问题就是限制它广泛应用的关键因素。
1.3.3 微生物发酵法
发酵法生产丙酮酸研究已有50年历史。然而，由于丙酮酸高产菌株选育十分困难，尽管有一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量(质量浓度)无法达到工业化的要求。发酵法生产丙酮酸真正取得突破，是在1988年。当时，日本东丽工业株式会社(Toray Industries lnc.)的研究人员宫田令子(Miyata Reiko)和米原辙(Yonehara Tetsu)选育出一系列丙酮酸产量超过50g/L的球拟酵母(Torulopsis)菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能[12]。1992年，日本开始采用发酵法生产丙酮酸，产量为400吨/年，成本约为2~3万元/吨。丙酮酸是机体代谢的中间产物，既是处于糖酵解(EMP) 途径的末端，又是连接EMP途径和TCA循环的关键产物，它可经多条途径生成乙醇、乳酸、草酰乙酸、丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸等。因此其所处的位置极为特殊。根据代谢控制育种和发酵原理，要想在生物体内大量积累丙酮酸，就必须进一步切断或更确切地说是
图1-1 丙酮酸的代谢途径及发酵机制
Fig.1-1 The metabolic pathway and fermentation mechanism of pyruvate
减弱丙酮酸的进一步代谢支路，加速丙酮酸的合成速度，去除代谢产物的反馈阻遏或反馈抑制(图1-1)。发酵法生产丙酮酸的微生物主要包括酵母、放线菌和细菌等。相对于化学合成法和生物催化法来说，微生物法发酵具有独特的优势: 原料来源广泛、能耗低、污染小等，而且生物发酵方法生产的丙酮酸，具有能被生物膜识别的左旋结构的光学活性，在生物医药、减肥方面利用性更强。因此发酵法生产丙酮酸研究相对较热。
1.4 发酵法生产丙酮酸研究现状及发展趋势
丙酮酸发酵的研究起始于二十世纪五十年代，六十年来人们一直在寻找产丙酮酸的最佳菌株。资料显示能够直接产生丙酮酸的菌种主要有以下各属：①细菌及放线菌：Acinetobacter(不动杆菌属)[13]，Schizophyllum(裂褶菌属)[14]，Enterobacter(肠杆菌属)[15]，Enterococcus，Escherichia(埃希氏菌属)[16]，Pseudomonas(假单胞菌)[17]；②酵母菌：Debaryomyces(德巴利酵母属)[18]，Candida(假丝酵母属)[19]，Saccharomyces(酵母属) [20] 和Torulopsis(球拟酵母属)[21]等。但作为生产菌应具备：① 能大量积累丙酮酸并分泌到胞外；②生长迅速；③较强的廉价碳源利用能力和较高的转化率；④对人畜安全。目前，发酵法生产丙酮酸的问题是转化率比较低，这是因为丙酮酸作为糖酵解途径的最终产物，处于代谢途径中的关键代谢支点，在细胞中很容易转化为其它产物，难以积累。只有切断或弱化丙酮酸的进一步代谢，才能达到使其在细胞中积累并分泌到胞外的目的。
Yokota等采用转导的方法，将经体外诱变的F1-ATP酶基因转入一株产丙酮酸的大肠杆菌K-12品系的突变株E coli. W1485Lip2中，从而抑制ATP的产生。转导后的突变株TBLA-1产酸较亲株提高。
2000年袁辉等[22]用3-氟代丙酮酸梯度平板初步确定100μg/L和1000μg/L为3-氟代丙酮酸敏感型敏感浓度。用此浓度筛选出的敏感型突变株进行丙酮酸发酵，结果丙酮酸的产量分别提高了32%和44.8%。
2004年刘立明[23]提出一种基于途径分析提高丙酮酸产量的育种策略，通过亚硝基胍诱变，获得1株乙酸需求型突变株CCTCCM 202019，在外加乙酸的培养基中表现出高于出发株21%的丙酮酸生产能力和良好的遗传稳定性。检测突变株CCTCCN 202019中丙酮酸代谢相关酶的活性发现：① 丙酮酸脱羧酶活性降低了40%；② 外加乙酸与否的条件下，乙酰辅酶A合成酶的活性分别提高了103.5% 和57.4%：③添加乙酸和突变对丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶系、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性没有显著影响。
2004年刘立明、陈坚等[24]将光滑球拟酵母CCTCC M202019经溴化乙锭诱变，挑选假阳性呼吸缺陷型菌株共40株。对其中7株丙酮酸产量提高的突变株进行发酵性底物（葡萄糖）和非发酵性底物(甘油、乙酸)的利用能力测试，鉴定得到3株呼吸缺陷型突变株RD-16、RD-17和RD-18。相对于出发菌株，呼吸缺陷型突变株生长速率下降，最终菌体浓度降低21%~29%，胞内ATP含量下降15%~21%，但单位细胞耗葡萄糖能力和单位细胞产丙酮酸能力分别提高了20.7%~30.7%和30.7%~55.5%。为使酵解产生的NADH正常氧化，在RD-18菌株的对数生长期流加2.1mmol/L外源电子受体乙醛。发现细胞合成丙酮酸能力提高21.6%，且葡萄糖消耗速度明显加快，发酵周期缩短14h。
Miyata[25]研究发现几乎所有的供试酵母菌中大量积累丙酮酸的都必须是某种或某些维生素的缺陷型，如T.glabrata IF0005 (NA-,BI-,B6-,Bio-)， 在初始葡萄糖浓度为100 g/L的情况下发酵135小时后丙酮酸产量达480 mmol/L，较原养型提高了60%。
高先富等[26]从7株供试菌中选出一株丙酮酸产量最高的T.glabrata TG-06菌株作为出发菌株，以甲基磺酸乙酯为诱变剂对T.glabrata TG-06进行诱变，初筛、发酵产酸、遗传稳定性等实验选出一株丙酮酸高产菌T.glabrata TP19，对其营养缺陷型鉴定表明该菌为烟酸、盐酸硫胺素、生物素和盐酸吡哆醇四种维生素的营养缺陷型。其发酵产酸水平30.5g/L，较出发菌株提高28.7%。
张健、高年发[27]采用响应面法对丙酮酸产生菌光滑球拟酵母TP19的发酵培养基进行了优化。利用优化后的条件进行摇瓶发酵，丙酮酸产量为42.4g/L。进行5L自控发酵罐发酵，丙酮酸产量为44.8g/L，比优化前提高了16.2%。
张现青、吴迪等[28][29]用高产丙酮酸菌株Torulopsis glabrata，采用3种供氧方式，比较其丙酮酸发酵、菌体生长、葡萄糖消耗和副产物的生成。结果发现，方式2，即0～12h溶氧控制在65-75%，12-16h溶氧控制在90%，16h发酵结束溶氧控制在65～75%，是比较理想的控制方式，丙酮酸产量为65.1g/L。
占桂荣等[30]以光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)TP19为出发茵，经过UV和DES复合诱变选育出一株不利用丙酮酸的高产菌(TP204)。其摇瓶发酵产酸量和产酸率分别比原菌增加了26.4%和26.5%。在5L罐上的产酸量和产酸率分别是70.23g/L和64.6%，比原菌增加了5.7%和5.3%。
2003年，Antonius J, A. van Mari等 [31] 选育出一株丙酮酸脱羧酶缺失的C2化合物非依赖性，葡萄糖耐受性酿酒酵母S. cerevisiae TAM。S. cerevisiae TAM在起始葡萄糖浓度为100 g/L下，控制pH5.0，接种60小时后丙酮酸含量达100g/L，100h后丙酮酸终浓度达到135g/L。
2005年，中国科学院微生物研究所的江宁等[32]以四种维生素营养缺陷型的Torulopsis glabrata为发菌株，采用分子生物学手段破坏了光滑球拟酵母的丙酮酸脱羧酶基因，获得一株丙酮酸产量高，副产物乙醇含量少的Torulopsis glabrata。在5L罐上发酵52h丙酮酸的积累为82g/L。