常见免疫学试验关键技术.doc

免 疫 学 实 验

实验一 与免疫有关细胞形态观测
目规定：
观测与免疫有关几种细胞形态，理解它们在机体免疫反映中作用。
实验器材：
显微镜
血液涂片（瑞氏染色）
结缔组织切片
办法：
油镜观测
一．血涂片观测
（A） 红细胞：淡红色，无核圆形细胞，因红血球为双凹形，故边沿某些染色较深，中心较浅，直径7—8微米。
（B） 颗粒白血球
嗜中性颗粒白血球：体积略不不大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中布满细小大小均匀颗粒被染成紫红色。直径10—12微米。
嗜酸性颗粒白血球：略不不大于嗜中白血球，细胞核染成紫色普通为2叶，胞质布满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。直径10—15微米。
嗜碱性颗粒白血球：体积略不大于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。直径10—11微米。
（C） 无颗粒白血球
淋巴细胞：涂片中可观测到中、小型两种。小淋巴细胞与红血球大小相似，圆形。其中含致密核，染成深紫色。周边仅有一薄层嗜硷性染成淡蓝细胞质。中淋巴细胞较大，有较宽层细胞，核圆形。6-8微米。
单核细胞：体积最大，细胞圆形。胞质染成灰蓝色。核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞核。直径14-20微米。
二．肥大细胞观测（示教）
胞体较大，呈卵圆形胞质内布满粗大均等嗜硷性颗粒。其中含肝素、组织胺等物质。常成群地分布于血管周边。
三．浆细胞观测（示教）
细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。核圆形，着色深，多偏于细胞一侧，染色质核膜呈车轮分布。正常组织浆细胞少，慢性炎症时增多。浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。
四．巨噬细胞：又称组织细胞，细胞形态不规则。常伸出短而钝突起，有很强吞噬能力。
附：
瑞特氏染色：
1．染色液配备
称取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。贮褐色瓶中备用。（配备时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。）
2．瑞特氏染色法：
取小鼠骨动脉血，涂制玻片。干后用玻璃笔在涂处之两侧划线（限制染液流掉）。于划线内部滴加染液3-4滴，经3-5分钟后，再滴加等量蒸馏水，轻轻晃动混合。经5分钟后，用蒸馏水洗净，待干后用油镜检查。

实验二 沉淀反映
可溶性抗原与相应抗体混合，在电解质存在条件下，两者比例适合，即可有沉淀物浮现，叫沉淀反映（Precipitation）.由于沉淀反映抗原多系胶体溶液。沉淀物重要是由抗体蛋白所构成。
为了求得抗原与抗体适当比例，保证有足够抗体，并且抗原分子小，具备较大反映面积，因而操作上普通是稀释抗原，不稀释抗体。
沉淀反映种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀琼脂扩散及免疫电泳等。此外尚有放射性同位素标记、酶标记等测定法。
（一）环状沉淀反映
当抗原与相应抗体形成一种接触面时，如两者比例恰当，接触面上可形成一种乳白色环状物即为阳性沉淀反映。
材料：
1. 免疫血清：免疫兔抗人血清
2. 抗原：人血清
3. 小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。
办法：
1. 取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2毫升，加入第一管，加时注意不能有气泡。
2. 以毛细吸管吸取生理盐水0.2毫升加入第二管。
3. 用毛细吸管吸入血稀释0.2毫升加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。
4 置室温中10—20分钟，观测液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳性。

（二）.琼脂扩散实验
琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现一种沉淀反映。
抗体在具有电解质琼脂凝胶中相遇时，便浮现可见白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体特异性复合物。如果凝胶中有各种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度差别，在恰当部位形成独立沉淀线，因而广泛地用于抗原成分分析。琼脂扩散实验可依照抗原抗体反映方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验。
（1） 单向琼脂扩散实验
材料：
1．诊断血清（抗体：抗人IgG或IgA免疫血清）
2．待检血清（抗原）：人血清

3．参照血清：全国统一人血清免疫球蛋白参照血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。
4．其他：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。
办法：
1．将恰当稀释（事先滴定）诊断血清与予溶化2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。
2．在免疫琼脂板上按一定距离（1.2—1.5厘米）打孔，见图1。

图1单向琼脂扩散实验抗原孔位置示意图
1-5孔加参照血清，6-7孔加待检血清

3．向孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀释参照血清及1：10稀释待检血清，每孔10微升，此时加入抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。
4．已经加样免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。
5．测定各孔形成沉淀环直径(mm),用参照血清各稀释度测定值绘出原则曲线，再由原则曲线查出被检血清中免疫球蛋白含量。
（2） 双向琼脂扩散实验
材料：
1．诊断血清：兔抗人血清
2．待测血清：人血清
3．阴性对照血清
4．其他：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。
办法：
1．取一清洁载玻片，倾注3.5—4.0毫升加热熔化1%食盐琼脂制成琼脂板。
2．凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。孔排列方式如图2所示。

图2 双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图
3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周边孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边沿残存小气泡，以免影响扩散成果。
4．加样后琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。
5．成果观测：若凝胶中抗原抗体是特异性，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间浮现一清晰致密白色沉淀线，为阳性反映。若在72小时仍未浮现沉淀线则为阴性反映。实验时至少要做一阳性对照。浮现阳性对照与被检样品沉淀线发生融合，才干拟定待检样品为真正阳性。
6．成果分析：琼脂扩散成果受许多因素影响。
①抗原特异性与沉淀线形状关系：在相邻两完全相似抗原与抗体反映时，则可浮现两单沉淀线融合。反之，如相邻抗原完全不同步，则浮现沉淀线之交叉；两种抗原某些相似时，则浮现沉淀线某些融合。见图3。

图3 双扩散实验成果示意图
A：已知抗体 a、b：阳性对照
c、d、e、f：被检材料
②抗原浓度与沉淀先导形状关系：两相邻抗原浓度相似，形成对称相融合沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度一边。见图4。

图4 抗原特异性与沉淀线形状关系
a、b：抗体 A、A’、B：抗原
A、B完全不同 A、A’某些相似

③温度对沉淀线影响：在一定范畴内，温度扩散快。普通反映在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。
④琼脂浓度对沉淀线形成速度影响：普通来说，琼脂浓度越大，沉淀线浮现越慢。
⑤参加扩散抗原与抗体间距离对沉淀线形成影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成越慢，因此在微量玻片法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反映速度。固然孔距过远，沉淀线密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目拟定。
⑥时间对沉淀线影响：沉淀线形成普通在1-3天浮现，14-21天浮现数目最多。玻片法可在1-2小时浮现，普通观测72小时，放量过久可浮现沉淀线重叠消失。
（三）对流免疫电泳实验
对流免疫电泳是在琼脂扩散基本上结合电泳技术而建立一种简便而迅速办法。此办法能在短时间内浮现成果，故可用于迅速诊断，敏感性比双向扩散技术高10-15倍。
血清蛋白在PH8.6条件下带负电荷，因此在电场作用下都向E极移动。但由于抗体分子在这样PH条件下只带薄弱负电荷，并且它分子量又较大（为r球蛋白）。因此游动慢。更重要是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用不不大于它自身迁移率。所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一种固定固体相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触水溶液就带正电荷，这样液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷液体向负极移动。而普通蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用影响，使泳动速度减慢，但它电泳迁移率远远不不大于电渗作用。这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例适当时便形成肉眼可见沉淀线。
材料：
1．诊断血清：免抗人免疫血清
2．待检血清：人血清
3．阴性对照血清
4．PH8.6,离子强度0.05M巴比妥缓冲液配备
巴比妥钠 10.3克
巴比妥 1.84克
蒸馏水 1000毫升
5．缓冲琼脂板：将纯化琼脂用PH8.6离子强度0.025巴比妥缓冲液（用0.05M巴比妥缓冲液稀释一倍即可）配成1.5%琼脂，加入0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。
6．电泳仪
7．其她：生理盐水、打孔器、微量进样器。
办法：
1．琼脂板制备依照需要可选用大玻板（6厘米×9厘米）和（小玻片）两种。大玻板约需琼脂10毫升，小玻片约需3.5毫升，凝固后按图打孔，办法同琼脂扩散实验。
2．加样：左侧孔内加患者血清（原血清及10倍稀释血清各占一孔），右侧内加抗血清，每片应有阳性对照。

图5 对流免疫电泳抗原孔、抗体孔位置示意图
3．电泳
用国产普通电泳仪。其内加0.05mPH8.6巴比妥缓冲液，加至电泳槽高度三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。将加好样品玻板置于电泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用2—4层滤纸浸湿作盐桥，滤纸与琼脂板联接处为0.5厘米。以板宽度计算电流，以板长度计算电压。规定电流量为2—3毫安/厘米，即大板为20毫安，小板为10毫安。电压为4—6伏/厘米。通电45分钟—2小时后观测成果。
4．成果观测：在黑色背景上方，用散射光各种角度观测，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应浮现明显白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹清晰度。
5．影响成果因素
（1） 抗原抗体比例：抗原抗体比例适应时容易浮现沉淀带，反之不易发生。当抗体浓度恒定期，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度增长，抗原抗体比例发生变化，沉淀线由接近抗血清孔向逐渐移向两孔中间，并可浮现不典型沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。
（2） 几组电泳缓冲液其电泳成果以巴比妥钠—盐酸缓冲液敏捷度最高。巴比妥—巴比妥钠次之。Tris缓冲液更差。
（3） 电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验成果。普通选取每厘米5毫升，电泳时间改为1.5小时。
（四）免疫电泳实验
免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，然后于凝胶槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适当部位形成特异抗原抗体沉淀弧线。每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗原成分分析；且可以依照其迁移率与抗体所浮现特异反映进行鉴定。
材料：
1．待检标本（抗原）：正常人血清。
2．抗体：正常人血清家兔免疫血清。
3．1.5%离子琼脂（系用巴比妥缓冲液配制）
4．电泳仪
5．巴比妥缓冲液：
巴比妥1.84克
巴比妥钠10.3克
蒸馏水1000毫升
pH8.6，离子强度（M）0.05
6．其他：载物玻片，直径3毫米打孔器，20mmⅹ2mm玻璃铸型，微量进样器。
办法：
1.取载物玻片（7.5ⅹ2.5厘米）加上3.5毫升1.5%琼脂凝胶，制成2毫米厚琼脂板。
2.按图位置，在琼脂板未凝固时，放入抗血清槽铸型，注意勿使铸型所有浸入琼脂中，待凝固时再打孔。
3.加待检标本：用微量进样器往孔中加1—5微升。
4.电泳：电压9—7伏/厘米，泳动15—20小时。
5.电泳后取出抗血清槽铸型，加入抗血清，进行双扩散，普通在24小时内沉淀弧出全。
6．观测成果：或描绘、拍照或进行染色，染色后标本便于成果分析及保存。

图6 免疫电泳抗原孔和抗体槽位置示意图
（五）火箭电泳实验
火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为：在电场作用下，抗原在含定量抗体琼脂介质中泳动，两者比例在适当时在较短时间内形成状似火箭或锥形沉淀线，而此沉淀线高度常与抗原量成正比关系，因而本法可以测定样品中抗原含量。
材料：
1．诊断血清（抗体）：抗人IgG或IgA免疫血清
2．待检血清（抗原）：人血清
3．参照血清
4．pH8.6，离子强度0.05M巴比妥缓冲液配制（见对流免疫电泳实验）
5．其他：琼脂粉，微量进样器，打孔器，玻璃板，电泳仪
办法：
1．抗体琼脂板制备
同单向扩散法，但注意稀释液应用pH8.6离子强度0.05M巴比妥缓冲液。
2．打孔见下图

图7 火箭电泳抗原孔位置图
3．将用缓冲液稀释适当浓度参照血清及恰当稀释抗原（人血清）分别加入各孔中，每孔10或20微升，规定加量精确而不外溢。
4．把加完样免疫琼脂板放入电泳槽中进行电泳，电压4—6伏/厘米，电泳时间1—5小时，直到大某些抗原孔前端浮现顶端尖窄而完全闭合火箭状沉淀线，关闭电源。
5．取下琼脂板，以抗原孔中心为起点，量出各火箭状沉淀线高度。同单向琼脂扩散法绘制原则曲线，查出待检血清中Ig含量。

实验三 凝集反映
当颗粒性抗原与其相应抗血清混合时，在有一定浓度电解质环境中，抗原凝集成大小不等凝集块，叫做凝集反映。
凝集反映广泛地应用于疾病诊断和各种抗原性质分析。即可用已知免疫血清来检查未知抗原，亦可用已知抗原检测特异性抗体。
一．直接凝集反映
颗粒抗原与抗体直接结合浮现凝集现象叫直接凝集反映。
（一） 玻片凝集反映
材料：
1．诊断血清：1：10稀释伤寒杆菌诊断血清
2．菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌24小时琼脂斜面培养物
3．生理盐水、载玻片、毛细吸管
办法：
1．取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内加1：10稀释伤寒杆菌诊断血清1-2滴，第三格加1-2滴生理盐水。
2．无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少量，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，由于这样将使诊断血清混入盐水而影响对照成果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。
3．同法取枯草杆菌培养物少量，于第二格内混匀。
4．轻轻摇动玻片，经1-2分钟后肉眼观测，浮现乳白色凝集块者，即为阳性反映；仍为平等乳浊液者，即为阴性反映。如成果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观测。
（二） 试管凝集反映
为一种定量实验，用已知抗原检查血清中有无特异抗体，并测定其相对含量。
材料：
1．诊断血清1：10稀释伤寒杆菌“H”血清，1：10稀释伤寒杆菌“O”血清。
2．菌液：伤寒杆菌“H”菌液，伤寒杆菌“O” 菌液。
3．生理盐水，小试管，吸管。
办法：
1．取干净小试管14只分两排排列于试管架上，每排7只依次用蜡笔注明号码，于每管中分别加入0.5毫升生理盐水。
2．在第1排1管中加入1：10稀释伤寒H血清0.5毫升，于管内持续吹吸3次，使血清与盐水充分混合，而后吸出0.5毫升注入第2管，同样予以混匀后吸出0.5毫升注入第3管。依次类推，稀释到第6管，自第6管吸出0.5毫升弃去。此时，自第1管至第6管血清稀释倍数为1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640。第7管不加血清作为对照。
3．同法用吸管吸取1：10稀释伤寒杆菌O血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀释。
4．用移液管吸取伤寒杆菌H菌液，加收第1排各管中每管0.5毫升（由盐水对照管开始，依次由后向前加入）此时血清稀释倍数又增长了一倍。
5．同法于第2排各管中加入伤寒O菌液0.5毫升。
6．将各管振荡混匀，放37℃水浴箱中2—4小时或37℃孵育箱中过夜次日取出观测成果。
观测成果：
1．观测切勿摇动试管，以免凝集块分散。
2．先看对照管，此管应无凝集现象，管内液体仍成混浊状态。但如放置时间较长，细菌堆于管底成小圆点状，为阴性反映。
3．实验管应自第1管看起，如有凝集时则于管底有不同大小圆片状边沿不整洁凝集物，上清则澄清透明或不同限度混浊。凝集强弱可用“+”号表达如下：
“++++”凝集很强，管内液体完全澄清，凝集块完全沉于管底；
“+++”凝集强，管内液体不完全澄清稍有轻度混浊，凝集块沉于管‍底；
凝集中档强度，液体半澄清，凝集块沉于管底；
“+”凝集弱，管内液体混浊，少量凝集块沉于管底；
“－”不凝集，管内液体和对照管同样混浊，无凝集块。
4．轻轻振荡各管，观测凝集块状态，对照管细菌在振荡时呈烟雾状上升，随后消散，细菌分散仍呈混浊状态。“H”菌液凝集块疏松呈棉状，大片沉于管底轻摇即升起，并极易破碎。“O”菌液凝集呈紧密颗粒状，沉于管底坚实致密，轻轻振摇不易升起，凝集颗粒较小不易摇碎。
5．记录观测成果并制定凝集效价。普通以能产生明显凝集（++）血清大稀释倍数作为该血清凝集效价。如血清最低稀释度（即第1管1：40）仍无凝集应报告为低于1：40。如血清最高稀释度（即第6管11280）仍显完全凝集现象。，应报该血清效价高于1：1280。
二．间接凝集反映
将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关颗粒载体上，然后与相应抗体结合，也可浮现颗粒载体凝集现象，称为间接凝集反映。间接凝集反映比直接凝集反映敏感性为高，可用于微量抗体或抗原检查。
（一） 间接血球凝集实验
间接血球凝集实验是依照红血球表面吸附作用而建立起来。将细菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面，此时红血球即称为“致敏红血球”。这种致敏红血球具备细菌抗原性，与相应抗血清相遇可产生凝集现象。
间接血凝抗原制备可用加碱或加热办法使菌体中多糖物质浸出，去除类脂以免干扰红血球吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附红血球需先用鞣酸予以解决。
材料：
1．抗原—伤寒杆菌O抗原
2．免疫血清：伤寒杆菌O901免疫兔血清
3．25%绵羊红血球悬液，生理盐水，试管吸管等
办法：
1．“O”抗原制备：
将每毫升100亿伤寒杆菌“O”菌悬液，置100℃水浴中2小时，离心沉淀吸取上清夜，分装无菌试管，放4℃冰箱备用。
2．致敏红血球悬液制备：
取一定稀释度抗原加等量2.5%绵羊红血球悬液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分钟取出振摇一次，共经2小时。然后取出，用生理盐水洗涤3次，而配制成0.5%悬液即成。
3．实验环节：
（1）小试管9只标好号码于试管架上。
（2）第1管加入0.9毫升生理盐水，别的各管各加入0.5毫升。
（3）以吸管吸取已加热灭菌免疫血清0.1毫升加入第1管，混匀后吸取0.5毫升注入第2管，同样第2管血清与盐水混匀后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀释直至第8管。自第8管吸出0.5毫升弃去。第9管不加血清作对照。
（4）于每管加入0.5毫升已经致敏0.5%绵羊红血球悬液，混匀后放入37℃水浴中2小时后观测成果。凡最高血清稀释度免疫血清试管中呈现完全血凝者，即为该血清间接血清效价。
（二） 间接凝集抑制实验
若使可溶性抗原与相应抗体先混合，充分作用后再加入关于免疫微球，因抗体已被可溶性抗原结合，不再浮现免疫微球被动凝集现象，叫间接凝集抑制实验，临床化验检查中惯用免疫妊娠实验就是一种间接凝集抑制实验。
妊娠实验：
孕妇尿中绒毛膜促性腺激素含量比正常尿高。因而当往尿中加入抗绒毛膜促性腺激素抗体时，由于发生抗原抗体反映成果，抗体被消耗，此时再往尿中加入胶乳抗原（吸附有人类绒毛膜促性腺激素聚苯乙烯乳胶颗粒）。不发生反映，抗原仍呈乳状液体，即为妊娠实验阳性。反之，被检尿中绒毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）局限性以把加入抗体消耗，当胶乳抗原加入后，抗体便与抗原结合发生反映。浮现均匀细小颗粒，妊娠实验为阴性。

材料：
1．抗原：吸附有人类绒毛膜促性腺激素聚苯乙烯抗原
2．抗体：抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清
3．被检材料：孕妇尿
4．正常尿作对照用
5．黑反映板1块
6．滴管3只
办法：
1．用清洁滴管在反映板上滴加一滴被检尿。
2．再往尿滴加抗血清一滴，轻轻摇动，充分混匀。
3．滴加一滴胶乳抗原，缓慢摇动3—5分钟，在较强光线下，观测成果。浮现均匀一致细小颗粒为阴性反映，怀孕。
注意事项：
1．实验材料用品用前使温度接近室温（20℃左右）
2．被检尿太混浊，需要小心过滤。
3．尿中有蛋白及血液时，不适当进行此实验。
（三） 协同凝集实验
金黄色葡萄球菌细胞壁成分中A蛋白能与人及各种哺乳动物（猪、兔、羊、鼠等）血清中IgG类抗体 Fc段结合。IgGFe段与SpA结合后，两个Fab段暴露在葡萄球体表面，仍保持其抗体活性和特异性当其与特异性抗原相遇时，也浮现特异凝集现象。在以凝集反映中，金黄色葡萄球菌菌体成了IgG抗体载体,称为协同凝集反映.本反映也可用于检测微量抗原.
A. 材料：
1. 抗原:可溶性伤寒杆菌O抗原
2. 免疫血清：伤寒杆菌0901免疫兔血清
3. 10%CoWan1株金黄色葡萄球菌（含大量蛋白A）菌液
4. PBS0.5%甲醛PBS，吸管、滴管、玻片等
B. 办法：
1．10%葡萄球菌菌悬液制备：CoWan1株葡萄球菌接种于柯氏瓶，37℃培养18-24小时，用PBS洗下菌苔，每分钟2500转速度离心20分钟。沉淀菌用PBS洗两次后，用0.5%甲醛（用PBS配备）在室温中固定3小时。置于80℃水浴中4分钟以破坏菌体自源性分解酶。再用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。
2．致敏葡萄球菌：
1毫升10%菌悬液加0.1毫升伤寒O抗血清充分混合放入37℃水浴中30分钟（中间需摇动两次）。取出后经每分钟2500转速度离心20分钟，弃去上清液，沉淀菌用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。
3．协同凝集实验
取伤寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌悬液，一滴在载波片上混匀，观测约2分钟。普通在几秒钟内即可发生凝集。
‚滴一滴致敏葡萄球菌悬液于玻片上，用接种环取伤寒O菌培养物少量置于悬液中使成均匀孔状，观测约2分钟，记录有无凝集。
ƒ用伤寒“O”杆菌培养物与未致敏葡萄球菌菌液或用痢疾杆菌培养物与致敏葡萄球菌菌液作玻片凝集，均为阴性反映，不浮现凝集。
三．凝集吸取
肠道杆菌中许多细菌均有某些相似抗原构造。因之一种细菌可与另一种细菌相应抗血清发生交叉凝集反映。用一种过量细菌抗原与发生交叉凝集反映抗血清相结合。可将其共同抗体吸去，剩余抗体只能与特异性抗原起反映，这种实验即称凝集吸取实验。
运用凝集吸取实验可制备单价因子血清，以进行细菌抗原构造分析及鉴定菌型。
材料：
1. 免疫血清：1：10稀释伤寒杆菌免疫血清。
2. 菌液：肠炎杆菌菌液，伤寒杆菌菌液。
3. 试管、吸管、毛细吸管。
办法：
1. 1/10稀释伤寒杆菌免疫血清分别与肠炎杆菌与伤寒杆菌进行玻片凝集，可见伤寒免疫血清与两种菌均有凝集，阐明二菌具备共同抗原构造，故发生交叉凝集反映。
2. 将一定量肠炎杆菌菌液加入1：10稀释伤寒杆菌免疫血清中，放37℃水浴箱中作用2小时，取出后离心沉淀，吸取上清夜，弃去沉淀。
3. 将吸取过上清夜与稀释肠炎杆菌菌液做玻片凝集，观测成果。如仍有凝集时则将此上清夜再加浓肠炎杆菌菌液进行吸取，办法如上。
4. 重复吸取过上清夜分别与稀释肠炎杆菌及伤寒杆菌菌液进行玻片凝集。如与前者无凝集而与后者有凝集，则表达伤寒杆菌免疫血清中抗肠炎抗体已被完全吸取。

实验四 溶血反映和补体结合实验
一．溶血反映
免疫血清与其相应抗原细胞（血球、细菌及其组织细胞相遇，并在补体参加下可浮现溶细胞反映。依抗原、抗体种类不同可有溶血反映、溶菌反映等。
溶菌反映只在某些细菌中浮现（如霍乱弧菌）。应用溶血反映是补体结合反映中不可少因素。溶血反映是由于抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行特异性结合，并吸着了补体，而使红血球在补体作用下被溶解，于是产生了溶血现象。
材料：
1. 抗原：2%绵羊红血球。
2. 抗体：溶血素
3. 补体：取健康豚鼠血清作为补体。
4. 小试管、生理盐水、水浴箱。
办法：
1．取小试管3只，按下表加入各物（容量单位为毫升）
试管
2%红血球
溶血素（2单位）
补体（2单位）
生理盐水
成果
1
0.5
0.5
0.5
0.5

2
0.4
0.5
——
1.0

3
0.5
——
0.5
1.0

2．将上述3试管放在37℃水浴箱内15—30分钟观测有无凝血现象。

二．补体结合反映
当抗原与其相应抗体结合时，所生成抗原抗体复合物能从溶液中将补体吸着此即谓补体结合。参加补体结合反映抗原是透明溶液，故补体结合现象不能被肉眼看出来，因而必要借助溶血系统（溶血素及相相应羊血球）作为批示剂，来鉴定媒质中有无游离补体，近而推定媒质中未知抗原（或抗体）和已知抗体（或抗原）与否进行了特异性结合。本反映具备很高敏感性及特异性，因之常应用于传染病诊断，特别诊断病毒疾病和梅毒。
由于参加本反映各种成分间有着一定量关系，因而在作本实验之前，必要通过一系列预备实验来拟定各成分使用量，故本反映实验办法较为复杂。
本次实验以伤寒杆菌免疫血清与其相相应抗原补体结合实验为例。
材料：
1. 抗原：伤寒抽出液
2. 抗体：伤寒杆菌免疫血清
3. 补体：豚鼠血清
4. 溶血素：抗绵羊血细胞兔血清
5. 2%绵羊红血球
6. 小试管、试管架、水浴锅。
办法：
（一） 预备实验（示教阐明）
预备实验涉及溶血素效价滴定，补体效价滴定，抗原效价滴定及被检血清解决。
（1） 溶血素效价滴定
按照下表加入各物

管号
溶血素（ml）
溶血素
稀释倍数
1：20
补体‍（ml）
生理
盐水‍（ml）
2%羊血球（ml）

假定成果
1
0.5
1：300
0.3
1.7
0.5
摇匀后置37‍℃水浴一小时
全溶解
2
0.5
1：500
0.3
1.7
0.5
全溶解
3
0.5
1：800
0.3
1.7
0.5
全溶解
4
0.5
1：1000
0.3
1.7
0.5
全溶解
5
0.5
1：1200
0.3
1.7
0.5
全溶解
6
0.5
1：1600

0.3
1.7
0.5
全溶解
7
0.5
1：
0.3
1.7
0.5
全溶解
8
0.5
1：2400
0.3
1.7
0.5
全溶解
9
0.5
1：3200
0.3
1.7
0.5
全溶解
10
0.5
1：4000
0.3
1.7
0.5

11
0.5
1：4800
0.3
1.7
0.5

12
0.5
1：6000
0.3
1.7
0.5

对照

1
0.3
2.2
0.5

凡最高稀释度溶血素可呈现完全溶血者为一种单位。依上表成果第10管（即1：4000倍稀释）05毫升溶血素为一种单位，在溶血反映中惯用0.5毫升中具有2个溶血素单位溶液，因此实验时应取1：倍稀释溶液。
（2） 补体单位滴定
依下表加入各试剂：
管
号
补体
(1：20)（ml）
抗原
(ml）
生理盐水(ml）
置
于
37‍
℃
水
浴
45
分钟
溶血素
(2单位）（ml）
2%羊血球悬液（ml）
置
于
37
‍℃
水
浴
15
分钟
成果
1
0.20
0.5
1.30
0.5
0.5
不溶血
2
0.25
0.5
1.25
0.5
0.5
稍溶血
3
0.30
0.5
1.20
0.5
0.5
全溶血
4
0.35
0.5
1.15
0.5
0.5
全溶血
5
0.40
0.5
1.10
0.5
0.5
全溶血
6
0.45
0.5
1.05
0.5
0.5
全溶血
7
0.50
0.5
1.00
0.5
0.5
全溶血
8
-
0.5
1.50
0.5
0.5
不溶血
能引起完全溶血最小补体量称为精确单位，上表中第3管（即0.3毫升），但因补体效价也许有某些损失，故普通稍高一管为实用单位，实际实验时须用两个实用单位。
上表成果为：
补体原则单位：0.3毫升
补体实用单位：0.35毫升

补体两个实用单位：0.70毫升
因实验时是两个实用单位补体0.5毫升，可依下列比例关系换算：
20：0.7=ⅹ：0.5
ⅹ= 14.3
即须将补体稀释14.3倍，用0.5毫升则具有两个实用单位。
（3） 抗原滴定
在用已知抗原测定未知抗体时，必要先滴定抗原效价以决定本实验时所需抗原最适浓度（反之用已知抗体测定未知抗原时，则需滴定抗体效价）
试 管号
剂
1
2
3
4
5
6
1：5稀释血清
0.5
0.5
0.5
－
－
－
伤寒抗原2U
0.5
－
－
0.5
－
－
痢疾抗原1：80
－
0.5
－
－

－
－
补体2U
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
生理盐水
－
－
0.5
0.5
1.0
1.5
摇匀放置37℃水浴中30min
溶血素2U
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
－
2％羊血球
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
摇匀放置37℃水浴中15min
阐明
实验管
特异性对照
血清
对照
抗原
对照
溶血素对照
羊血球对照

如血清对照管呈完全或某些不溶血是为抗补体现象。血清严重污染细菌，混有淋巴液或明显溶血时，常产生很强抗外体作用。又如试管、吸管不清洁，也可浮现抗补体。若有抗补体发生，应抽血重实验。

实验五 T、B淋巴细胞分离实验
淋巴细胞重要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具备不同特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，一方面需分离出纯T淋巴细胞和B淋巴细胞。本实验原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）解决绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中所有T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固稳定而巨大E—花环，较正常未解决SRBC形成E—花环比例为高，并且形成迅速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时，AET—E花环易沉于管底，而未形成E—花环T淋巴细胞用低渗液解花环周边 AET—SRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液界面。
材料及试剂：
a) 新鲜豚鼠血
b) 兔红细胞（RRBC）
c) 溴花二氨基异硫氢化物（AET）
d) 淋巴细胞分层液
e) 其他Hanks液，含小牛血清199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。
办法：
1. AET—RRBC制备
（1）. AET溶液制备
称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水中，使成为0.143M溶液，用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必要新鲜配制，不适当久存。
（2）. AET解决RRBC
取洗涤好压积RRBC，按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制pH9.0AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口（1—2厘米）1800转/分离心5分钟。持续洗涤3—5次，每洗一次，必要充分摇匀，以减少AET—RRBC粘附成团，并观测有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清199培养基再洗一次，最后配成10%AET—RRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。
（3）.1%AET—RRBC配制：
将预先配制并保存于4℃冰箱10%浓度AET—RRBC，以含10%小牛血清199培养液稀释至1%。
2. 从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后实验。
3. AET—E花环实验：
将分离单个核细胞（2ⅹ106/毫升）与等量1%AET—RRBC混合，置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次，分装数管，每管2—3毫升，低速离心（1000转/分钟）5分钟后，移至4℃冰箱45分钟。
4. T淋巴细胞和B淋巴细胞分离
将形成E—花环细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底E—花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫升解决3分钟，低渗裂解E—花环周边RRBC，及时加3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含T淋巴细胞群。

实验六 豚鼠T淋巴细胞测定
——兔红细胞玫瑰花环实验
玫瑰花环实验，又称为花结实验。是测定淋巴细胞数量和功能一种办法。
人类T和B淋巴细胞表面具备不同受体。由于人类T淋巴细胞表面具备与绵羊红细胞结合受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形成E花环，因而，T细胞也成为红细胞花瓣形成细胞。依照E—玫瑰花环形成率，可以间接判断机体细胞免疫力。当前，已广泛应用于临床，作为测定人群免疫状态一种指标。
材料：
1. 肝素（100单位/毫升）
2. 0.5%兔红细胞悬液（用Hanks液配制）
3. 吸取过胎牛血清：
取经56℃30分钟加热灭活后胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后，37℃水浴20分钟，转/分离心10分钟，取上清液即成。
4. Hanks液
5 豚鼠抗凝血
6. 淋巴细胞分层液
7. 灭菌注射器，针头，试管，吸管等。
办法：
1. 淋巴细胞提取
（1） 取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀释。加于3毫升淋巴细胞分层液液面之上（沿管壁轻轻加入，勿使两液相混）。
（2） 转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另一试管中加5倍体积Hanks液洗1—2次，（1500转/分离心10分钟）弃上清即成。

图8 用分层液离心后血细胞层

2. 加吸取过胎牛血清0.1毫升，0.5%兔红细胞悬液0.2毫升，于淋巴细胞中。混合后，37℃水浴5分钟。
3. 500转/分离心5分钟，放4℃冰箱中2小时后，弃大某些上清。
4. 染色及观测
轻轻悬浮沉积细胞。向悬液中滴一滴美兰液，混合，10分钟后取一滴放载玻片上，加盖玻片镜检。
高倍镜或油镜下计数200个淋巴细胞，凡结合3个或3个以上兔红细胞者为阳性，计算花环形成细胞百分率。

实验七 酶联免疫吸附实验
（ELISA）测定伤寒杆菌“O”抗体
酶联免疫吸附实验是用酶标记抗体（或SPA）检测未知抗原或抗体办法。此法敏感性高，特异性强。惯用是ELISA办法，间接法，双抗体法和抗原法。本次实验简介，酶联葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理如下，见图9

图9 ELISA－SPA法原理
1. 加抗原 使之吸附于固相载体（如塑料反映板）
2. 洗