分子克隆关键技术实验讲义最终版.doc

分子克隆技术实验讲义

黑龙江大学生命科学学院
3月

甜菜M14品系BvM14-glyI基因克隆与鉴定
一、实验目
1、熟悉和理解目基因克隆与鉴定过程和办法。
2、学习和掌握质粒、T载体特点。
3、学习和掌握TA克隆连接体系及操作要点。
4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体过程及办法。
5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞原理和办法。
6、学习并掌握热激法转化技术原理和操作环节。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选原理及蓝白筛选原理和办法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA原理及操作环节。
二、有关知识
（一）T载体制备
pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处XbaⅠ和SalⅠ辨认位点之间插入了EcoRⅤ辨认位点，用EcoRⅤ进行酶切反映后，再左两侧3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物连接、克隆效率。
有关知识点：（1）质粒提取；（2）酶切；（3）PCR等。
（二）DNA重组与连接（PCR产物克隆）
把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目基因“装进”载体过程，即DNA重新组合。为了将目基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目基因分别进行恰当解决，普通采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接线性分子，使其与相似酶切过载体分子互相连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。当前某些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段专用载体，如专门用于克隆PCR产物载体，大大以便了实验操作。
有关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶分类及功能等。
（三）大肠杆菌感受态细胞制备
外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一重组体分子，这就是外源基因无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是当前基因工程最惯用受体细胞。感受态细胞（competent cell）是通过一定办法解决后，具备接受外源DNA能力大肠杆菌，只有发展了感受态细胞才干稳定地摄取外来DNA分子。
有关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及办法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。
（四）重组DNA转化及重组子鉴定
将外源DNA分子导入某一宿主细胞过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目，一是大量产生重组DNA分子，在完毕连接反映后，重组DNA分子往往只有纳克级量，不易操作和进行下一步分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一种细胞都具有诸各种拷贝重组DNA分子，这样重组DNA分子量就多了；二是对重组DNA分子进行纯化，在构建重组DNA分子过程中很难保证体系中不污染其她DNA分子，连接过程完毕后来体系中有各种分子存在，除了需要重组DNA分子以外，还具有无连接上载体分子、没有连接上DNA片段、自身环化DNA分子和连接上污染DNA片段重组DNA分子，未连接上载体和DNA片段对实验影响不大，由于它们虽然导入细菌细胞，由于不能复制，不久就要被细菌细胞中酶降解掉；对克隆工作带来影响是后两种分子，由于它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产生克隆，但是每个细胞中只能导入一种质粒DNA分子，每个单克隆都是由一种细胞形成，因而在每个克隆中所有细胞都只具有同一种质粒。因此只要对不同克隆进行筛选，就可以鉴定所需重组DNA分子。
所谓重组子（recombinant）也叫做转化子（transformant）是指吸取了重组DNA分子转化细胞。将重组子从其他细胞群中（如上面提到对克隆影响较大自身环化DNA分子和连接上污染DNA片段）分离出来，并鉴定无性繁殖外源基因的确为目基因，这过程称为筛选（screening）。依照载体体系、宿主细胞特性以及外源基因在受体细胞表达状况不同，初步把筛选办法分为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选取性载体筛选法、分子杂交选取法；间接筛选也可以进一步分为免疫学办法、mRNA翻译检测法；本实验采用平板筛选法中蓝白筛选法。
有关知识点：
①转化（transformation） 质粒（plasmid）
②转染 (transinjection) 噬菌体（phage）
③显影注射
（1）导入办法 ④电转化 2.5kv
⑤基因枪 geneblaster
⑥脂质体介导法
⑦其他办法：迅速冷冻法、碳化硅纤维介导法
（2）重组子： 转化子
（3）重组反映体系中成分：①②③④⑤⑥
（4）筛选办法
DNA鉴定筛选法：定位、测序
①直接筛选法 选取性载体筛选法：λph包裹、抗药性 α-互补
分子杂交筛选法：ISH、Southern Blot
免疫化学
免疫学办法
②间接筛选法 酶免疫检测
mRNA翻译检测法
（五）质粒DNA提取（碱裂解法）
原核生物没有真正细胞核，DNA普通位于一种类似“核”构造——称为类核体上（由于不是一种完整细胞核）。E.coli遗传物质重要是染色体DNA ，E.coli染色体为双股环状DNA，具有1 400个以上基因，此外尚有某些质粒DNA。
1、质粒概念
质粒是细菌（如E.coli）染色体外小型环状双链DNA分子。普通说来，质粒不是细菌生长繁殖所必要构造，就细胞生存而言，质粒是可有可无。质粒分子自身具有复制功能遗传构造，故能在细菌内独立地进行复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。
2、研究质粒意义
（1）质粒作为一种裸露，比病毒更简朴、更有自主复制能力DNA分子，正好处在生命与非生命分水岭上。由于质粒可以复制、可以传递、可以表达其遗传信息，阐明质粒是独立有机体，是亚细胞生命体系成员，是比病毒更简朴原始生命形态，因此质粒是研究生命来源一块重要基石。
（2）要把一种有用基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。携带外源基因进入受体细胞这种工具叫载体。由于质粒具备遗传传递和遗传互换能力，因而，质粒作为基因工程重要运载工具，在当代分子生物学占有重要地位。
3、质粒分类
不同质粒在宿主细胞中拷数也不同，依照质粒在细胞中拷贝数多少，Rownd（1969）把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒。
（1）严密型质粒（stringent plasmid）：严密型质粒多半是某些具备自身传递能力大质粒，其DNA复制与宿主染色体DNA复制相偶联，受到某种限度控制，每个细胞仅有1-2个拷贝。
（2）松驰型质粒（relaxed plasmid）：松驰型质粒多半是分子量较小、不具传递能力质粒，其复制是在松驰控制下进行，每个细胞拷贝数约为10～200个。当向培养基中加入氯霉素时，细胞蛋白质合成被抑制，细胞染色体DNA和严密型质粒DNA复制停止，松驰型质粒DNA复制继续进行。松驰型质粒DNA拷贝数可达数百个，基因工程中使用质粒都是松弛型质粒。
有关知识点：
（1）质粒分类：
①与宿主有关限度：严密型质粒（stringent plasmid）、松弛型质粒（relaxed）
②与否有转移基因：接合型质粒、非接合型质粒
③带有特殊用途基因：生殖质粒（F质粒）、抗性质粒（R-质粒）、col质粒（编码杀死其她细菌蛋白质）、降解质粒、致病质粒（Ti）
OC
L
SC
（2）质粒提取办法：煮沸法、CsCl、试剂盒、碱裂解法；
（3）质粒构型：
①SC构型：cccDNA (covalently closed circle DNA)
②OC构型：ocDNA (open circle DNA)
③L构型：L-DNA (linearDNA)

三、实验原理
（一）T载体制备

XcmⅠ是一种Ⅲ型限制性核酸内切酶，其辨认序列为：
5′-CCANNNNN^NNNNTGG-3′
3′-GGTNNNN^NNNNNACC-5
其中阴影某些为XcmⅠ辨认序列，“^”为XcmⅠ切割位点，其辨认序列中间9个任意核苷酸（N）对XcmⅠ酶切特异性及酶切效率没有影响。为了能得到用XcmⅠ酶切后3′末端均是T载体，本实验运用了XcmⅠ辨认序列特点，引物3′端带有XcmⅠ酶切位点，其序列如下：
Primer1：5′-CGCCCATGCTA^GCGCTGGTAAT- 3′
Primer2：3′- TCTCTAAGGTATGC^ATATGACCCGC- 5′
引物中“^”为XcmⅠ切割位点，当XcmⅠ对PCR得到线性片段进行酶切时候，便会产生一种与T载体形式完全同样3′-T粘性末端。
（二）DNA重组与连接（PCR产物克隆）
1988年，Clarke发现所有PCR产物都在Taq DNA聚合酶作用下在3′端附加上了一种3′突出腺苷酸，由于Taq DNA聚合酶具备非模板介导核苷酸转移酶活性，可在双链DNA末端加上一种单一3′突出dATP，运用Taq DNA聚合酶这一特性，在克隆载体上附加3′胸腺嘧啶（dTTP）形成T-A克隆系统，即可直接对PCR产物进行有效克隆，这样载体称为T-载体。
（三）大肠杆菌感受态细胞制备
大肠杆菌感受态细胞制备技术是从20世纪70年代初期发展起来，当时人们发现如果把E.coli细胞浸在一冰冷盐溶液，它吸取DNA分子能力要比不浸细胞强；通过摸索和总结，人们终于采用50 mmol/L氯化钙（CaCl2）溶液来制备感受态细胞。其她盐（如氯化铷RbCl）也很有效。尽管对这一解决确切机制仍不清晰，但有人对感受态提出了两种假说，一种以为是细菌细胞壁局部失去了壁构造或局部溶解，让外源DNA分子通过质膜进入；另一种以为DNA分子能进入细菌细胞是由于细胞处在感受态时表面形成了一种可接受DNA酶位点。一旦细胞被解决制备成感受态细胞，它们就能稳定地摄取外源DNA分子了。
（四）重组DNA转化及重组子鉴定
转化是使重组体DNA分子在热休克短暂时间内被导入受体。普通以为DNA分子在转化过程中将经历四个阶段，第一种阶段是吸附阶段，完整双链DNA分子将吸附于感受态细胞表面；第二个阶段为转入阶段，双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞，而另一链则被降解；第三阶段是自身稳定阶段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA；第四个阶段是表达阶段，即目基因随同质粒复制子一起复制。
有些株系E.coli尽管用抗生素抗性基因插入失活法来筛选重组子很以便，但有质粒还是采用了其她基因进行筛选，效果同样不错。以pΜC 8载体为例，它除了具有氨苄青霉抗性基因以外，还具有一种称为LacZˊ基因。该基因编码β-半乳糖苷酶一某些。半乳糖苷酶参加将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖生化过程，本来是由E.coli染色体上LacZ基因编码。有些株系E.coli带有修饰过LacZ 基因（即缺少LacZˊLacZ基因），只编码β-半乳糖苷酶α-肽。这些株系E.coli细胞只在有吸取了像pΜC 8这样带有LacZˊ基因质粒分子状况下才可以合成完整β-半乳糖苷酶。因而在筛选pΜC 8重组子时，先将转化子涂布于具有氨苄霉素培养基上培养，然后再通过检测β-半乳糖苷酶活性来选取重组子，既能抗氨苄霉素，又能合成β-半乳糖苷酶细胞就是重组子细胞。当代化学发展给咱们提供了非常直接地检测β-半乳糖苷酶活性办法，这种办法涉及一种乳糖类似物——5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（5-bromo-4-chLoro-3-indoLyL-β-D-galactopyranoside），由于它英文名太长，因此人们就用X-gal来代替它长名。β-半乳糖苷酶可以将X-gal 分解成一种深蓝色产物，这个反映是很敏捷。当带有氨苄青霉素培养基中加有X-gal及一种β-半乳糖苷酶诱导物（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG）时，那些能合成完整β-半乳糖苷酶未重组克隆就会因它能酶解X-gal而变成深蓝色，而重组子因LacZˊ基因被破坏不能合成完整β-半乳糖苷酶而呈白色，蓝白分明，重组子筛选也已泾渭分明。
E.coli 修饰过pUC系列质粒
↓ ↓
修饰LacZ基因 多LacZ基因
（缺少LacZ′基因）
↓ ↓
β-半乳糖苷酶C末端ω-肽 β-半乳糖苷酶N末端α-肽

↓
完整β-半乳糖苷酶
↓ X-gal/IPTG
深蓝色
（五）质粒DNA提取（碱裂解法）
碱裂解法是一种用得最广泛制备质粒DNA办法，是当今分子生物学研究中常规作法。碱变性法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性差别而达到分离目，当细胞在有NaOH和SDS（十六烷基磺酸钠）溶液Ⅱ中裂解时，蛋白质与染色体、RNA、DNA发生变性，加入中和液醋酸钾溶液Ⅲ后，溶液变成中性，质粒DNA复性，质粒DNA以本来构型保存在原溶液中，进行离心，蛋白质与染色体DNA随细胞碎片沉淀下来，质粒DNA则留在上清液中。
这种办法重要用于从小量培养物或同步从许多细胞克隆中进行DNA提取，比较以便和省时，该法提取DNA纯度较高，不需进一步纯化即可满足测序、PCR等。
（1）SolutionⅠ：破坏细胞壁。
（2）SolutionⅡ：高pH值，SDS使宿主染色体DNA和蛋白质变性。
（3）SolutionⅢ：乙酸钾中和质粒DNA复性、染色体DNA不复性，仍和变形蛋白质缠绕成大复合物。
四、实验过程
（一）T载体制备
1、pYCQ1载体质粒提取
（1）挑取具有质粒pBI121大肠杆菌单菌落，接种于50mL LB（含Amp抗生素60μg/mL）液体培养基中，37℃，180 r/min振荡培养过夜（约12-14h）。
（2）取适量培养物加入离心管中，室温8 000 r/min离心4 min，弃上清，收集菌体。
（3）将100μL预冷溶液I加入到离心管中，在旋涡混合器上激烈振荡，使菌体分散混匀。
（4）加入溶液II（1%SDS 100μL，0.2 mol/L NaOH 100μL），迅速颠倒10次混匀（不要激烈振荡）。
（5）加入150μL预冷溶液III，将管缓慢颠倒多次混匀并冰上放置5min后，4℃ 12 000 r/min，离心4min。
（6）少量多次吸取上清转移至新管，小心不要引入白色蛋白质污染。
（7）加入400μL预冷苯酚氯仿异戊醇（25：24：1），上下颠倒，去除蛋白质，4℃ 12 000 r/min 离心5min。
（8）小心移出上清于一新1.5mL离心管中，加入等体积预冷异丙醇，混匀后冰置10min，以沉淀质粒DNA 。4℃ 12 000 r/min离心3min。
（9）弃上清，用200μL预冷70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心3min，去上清，滤纸吸干多余液体，固体在室温下放置无乙醇味。
（10）获得质粒载体pYCQ1沉淀溶于25μLddH2O，-20℃保存备用。
2、PCR扩增反映
取一支0.2mLPCR管，冰上建立PCR反映体系，PCR反映液按表1进行配制。
表1 pYCQ1载体PCR反映体系
成 分
用 量
Ex Taq Buffer
2.5μL
ddH2O
17.5μL
dNTP（2.5mmol/L）
1.5μL
P1（10 μmol/L）
1.0μL
P2（10 μmol/L）
1.0μL
模板（质粒载体pYCQ1）
1.0μL
Ex Taq酶
0.5μL
Total Volume
25μL
扩增程序：94℃ 2min；94℃ 0.5min，50~60℃ 0.5min，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 4min，4℃保存。
3、XcmI单酶切PCR产物
取一支0.2mLPCR管，冰上建立酶切反映体系，酶切反映液按表2进行配制。
表2 XcmⅠ酶切反映体系
成 分
用 量
XcmⅠ Buffer
2.5μL
PCR扩增产物
16.5μL
XcmⅠ
0.5μL
ddH2O
5.5μL
Total Volume
25μL
加封口膜后才可放入水浴锅中，37℃水浴2.5h。酶切后，65℃水浴10min终结酶切反映
（二）DNA重组与连接（PCR产物克隆）
4、与PCR产物连接
取一支0.2mLPCR管，冰上建立连接反映体系，连接反映液按表3进行配制，16℃水浴1h。
表3 连接反映体系
成 分
用 量
10×T4 DNA Ligase Buffer
1.0μL
ddH2O
2.0μL
BvM14-glyI基因
5.0μL
载体（XcmⅠ酶切产物）
1.0μL
T4 DNA Ligase
1.0μL
Total Volume
10μL
（三）大肠杆菌感受态细胞制备
5、DH5α感受态细胞制备
（1）从37℃培养平板中挑取一种DH5α单菌落，接种于50mL LB液体培养基中，37℃ 180 r/min振荡过夜。
（2）次日按1%量（500μL）接种于50mL LB液体培养基中，37℃180 r/min振荡培养1h 40min。
（3）将菌液分装于10mL离心管中，4 000 r/min 4℃离心5min，去上清，收集菌体，加入5mL预冷0.lmol/L CaCl2。轻轻悬浮沉淀，置冰上30min。
（4）4 000 r/min离心5min，去上清，加入1mL预冷0.1 mol/LCaCI2，轻轻悬浮沉淀。
（5）进行分装，每一种1.5mL离心管中加约200μL感受态细胞，4℃保存备用。
（四）重组DNA转化及重组子鉴定
6、连接产物转化DH5α感受态细胞
（1）10μL连接产物和200μL感受态细胞在无菌条件下混匀，冰置30min。
（2）42℃水浴热激90s，及时放置冰上90s。
（3）加入890μL 已预热至37℃SOC液体培养基，37℃扩培，180 r/min振荡l h。
（4）振荡培养后，将菌液按不同梯度量涂布于具有X-gal（40μL）、IPTG（4μL）LB（Amp 60 μg/mL)平板。
（5）待菌体吸附后（约15min），倒置于37℃ 恒温培养箱中培养过夜（约14-16h），观测菌落颜色，计算转化效率。
（6）挑取重组菌落，接种至1.5mL离心管（含1mL LB+Amp液体培养基）中，扩培备用。
（五）质粒DNA提取（碱裂解法）
（1）环节同（一）中质粒提取环节。
（2）将提取质粒进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后凝胶成像系统拍照，检测重组质粒与否构建成功。
五、实验要点
（一）T载体制备、DNA重组与连接（PCR产物克隆）
由于本实验使用载体为T载体，因此不需要插入片段与载体同步酶切。如果需要在酶切反映之后再进行连接反映时，应注意如下两点：
（1）限制性内切酶未能完全被灭活，使用乙醇沉淀可避免这一问题发生。
（2）DNA样品中混有可影响连接活性杂质，酶解后DNA直接用于连接时而不通过乙醇沉淀重溶于无菌蒸馏水中时经常会遇到这种问题。
（二）大肠杆菌感受态细胞制备
1、商品化感受态细胞有PH 525、JB 101、Top 10、DH 5-2。
2、对所用试剂如CaCl2规定很高，要注意质量与浓度。
3、用CaCl2法制备感受态细胞在4℃放置过夜后感受态效率提高。
4、感受态细胞对冻融非常敏感。化冻细胞不应重复冷冻，如果冰箱出了故障则应弃去并重新制备。
（三）重组DNA转化及重组子鉴定
1、普通蓝色显色不太完全，可以将平板置于冰箱中放置过夜使颜色变深。
2、实验中应作对照，普通对照是取某些感受态细胞，用未酶解载体质粒进行转化，应当得到一块长满蓝色克隆平板，证明感受态细胞是好。
3、除对照外，如果其她板上一种菌落也没有。浮现这种问题因素也许是连接酶失活，应当更换。
4、平板上菌长成菌苔状，浮现这种状况也许有如下两个因素：
（1）对未转化E.coli细胞缺少选取压力，使它们同转化细胞一起生长，其因素是平板中缺少抗生素或抗生素活性较低，在培养基未能充份冷却时即加入抗生素也许导致抗生素某些失活。
（2）E.coli菌株也许获得了具有抗生素抗性基因质粒。
这时应使用新鲜氨苄青霉素重新配制LB平板，同步配制不含抗生素平板，将贮存细菌分别涂在两种平板上，若该菌株能在具有氨苄青霉素平板上生长，则阐明该菌获得了某个质粒，应弃之，并且制备新鲜菌；若细菌在不含抗生素平板上生长，在含氨苄青霉素平板上不能生长，则阐明在转化实验中所使用平板或者没加抗生素，或者抗生素浓度不够。
（五）质粒DNA提取（碱裂解法）
加入溶液Ⅱ进行蛋白质变性过程中要记住两点：（1）时间不能过长，由于在这样碱性条件下基因组DNA断裂会慢慢断裂；（2）必要温柔混合，否则基因组DNA也会断裂，这样会带来诸多麻烦。

六、实验仪器及耗材
1、实验仪器：水浴锅、摇床、高压灭菌锅、无菌操作台、移液枪、冻冷离心机、紫外分光光度计（721型）、离心机、移液管、超低温冰箱、电子天平、接种环、涂布棒、冰浴、培养箱、振荡器 （Vortex）、饭盒、玻璃器皿（三角瓶、平皿）、试管、制冰机、冰盒、计时器、磁力搅拌器。
2、耗材：0.2mL PCR管、0.5mL离心管1.5mL 离心管、10mL离心管、液氮（罐）、一次性手套、滤纸、沙布、脱脂棉、Tip头（各种大小）。
七、实验重要试剂及配制办法
（一）实验重要试剂
1、T载体制备
Amp抗生素、胰化蛋白胨、酵母提取物、NaCl、NaOH、SDS、苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）、异丙醇、乙酸钾、冰乙酸、70%乙醇、氯霉素、引物、Ex Taq酶、dNTP、XcmⅠ酶、Buffer、ddH2O。
2、DNA重组与连接（PCR产物克隆）
PCR产物（插入DNA）、pMD20-T载体（大连宝生物生产）、ddH2O、T4 DNA连接酶、Buffer。
3、大肠杆菌感受态细胞制备
胰化蛋白胨、酵母提取物、无菌水、NaCl、NaOH、TOP10菌种、DH5α菌种、葡萄糖、CaCl2。
4、重组DNA转化及重组子鉴定
PCR产物连接混合物、感受态细胞、适当对照DNA、LB培养基（每升中具有 10g胰蛋白栋、5g酵母浸膏、10g NaCl，用5M NaOH调节pH7-8）、LB氨苄青霉素平板（每升LB培养基中加入15g琼脂，再加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/mL）、氨苄青霉素（用灭菌蒸馏水配制50mg/mL贮液）、IPTG（取2g溶于8mL双蒸馏水中，定容至10mL，过滤除菌，-20℃保存）、X-gal（贮液浓度为20mg/mL，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃暗处保存）、SOC培养基。
5、质粒DNA提取（碱裂解法）
胰化蛋白胨、酵母提取物、NaCl、NaOH、氯霉素（34mg/mL，溶于乙醇，工作浓度为170μg/mL）、HB 101大肠杆菌菌株、葡萄糖、Tris·HCl、EDTA-Na2·2H2O、SDS、乙酸钾、冰乙酸、乙醇、无菌水、
（二）配制办法
1、LB液体培养基（不加抗生素）
去离子水 950m
胰化蛋白胨 10g
母提取物 5g
NaCl 10g
摇动至完全溶解，用5moL/L NaOH（约0.2mL）调pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，在151bf/in2（1.034×105pa）高压灭菌20min。
2、0.1M CaCl2配制
CaCl2 2.3g
加H2O至 200mL（灭菌）
3、5moL/L NaOH（NaOH分子量=40）
将200gNaOH溶于450mLH2O中，加水定溶至1L。
4、LB培养基（Lμria-Bertani培养基）
去离子水 950mL
细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone） 10g
细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g
NaCl 10g
摇动容器直至完全溶解，用5moL/L NaOH（约0.2mL）调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，在151bf/in2（1.034×105Pa）高压灭菌20min。
5、溶液I（GTE溶液）
50mmoL/L 葡萄糖（MV=180.16）
25mmoL/L Tris·HCL（pH8.0）（MV=121.14）
10mmoL/L EDTA（pH8.0）（EDTA Na2·2H2OMV=372.24）
配制100mL溶液I： 0.9g葡萄糖，0.302g Tris•HCL，0.372 g EDTA Na2·2H2O→定容100mL→调pH8.0→高压蒸气灭菌15min→4℃贮存
6、5moL/LNaOH：（NaOH分子量=40）
将200g NaOH溶于450mL H2O中，加H2O定容至1L
7、溶液II
0.2moL/L NaOH，临用前用10moL/L（40g溶于100mL）贮存液现用现稀释
1% SDS （W/V，g/mL）
配制：1g SDS+ 2mL 10moL/L NaOH → 100mL
8、5moL/L 乙酸钾
49.1g乙酸钾溶于100mL纯水， -20℃贮存
9、溶液 Ⅲ 溶液
配制100mL溶液:
乙酸钾（5 moL/L） 60.0mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
10、1M Tris·HCl，pH=8.0
Tris·HCl： 121.1g 60.55g
浓HCl： 42mL 21mL
加H2O至： 1L 500mL
——→高压灭菌 15min
11、0.5M EDTA-Na2·2H2O，pH=8.0
EDTA-Na2·2H2O：186.1g 93.05g 55.83g
加H2O至： 1L 500 mL 300 mL
加NaOH调pH=8.0（约需20gNaOH颗粒）
——→高压灭菌
12、氯霉素抗生素溶液
贮存液：34mg/mL，溶于乙醇，放于不透光容器-20℃保存。
工作浓度：170 μg/mL
13、SOC培养基
胰化蛋白胨（g） 20
酵母提取物（g） 5
NaCl（g） 0.5
KCl（250mmol/L） 10mL
混合后定容至1L
八、思考题
1、什么是T-载体？
2、pMD18-T载体是一种什么样载体？
3、用于基因克隆载体基本特性均有那些？
4、为什么选取16℃进行连接反映，而不选取连接酶最适作用温度37℃？
5、什么是感受态细胞？
6、对于感受态细胞两种解释是什么？
7、什么叫重组子？
8、分子在转化过程中经历四个阶段是什么？
9、“蓝-白”筛选原理是什么？
10、SOC液体培养基震荡培养1～1.5h目是什么？
11、碱裂解法制备质粒DNA实验原理是什么？
12、为什么向培养细菌培养基中加入抗生素（如氯霉素）？