徐莹生物工艺学菌种选育市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

第二章第二章 菌种选育菌种选育徐 莹第一篇第一篇 生物反应过程原理篇生物反应过程原理篇10/10/1中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第1页本章本章本章本章课时分配课时分配课时分配课时分配：8 8 8 8课时课时课时课时本章本章本章本章讲课内容讲课内容讲课内容讲课内容：第一节第一节第一节第一节 菌种起源菌种起源菌种起源菌种起源微生物优良生产菌种特征微生物优良生产菌种特征第二节第二节第二节第二节 菌种选育菌种选育菌种选育菌种选育自然突变选育自然突变选育诱变选育诱变选育微生物细胞水平基因重组育种微生物细胞水平基因重组育种重组重组DNA技术技术分子育种分子育种第三节第三节第三节第三节 衰退、复壮和菌种保藏衰退、复壮和菌种保藏衰退、复壮和菌种保藏衰退、复壮和菌种保藏 10/10/2中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第2页良好菌种是微生物应用基础。良好菌种是微生物应用基础。以发酵工业为例以发酵工业为例生产时，围绕菌种，需要开展工作：生产时，围绕菌种，需要开展工作：选种选种选种选种 育种育种育种育种 复壮复壮复壮复壮 工艺条件和设备工艺条件和设备工艺条件和设备工艺条件和设备10/10/3中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第3页起源介绍：土壤、水和空气土壤、水和空气土壤、水和空气土壤、水和空气，尤以，尤以，尤以，尤以土壤中最多土壤中最多土壤中最多土壤中最多。1 1 1 1、直接分离取得；野生菌株直接分离取得；野生菌株、直接分离取得；野生菌株、直接分离取得；野生菌株诱变诱变诱变诱变，得到，得到，得到，得到突变株突变株突变株突变株。2 2 2 2、工业菌种总趋势：从野生菌转向、工业菌种总趋势：从野生菌转向、工业菌种总趋势：从野生菌转向、工业菌种总趋势：从野生菌转向变异菌，变异菌，变异菌，变异菌，自然选自然选自然选自然选 育转向育转向育转向育转向代谢育种，代谢育种，代谢育种，代谢育种，从诱发基因突变转向从诱发基因突变转向从诱发基因突变转向从诱发基因突变转向基因重组基因重组基因重组基因重组 定向育种定向育种定向育种定向育种。3 3 3 3、藻类、病毒藻类、病毒藻类、病毒藻类、病毒等也正在逐步为工业生产所用。等也正在逐步为工业生产所用。等也正在逐步为工业生产所用。等也正在逐步为工业生产所用。第一节第一节 菌种起源菌种起源10/10/4中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第4页一、工业生产惯用微生物一、工业生产惯用微生物1.1.细菌（细菌（细菌（细菌（bacteriabacteria）枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等10/10/5中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第5页大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸对谷氨酸定量分析对谷氨酸定量分析对谷氨酸定量分析对谷氨酸定量分析 10/10/6中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第6页乳酸杆菌乳酸杆菌乳酸杆菌乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶应用：乳酸、干酪、奶应用：乳酸、干酪、奶应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、子酒、发面、泡菜、子酒、发面、泡菜、子酒、发面、泡菜、酸奶等制作酸奶等制作酸奶等制作酸奶等制作 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶应用：生产淀粉酶应用：生产淀粉酶应用：生产淀粉酶10/10/7中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第7页2 2、酵母菌（酵母菌（、酵母菌（、酵母菌（yeastyeast）单细胞真核生物，惯用啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，单细胞真核生物，惯用啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，单细胞真核生物，惯用啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，单细胞真核生物，惯用啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于：酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和用于：酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和用于：酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和用于：酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等饲料用酵母菌体蛋白等饲料用酵母菌体蛋白等饲料用酵母菌体蛋白等10/10/8中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第8页啤酒啤酒啤酒啤酒酵母酵母酵母酵母红酵母红酵母红酵母红酵母10/10/9中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第9页面包酵母10/10/10中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第10页3、霉菌（、霉菌（mould）根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于：生产各种酶制剂、抗生素用于：生产各种酶制剂、抗生素有机酸、甾体激素等有机酸、甾体激素等10/10/11中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第11页曲霉属曲霉属应用：应用：生产有机酸、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶生产有机酸、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等等几个菌落几个菌落10/10/12中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第12页黄曲霉黄曲霉应用：酱油、酱类（淀粉酶）应用：酱油、酱类（淀粉酶）等等10/10/13中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第13页应用：应用：产糖化酶和蛋白酶、产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲主要用于酿酒制曲和酱油制曲米曲霉米曲霉10/10/14中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第14页10/10/15中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第15页青霉菌青霉菌应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶等等10/10/16中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第16页4 4、放线菌（、放线菌（、放线菌（、放线菌（actinomycetesactinomycetes）惯用菌种来自：链霉菌属、惯用菌种来自：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属小单孢菌属和诺卡氏菌属等等生产：生产：抗生素，如链霉素、抗生素，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素红霉素、金霉素、庆大霉素等等10/10/17中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第17页5 5、担子菌（、担子菌（、担子菌（、担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）6 6、藻类（、藻类（、藻类（、藻类（algaealgae）食用菌（蘑菇、木耳等），用于多糖、橡胶食用菌（蘑菇、木耳等），用于多糖、橡胶物质和抗癌药品开发物质和抗癌药品开发用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、小球用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、小球藻、栅列藻；藻、栅列藻；可经过藻类将可经过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能转变为石油，或获取氢能10/10/18中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第18页1.生产能力生产能力：能在廉价培养基上快速生长，目标代谢能在廉价培养基上快速生长，目标代谢产物产量高，其它代谢产物少产物产量高，其它代谢产物少2.操作性操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离培养条件简单，发酵易控制，产品易分离3.稳定性稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化4.安全性安全性：是非病原菌，不产有害生物活性物质或毒素是非病原菌，不产有害生物活性物质或毒素二、对工业化菌种要求10/10/19中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第19页选选择生产择生产菌种应注意菌种应注意原因原因1.原料方面原料方面：广，转化率高；广，转化率高；2.产物方面产物方面：目标产物含量高，副产物少；目标产物含量高，副产物少；3.菌体方面菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特征稳定污染、抗噬菌体能力强，遗传特征稳定4.设备方面设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。产泡沫少，适宜大罐生产。10/10/20中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第20页三、三、自然界工业菌种分离标准自然界工业菌种分离标准目标：目标：目标：目标：挑选出性能良好、符合生产需要纯种挑选出性能良好、符合生产需要纯种挑选出性能良好、符合生产需要纯种挑选出性能良好、符合生产需要纯种；某种特定需要某种特定需要某种特定需要某种特定需要要取得所需生物特征新产物，要取得所需生物特征新产物，关键关键是：是：1)1)微生物微生物生物产物起源；生物产物起源；生物产物起源；生物产物起源；2 2）适当筛选方案（检测系统）适当筛选方案（检测系统）10/10/21中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第21页自然界菌种分离和筛选主要步骤自然界菌种分离和筛选主要步骤采样采样采样采样增殖培养增殖培养增殖培养增殖培养纯种分离纯种分离纯种分离纯种分离筛选筛选筛选筛选青霉菌青霉菌青霉菌青霉菌性能测定性能测定性能测定性能测定10/10/22中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第22页 经典微生物采样和筛选方法经典微生物采样和筛选方法 调查研究并充分阅读资料设计试验方案采样增殖培养纯种分离原种斜面筛选较优菌株斜面(3-5株)性能判定确定采样生态环境确定定性或半定量快速检测方法确定特定增殖条件确定发酵基本条件粗筛(快速检测/1菌株1摇瓶)复筛（1菌株3-5摇瓶）再复筛生产性能试验毒性试验菌种判定菌种保藏及作为深入育种出发菌株结合初筛工艺条件10/10/23中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第23页怎样使样品中所含目标微生物可能性大？怎样使样品中所含目标微生物可能性大？怎样在后续操作中使这种可能性实现？怎样在后续操作中使这种可能性实现？问题问题：10/10/24中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第24页（一）采样（一）采样1 1）从大自然中原材料）从大自然中原材料采样标准采样标准：依依据据筛筛选选目目标标，微微生生物物分分布布概概况况及及菌菌种种主主要要特特征征与与外外界界环环境境关关系系等等，进进行行综综合合地、详细地地、详细地分析来决定。分析来决定。10/10/25中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第25页从自然界筛选从自然界筛选10/10/26中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第26页qq 规范取样规范取样qq 尽快分离尽快分离qq 气候、水分等环境特点气候、水分等环境特点 q 结合产品特点结合产品特点2 2）采样时要注意问题（以从土壤取样为例）采样时要注意问题（以从土壤取样为例）接下来详细讲10/10/27中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第27页qq气候、水分等环境特点气候、水分等环境特点a.a.采样采样采样采样地点地点地点地点 b.b.采土采土采土采土深度深度深度深度：普通离表层：普通离表层：普通离表层：普通离表层5 515cm15cmc.c.土壤土壤土壤土壤植被情况植被情况植被情况植被情况：如豆科植物下土，根瘤菌较多；果树下土，酵如豆科植物下土，根瘤菌较多；果树下土，酵如豆科植物下土，根瘤菌较多；果树下土，酵如豆科植物下土，根瘤菌较多；果树下土，酵母菌较多。母菌较多母菌较多。母菌较多。d.d.采土最适季节。普通应防止雨季采土，而以秋季采土采土最适季节。普通应防止雨季采土，而以秋季采土采土最适季节。普通应防止雨季采土，而以秋季采土采土最适季节。普通应防止雨季采土，而以秋季采土比较理想。比较理想。比较理想。比较理想。e.e.土壤土壤土壤土壤酸碱度酸碱度酸碱度酸碱度。细菌和放线菌在中性或偏碱性土壤中较多；细菌和放线菌在中性或偏碱性土壤中较多；细菌和放线菌在中性或偏碱性土壤中较多；细菌和放线菌在中性或偏碱性土壤中较多；酵母菌和霉菌，普通在偏酸性土壤、普通植物花朵、酵母菌和霉菌，普通在偏酸性土壤、普通植物花朵、酵母菌和霉菌，普通在偏酸性土壤、普通植物花朵、酵母菌和霉菌，普通在偏酸性土壤、普通植物花朵、瓜果种子及腐植物等上面较多。瓜果种子及腐植物等上面较多。瓜果种子及腐植物等上面较多。瓜果种子及腐植物等上面较多。采样时要注意问题采样时要注意问题采样时要注意问题采样时要注意问题 10/10/28中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第28页q 结合产品特点结合产品特点如：耐高渗透压如：耐高渗透压如：耐高渗透压如：耐高渗透压蜂蜜、蜜饯及常有糖质流经或贮蜂蜜、蜜饯及常有糖质流经或贮蜂蜜、蜜饯及常有糖质流经或贮蜂蜜、蜜饯及常有糖质流经或贮积土壤积土壤积土壤积土壤纤维素酶产生菌纤维素酶产生菌纤维素酶产生菌纤维素酶产生菌枯枝、落叶和朽木等作为样品。枯枝、落叶和朽木等作为样品。枯枝、落叶和朽木等作为样品。枯枝、落叶和朽木等作为样品。以石油为基质微生物时，在含油土壤中，含有能利以石油为基质微生物时，在含油土壤中，含有能利以石油为基质微生物时，在含油土壤中，含有能利以石油为基质微生物时，在含油土壤中，含有能利用石蜡和芳香烃微生物比普通土壤多；用石蜡和芳香烃微生物比普通土壤多；用石蜡和芳香烃微生物比普通土壤多；用石蜡和芳香烃微生物比普通土壤多；嗜碱、嗜酸微生物；嗜碱、嗜酸微生物；嗜碱、嗜酸微生物；嗜碱、嗜酸微生物；耐低温、耐高温微生物。耐低温、耐高温微生物。耐低温、耐高温微生物。耐低温、耐高温微生物。提问提问提问提问：欲取得分解弹性蛋白菌株去哪里找？欲取得分解弹性蛋白菌株去哪里找？欲取得分解弹性蛋白菌株去哪里找？欲取得分解弹性蛋白菌株去哪里找？能降解有机磷农药菌种去哪里找？能降解有机磷农药菌种去哪里找？能降解有机磷农药菌种去哪里找？能降解有机磷农药菌种去哪里找？采样时要注意问题采样时要注意问题采样时要注意问题采样时要注意问题 10/10/29中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第29页q规范取样规范取样采样采样采样采样方法方法：用：用：用：用无菌无菌无菌无菌器具按照规范取样几十克，器具按照规范取样几十克，器具按照规范取样几十克，器具按照规范取样几十克，装入无菌塑料袋或纸袋中，扎好。装入无菌塑料袋或纸袋中，扎好。装入无菌塑料袋或纸袋中，扎好。装入无菌塑料袋或纸袋中，扎好。写好写好写好写好标签标签标签标签：统计采样时间、地点、环境情况等，：统计采样时间、地点、环境情况等，：统计采样时间、地点、环境情况等，：统计采样时间、地点、环境情况等，以备考证。以备考证。以备考证。以备考证。10/10/30中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第30页q尽快分离尽快分离10/10/31中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第31页（二）目微生物增殖增殖培养，增殖培养，也称也称富集培养富集培养，是指实现是指实现目标目标微微生物在种群中生物在种群中数量上数量上占优势占优势一个技术。一个技术。方案：方案：随机随机定向培养定向培养10/10/32中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第32页随机：随机：不能提供任何有利于筛选产生菌信不能提供任何有利于筛选产生菌信 息，息，只能经过只能经过随机随机方法方法10/10/33中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第33页 定向培养定向培养:给混合菌群提供一些给混合菌群提供一些有利于所有利于所需菌株生长需菌株生长或或不利于其它不利于其它菌株生长条件。菌株生长条件。比比如，供给特殊基质或加入一些抑制剂。如，供给特殊基质或加入一些抑制剂。10/10/34中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第34页10/10/35中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第35页定向培养方法：定向培养方法：1 1 1 1）控制一定养分，需依据微生物不一样种类选取控制一定养分，需依据微生物不一样种类选取）控制一定养分，需依据微生物不一样种类选取）控制一定养分，需依据微生物不一样种类选取对应对应富集培养基富集培养基；唯一碳源唯一碳源：如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以对应底如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以对应底如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以对应底如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以对应底物为唯一碳源物为唯一碳源物为唯一碳源物为唯一碳源 淀粉琼脂培养基通惯用于丝状真菌增殖，配方为（淀粉琼脂培养基通惯用于丝状真菌增殖，配方为（淀粉琼脂培养基通惯用于丝状真菌增殖，配方为（淀粉琼脂培养基通惯用于丝状真菌增殖，配方为（%）：可溶性）：可溶性）：可溶性）：可溶性淀粉淀粉淀粉淀粉4 4，酵母浸膏，酵母浸膏，酵母浸膏，酵母浸膏0.50.5，琼脂，琼脂，琼脂，琼脂2 2，pH6.5pH6.57.07.0。如要分离如要分离如要分离如要分离耐高渗酵母菌：耐高渗酵母菌：耐高渗酵母菌：耐高渗酵母菌：首先要到含糖分高花蜜、糖质中去取样。首先要到含糖分高花蜜、糖质中去取样。首先要到含糖分高花蜜、糖质中去取样。首先要到含糖分高花蜜、糖质中去取样。富集培养基为富集培养基为富集培养基为富集培养基为5%5%6%6%麦芽汁，麦芽汁，麦芽汁，麦芽汁，30%30%40%40%葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，pH3pH34 4，在，在，在，在20202525温度下进行培养。温度下进行培养。温度下进行培养。温度下进行培养。10/10/36中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第36页 2 2 2 2）抑制不需要菌类抑制不需要菌类抑制不需要菌类抑制不需要菌类；土壤中分离土壤中分离土壤中分离土壤中分离芽孢杆菌芽孢杆菌芽孢杆菌芽孢杆菌时，将土样加热到时，将土样加热到时，将土样加热到时，将土样加热到8080或在或在或在或在50%50%乙醇溶液中浸泡乙醇溶液中浸泡乙醇溶液中浸泡乙醇溶液中浸泡1h1h；筛选筛选筛选筛选霉菌霉菌霉菌霉菌时，加入四环素等抗生素抑制细菌，时，加入四环素等抗生素抑制细菌，时，加入四环素等抗生素抑制细菌，时，加入四环素等抗生素抑制细菌，分离分离分离分离放线菌放线菌放线菌放线菌时，加入加青霉素（抑制时，加入加青霉素（抑制时，加入加青霉素（抑制时，加入加青霉素（抑制G+G+菌）、链霉素（抑制菌）、链霉素（抑制菌）、链霉素（抑制菌）、链霉素（抑制G-G-菌）各菌）各菌）各菌）各303050U/ml50U/ml，以及丙酸钠，以及丙酸钠，以及丙酸钠，以及丙酸钠10g/ml10g/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌 10/10/37中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第37页3 3 3 3）控制培养条件控制培养条件控制培养条件控制培养条件。从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择。从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择。从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择。从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择。如温度、如温度、如温度、如温度、pHpHpHpH、光照、氧气、营养等。、光照、氧气、营养等。、光照、氧气、营养等。、光照、氧气、营养等。当样品中细胞数较少时当样品中细胞数较少时当样品中细胞数较少时当样品中细胞数较少时(如水如水如水如水)，通常采取，通常采取，通常采取，通常采取膜过滤法膜过滤法膜过滤法膜过滤法。如细菌、放线菌生长繁殖普通要求偏碱（如细菌、放线菌生长繁殖普通要求偏碱（如细菌、放线菌生长繁殖普通要求偏碱（如细菌、放线菌生长繁殖普通要求偏碱（7.07.07.57.5），霉菌和酵母菌要），霉菌和酵母菌要），霉菌和酵母菌要），霉菌和酵母菌要求偏酸（求偏酸（求偏酸（求偏酸（4.54.56 6）。）。）。）。分离放线菌时，可将样品液分离放线菌时，可将样品液分离放线菌时，可将样品液分离放线菌时，可将样品液在在在在4040恒温预处理恒温预处理恒温预处理恒温预处理20min20min。物理方法：生物工艺学物理方法：生物工艺学表表2-2（P31）10/10/38中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第38页4）连续富集培养）连续富集培养依据微生物对环境因子耐受范围含有可塑性依据微生物对环境因子耐受范围含有可塑性依据微生物对环境因子耐受范围含有可塑性依据微生物对环境因子耐受范围含有可塑性特点，可经过连续富集培养方法分离降解高特点，可经过连续富集培养方法分离降解高特点，可经过连续富集培养方法分离降解高特点，可经过连续富集培养方法分离降解高浓度污染物环境保护菌。浓度污染物环境保护菌。浓度污染物环境保护菌。浓度污染物环境保护菌。假如按通常分离方法，在培养基平板上假如按通常分离方法，在培养基平板上能出现足够数量目标微生物，则无须进能出现足够数量目标微生物，则无须进行富集培养。行富集培养。10/10/39中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第39页 增殖培养选择性控制条件还应深入应用，要控制增殖培养选择性控制条件还应深入应用，要控制增殖培养选择性控制条件还应深入应用，要控制增殖培养选择性控制条件还应深入应用，要控制得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离。得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离。得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离。得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离。A用固体培养基用固体培养基平板划线分离法、平板划线分离法、平板划线分离法、平板划线分离法、稀释倾注分离法、稀释倾注分离法、稀释倾注分离法、稀释倾注分离法、涂布分离法、涂布分离法、涂布分离法、涂布分离法、稀释摇管法稀释摇管法稀释摇管法稀释摇管法（三）分离（三）分离厌氧微生物厌氧微生物厌氧微生物厌氧微生物可用此法可用此法可用此法可用此法10/10/40中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第40页培养分离中要处理问题1、“分离什么和从哪里分离出?”2、必须充分考虑所分离微生物生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作难易程度等。3、选择适宜培养分离方法和检测方法。10/10/41中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第41页不一样微生物在特定培养基上生长形成菌落或菌苔普通都含有稳定特征不一样微生物在特定培养基上生长形成菌落或菌苔普通都含有稳定特征（形状、颜色形状、颜色等等），是微生物分类、判定主要依据），是微生物分类、判定主要依据。用固体培养基分离纯培养用固体培养基分离纯培养10/10/42中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第42页同一细菌在不一样培养平板上形成不一样特征菌落同一细菌在不一样培养平板上形成不一样特征菌落10/10/43中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第43页有些微小生物必须用有些微小生物必须用液体培养基液体培养基分离纯培养，分离纯培养，如原生动物、藻类。如原生动物、藻类。B B 液体培养基分离液体培养基分离液体培养基分离液体培养基分离方法方法稀释法：稀释法：稀释法：稀释法：接种物在液体培养基中次序稀释，接种物在液体培养基中次序稀释，高度稀释，每个试管中分配高度稀释，每个试管中分配不到一个不到一个。若稀释后同一梯度平行试管中大多数（。若稀释后同一梯度平行试管中大多数（9595）没有，没有，那么有微生物可能是纯培养，不然可能性下降。那么有微生物可能是纯培养，不然可能性下降。10/10/44中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第44页显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养取得纯培养显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养取得纯培养显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养取得纯培养显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养取得纯培养显微操作仪，专业程度高显微操作仪，专业程度高显微操作仪，专业程度高显微操作仪，专业程度高从混合培养物中分离出单细胞或者单一微生物技术叫做单细胞分离，是当平板和稀分离都不奏效情况下使用一个替换方法。器具操作单细胞分离显微操纵单细胞分离技术 C C 单细胞单细胞单细胞单细胞（孢子）（孢子）（孢子）（孢子）分离分离分离分离稀释法缺点：只能分离出混杂微生物群体中占数量优势种类 10/10/45中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第45页D组织分离法组织分离法 适合用于分离高等真菌和一些植物病原菌。适合用于分离高等真菌和一些植物病原菌。适合用于分离高等真菌和一些植物病原菌。适合用于分离高等真菌和一些植物病原菌。在详细应用中，采取哪种方法，应视实际在详细应用中，采取哪种方法，应视实际在详细应用中，采取哪种方法，应视实际在详细应用中，采取哪种方法，应视实际情况而定。情况而定。情况而定。情况而定。10/10/46中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第46页2.2.2.2.控制培养条件，提升筛选工作效率控制培养条件，提升筛选工作效率控制培养条件，提升筛选工作效率控制培养条件，提升筛选工作效率1 1 1 1）控制营养成份控制营养成份控制营养成份控制营养成份 在普通情况下，按照各大类微生物在普通情况下，按照各大类微生物在普通情况下，按照各大类微生物在普通情况下，按照各大类微生物惯用培养基进惯用培养基进惯用培养基进惯用培养基进行分离行分离行分离行分离。细菌细菌细菌细菌蛋白胨牛肉膏琼脂培养基蛋白胨牛肉膏琼脂培养基蛋白胨牛肉膏琼脂培养基蛋白胨牛肉膏琼脂培养基 放线菌放线菌放线菌放线菌淀粉琼脂培养基淀粉琼脂培养基淀粉琼脂培养基淀粉琼脂培养基 酵母、霉菌酵母、霉菌酵母、霉菌酵母、霉菌麦芽汁或米曲汁培养基。麦芽汁或米曲汁培养基。麦芽汁或米曲汁培养基。麦芽汁或米曲汁培养基。特殊：特殊：特殊：特殊：分离分离分离分离分解纤维素微生物分解纤维素微生物分解纤维素微生物分解纤维素微生物，纤维素纤维素纤维素纤维素做为唯一碳源。做为唯一碳源。做为唯一碳源。做为唯一碳源。淀粉做为唯一碳源，含有淀粉做为唯一碳源，含有淀粉做为唯一碳源，含有淀粉做为唯一碳源，含有淀粉酶类微生物淀粉酶类微生物淀粉酶类微生物淀粉酶类微生物就能很好生长。就能很好生长。就能很好生长。就能很好生长。针对产生针对产生针对产生针对产生诱导诱导诱导诱导酶类微生物，必须要有某种分解底物存在酶类微生物，必须要有某种分解底物存在酶类微生物，必须要有某种分解底物存在酶类微生物，必须要有某种分解底物存在。10/10/47中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第47页举例：举例：使用固体培养基使用固体培养基分离一些分离一些酶产生菌酶产生菌，其，其选择培养基中常含有该酶作用底物。选择培养基中常含有该酶作用底物。10/10/48中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第48页2 2）控制培养基酸碱度）控制培养基酸碱度细菌和放线菌细菌和放线菌细菌和放线菌细菌和放线菌 中性或偏碱性中性或偏碱性中性或偏碱性中性或偏碱性 （pH 7.0pH 7.0pH 7.0pH 7.0或稍高）或稍高）或稍高）或稍高）酵母和霉菌酵母和霉菌酵母和霉菌酵母和霉菌 偏酸性偏酸性偏酸性偏酸性 （pH 4-6pH 4-6pH 4-6pH 4-6）10/10/49中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第49页3 3）热处理热处理 依据芽孢对热耐性而淘汰不依据芽孢对热耐性而淘汰不产芽孢细菌和其它微生物。产芽孢细菌和其它微生物。如：要筛选如：要筛选芽孢杆菌芽孢杆菌，将样品稀释，将样品稀释液经过液经过8080，10min10min水浴处理。水浴处理。芽孢芽孢营养体：营养体：营养体：营养体：60-70 10min 60-70 10min 60-70 10min 60-70 10min 杀死；杀死；杀死；杀死；芽孢：耐芽孢：耐芽孢：耐芽孢：耐100100100100以上高温。以上高温。以上高温。以上高温。10/10/50中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第50页4 4）添加抑制剂）添加抑制剂一些抗生素和化学试剂对微生物有专一性抑制一些抗生素和化学试剂对微生物有专一性抑制一些抗生素和化学试剂对微生物有专一性抑制一些抗生素和化学试剂对微生物有专一性抑制作用。注意对象、浓度。作用。注意对象、浓度。作用。注意对象、浓度。作用。注意对象、浓度。分离分离分离分离细菌细菌细菌细菌时，加入时，加入时，加入时，加入50U/ml50U/ml制霉菌素，抑制霉菌和酵制霉菌素，抑制霉菌和酵制霉菌素，抑制霉菌和酵制霉菌素，抑制霉菌和酵母菌母菌母菌母菌分离酵母和霉菌分离酵母和霉菌分离酵母和霉菌分离酵母和霉菌，加入青霉素、链霉素和四环素各加入青霉素、链霉素和四环素各加入青霉素、链霉素和四环素各加入青霉素、链霉素和四环素各30-50U/ml30-50U/ml。在分离在分离在分离在分离霉菌霉菌霉菌霉菌时，尤其是菌丝蔓延根霉、毛霉等，菌落有时很快时，尤其是菌丝蔓延根霉、毛霉等，菌落有时很快时，尤其是菌丝蔓延根霉、毛霉等，菌落有时很快时，尤其是菌丝蔓延根霉、毛霉等，菌落有时很快连成一片，不易挑单菌落。连成一片，不易挑单菌落。连成一片，不易挑单菌落。连成一片，不易挑单菌落。处理方法处理方法处理方法处理方法添加去氧胆酸钠添加去氧胆酸钠添加去氧胆酸钠添加去氧胆酸钠0.1%0.1%0.1%0.1%或山梨糖或山梨糖或山梨糖或山梨糖0.01%0.01%0.01%0.01%，预防，预防，预防，预防菌丝蔓延。菌丝蔓延。菌丝蔓延。菌丝蔓延。10/10/51中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第51页 分离分离分离分离放线菌放线菌放线菌放线菌时，加入时，加入时，加入时，加入0.05%0.05%十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）抑制）抑制）抑制）抑制细菌生长，还能激活放线菌孢子萌发。细菌生长，还能激活放线菌孢子萌发。细菌生长，还能激活放线菌孢子萌发。细菌生长，还能激活放线菌孢子萌发。分离分离分离分离放线菌放线菌放线菌放线菌时，加入氟哌酸（时，加入氟哌酸（时，加入氟哌酸（时，加入氟哌酸（5mg/L5mg/L）+制霉菌素制霉菌素制霉菌素制霉菌素（50mg/L50mg/L）+青霉素（青霉素（青霉素（青霉素（0.8mg/L0.8mg/L）也能够有效地抑制细菌）也能够有效地抑制细菌）也能够有效地抑制细菌）也能够有效地抑制细菌和真菌。和真菌。和真菌。和真菌。10/10/52中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第52页5 5）控制培养温度）控制培养温度 筛选分离耐高温菌，提升到筛选分离耐高温菌，提升到50506060，嗜冷、嗜温微生物就可大量淘汰。，嗜冷、嗜温微生物就可大量淘汰。10/10/53中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第53页6 6）通气条件控制通气条件控制专性好氧菌专性好氧菌 专性厌氧菌专性厌氧菌 兼性好氧菌或兼性厌氧菌兼性好氧菌或兼性厌氧菌10/10/54中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第54页（四）筛选及发酵性能测定（四）筛选及发酵性能测定1.1.1.1.初筛初筛初筛初筛：依据某种微生物：依据某种微生物：依据某种微生物：依据某种微生物本身特征本身特征本身特征本身特征(如如如如:生长繁生长繁生长繁生长繁殖特征、代谢产物特征等殖特征、代谢产物特征等殖特征、代谢产物特征等殖特征、代谢产物特征等)，采取特定，采取特定，采取特定，采取特定定性或定性或定性或定性或定量分析定量分析定量分析定量分析分离方法。分离方法。分离方法。分离方法。菌株多，工作量大菌株多，工作量大10/10/55中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第55页初筛分两种情况：初筛分两种情况：p平板筛选平板筛选：适合于在纯化分离阶段没有适合于在纯化分离阶段没有适合于在纯化分离阶段没有适合于在纯化分离阶段没有 采取平皿定性法挑选出来菌落。采取平皿定性法挑选出来菌落。采取平皿定性法挑选出来菌落。采取平皿定性法挑选出来菌落。（较粗放）（较粗放）（较粗放）（较粗放）p摇瓶发酵筛选摇瓶发酵筛选：一个菌株摇一瓶。检测发：一个菌株摇一瓶。检测发 酵液。（相对比较）酵液。（相对比较）10/10/56中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第56页2.2.2.2.复复复复筛筛筛筛：在在在在同同同同一一一一个个个个类类类类微微微微生生生生物物物物中中中中选选选选出出出出性性性性状状状状优优优优良良良良菌菌菌菌株株株株，结结结结合合合合定定定定量量量量分分分分析析析析 (如如如如菌菌菌菌体体体体生生生生长长长长速速速速度度度度、代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物生生生生成成成成速速速速度度度度及产量等及产量等及产量等及产量等)。10/10/57中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第57页方法：方法：方法：方法：一个菌株重复一个菌株重复一个菌株重复一个菌株重复3 3 3 35 5 5 5个瓶。个瓶。个瓶。个瓶。选选选选择择择择1 1 1 13 3 3 3株株株株很很很很好好好好菌菌菌菌株株株株，供供供供发发发发酵酵酵酵条条条条件件件件探探探探索索索索和和和和生生生生产产产产试试试试验验验验，并进而作为育种出发菌株。并进而作为育种出发菌株。并进而作为育种出发菌株。并进而作为育种出发菌株。关于初筛、复筛方法将在关于初筛、复筛方法将在变异菌株变异菌株筛选部分做详细介绍。筛选部分做详细介绍。野生型菌株野生型菌株野生型菌株野生型菌株直接从自然界样品中分离出来含有一定生直接从自然界样品中分离出来含有一定生直接从自然界样品中分离出来含有一定生直接从自然界样品中分离出来含有一定生产性能菌株产性能菌株产性能菌株产性能菌株10/10/58中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第58页毒性试验毒性试验有微生物在一定条件下将产生毒素，为了有微生物在一定条件下将产生毒素，为了有微生物在一定条件下将产生毒素，为了有微生物在一定条件下将产生毒素，为了确保食品确保食品确保食品确保食品安全性安全性安全性安全性，凡是与食品工业相关菌种，凡是与食品工业相关菌种，凡是与食品工业相关菌种，凡是与食品工业相关菌种，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须做毒性试验外，其它微生物均需经草杆菌无须做毒性试验外，其它微生物均需经草杆菌无须做毒性试验外，其它微生物均需经草杆菌无须做毒性试验外，其它微生物均需经过过过过两年以上毒性试验两年以上毒性试验两年以上毒性试验两年以上毒性试验。10/10/59中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第59页五、从生产中选种五、从生产中选种在生产过程中，经常注意那些菌体形态或在生产过程中，经常注意那些菌体形态或在生产过程中，经常注意那些菌体形态或在生产过程中，经常注意那些菌体形态或菌落性状以及一些生理性能上菌落性状以及一些生理性能上菌落性状以及一些生理性能上菌落性状以及一些生理性能上自然发生变异自然发生变异自然发生变异自然发生变异微微微微生物，将它们挑选出来，进行比较试验，有时生物，将它们挑选出来，进行比较试验，有时生物，将它们挑选出来，进行比较试验，有时生物，将它们挑选出来，进行比较试验，有时可选出愈加理想菌种。可选出愈加理想菌种。可选出愈加理想菌种。可选出愈加理想菌种。10/10/60中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第60页第二节菌种选育自然突变选育自然突变选育诱变选育诱变选育 杂交育种杂交育种原生质体融合原生质体融合基因工程育种基因工程育种10/10/61中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第61页野生型野生型菌株往往低产甚至不产所需菌株往往低产甚至不产所需产物，只有经过产物，只有经过深入深入人工改造才能人工改造才能真正用于工业生产真正用于工业生产 菌种选育菌种选育突变、体内重组突变、体内重组体外重组（基因工程）体外重组（基因工程）10/10/62中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第62页生物进化过程中微生物形成完善代谢调整机制生物进化过程中微生物形成完善代谢调整机制 不会有某代谢产物积累不会有某代谢产物积累 解除或突破微生物代谢调整控制解除或突破微生物代谢调整控制 目产物积累微生物育种目标微生物育种目标工业微生物育种工业微生物育种 10/10/63中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第63页育种目q 提升生产能力提升生产能力q 提升产品质量提升产品质量q 开发新产品开发新产品q 处理生产实际问题处理生产实际问题q 预防菌种退化预防菌种退化10/10/64中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第64页育种方法基因突变基因突变基因突变基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组基因重组基因重组基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程基因直接进化基因直接进化基因直接进化基因直接进化：点突变、点突变、点突变、点突变、易错易错易错易错PCRPCR、同序法、同序法、同序法、同序法DNAShufflingDNAShuffling等等等等10/10/65中国海洋大学食品学院生物工艺学徐莹第65页一、自然选育一、自然选育定义：在生产过程中，不经过人工诱变处理，定义：在生产过程中，不经过人工诱变处理，依据菌种依据菌