半抗原与蛋白质偶联技术.ppt

半抗原与蛋白质偶联技术目录抗原与半抗原偶联蛋白人工抗原合成的方法影响人工抗原质量的因素人工抗原的质量评定抗原与半抗原抗原抗原抗原 能与淋巴细胞抗原受体能与淋巴细胞抗原受体（TCR/BCR）特异性结合，刺激机体产）特异性结合，刺激机体产生特异性免疫应答，并与相应免疫应答产生特异性免疫应答，并与相应免疫应答产物（指抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外物（指抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合反应的物质。发生特异性结合反应的物质。抗原的分类天然抗原天然抗原 如：细菌、病毒、真菌、寄生虫等。如：细菌、病毒、真菌、寄生虫等。人工抗原人工抗原 如：人工结合抗原、人工合成抗原、如：人工结合抗原、人工合成抗原、基因工程抗原基因工程抗原常见的天然抗原-细菌链球菌链球菌链球菌链球菌痢疾杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌霍乱弧菌霍乱弧菌霍乱弧菌霍乱弧菌伤寒杆菌伤寒杆菌伤寒杆菌伤寒杆菌常见的天然抗原-病毒狂犬病病毒狂犬病病毒狂犬病病毒狂犬病病毒腺病毒腺病毒腺病毒腺病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒常见的其他天然抗原真菌真菌真菌真菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌(1,000X oil)(1,000X oil)疟原虫疟原虫疟原虫疟原虫常见的其他天然抗原 异种动物血清异种动物血清 异嗜性抗原异嗜性抗原 血型抗原血型抗原 主要组织相容性抗原主要组织相容性抗原 肿瘤抗原肿瘤抗原超抗原超抗原人工抗原人工抗原 人工结合抗原人工结合抗原 将无免疫原性的简单将无免疫原性的简单化学基团化学基团与与蛋白质载体蛋白质载体偶联，或将无免疫原性的有机偶联，或将无免疫原性的有机分子与蛋白质载体结合，形成分子与蛋白质载体结合，形成载体载体-半抗原半抗原结合物结合物，均属人，均属人工结合抗原工结合抗原。人工抗原人工抗原 人工合成抗原人工合成抗原 用化学方法将用化学方法将活化氨基酸活化氨基酸聚合，聚合，使之成为使之成为合成多肽合成多肽。（应用这种人工合成。（应用这种人工合成多肽可研究氨基酸多肽可研究氨基酸种类、序列种类、序列与蛋白质抗与蛋白质抗原性及免疫原性的关系。）原性及免疫原性的关系。）人工抗原人工抗原基因工程抗原基因工程抗原通过基因重组、再表达制备的抗原物质。通过基因重组、再表达制备的抗原物质。如：目的基因（如：目的基因（编码编码抗原）抗原）+载体（质粒等）载体（质粒等）重组重组DNA DNA 细胞（真核或原核）细胞（真核或原核）表表达达 纯化纯化 基因工程疫苗基因工程疫苗抗原的性质1.1.免疫原性：免疫原性：抗原刺激机体产生特异性抗原刺激机体产生特异性免疫应答免疫应答，诱生相应诱生相应抗体抗体和和效应淋巴细胞效应淋巴细胞的能力。的能力。2.2.抗原性抗原性:抗原可在体内、外与相应的抗体抗原可在体内、外与相应的抗体/效应效应淋巴细胞发生特异性结合，产生淋巴细胞发生特异性结合，产生免疫应答免疫应答的特性。的特性。抗原抗原（按照免疫原性及免疫反应性）（按照免疫原性及免疫反应性）分类1 1、完全抗原、完全抗原 :既有免疫原性又有抗原性的既有免疫原性又有抗原性的物质，如多数蛋白质分子。物质，如多数蛋白质分子。2 2、半抗原、半抗原:又称不完全抗原，单独存在时只又称不完全抗原，单独存在时只具有抗原性而无免疫原性的物质，如二硝具有抗原性而无免疫原性的物质，如二硝基酚、青霉素。基酚、青霉素。完全抗原半抗原与载体结合后可使其具有免疫原性。半抗原与载体结合后可使其具有免疫原性。半抗原半抗原+载体载体 完全抗原完全抗原半抗原+载体载体抗体抗体BT完全抗原完全抗原BBBT常见的偶联蛋白常见的偶联蛋白常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有：常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有：牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA)(BSA)、卵清蛋白卵清蛋白(OA)(OA)、钥孔血蓝蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)(KLH)、人血清白蛋白人血清白蛋白(HSA)(HSA)人工合成的多聚赖氨酸人工合成的多聚赖氨酸(PLL)(PLL)等。等。常见的偶联蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白（BSABSA）包含包含583583个氨基酸残基，个氨基酸残基，分子量为分子量为66.43kDa66.43kDa，等电点为等电点为4.74.7。BSABSA结构结构常见的偶联蛋白卵清蛋卵清蛋ovalbvminovalbvmin 是一种糖蛋白。是一种糖蛋白。含有微量的磷。含有微量的磷。是卵清中蛋白质是卵清中蛋白质的主要成分，约的主要成分，约占占6565。鸡的卵清蛋白分鸡的卵清蛋白分子量约子量约45kDa45kDa。a.牛血清白蛋白b.磷酸酪氨酸血清白蛋白c.卵清蛋白d.磷酸酪氨酸卵清蛋白常见的偶联蛋白钥孔血蓝蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)(KLH)由于由于KLHKLH质量大，质量大，复杂性高，与其他载复杂性高，与其他载体蛋白相比体蛋白相比KLHKLH会引起会引起更强的免疫应答。更强的免疫应答。来源于软体动物，来源于软体动物，它在系统发生上远离它在系统发生上远离哺乳动物物种，在测哺乳动物物种，在测定过程中产生会与定过程中产生会与典典型靶点型靶点样品发生交叉样品发生交叉反应的抗体的可能性反应的抗体的可能性较小。较小。常见的偶联蛋白 人血清白蛋白人血清白蛋白（简称（简称HSAHSA），是），是人血浆中的蛋白人血浆中的蛋白质，其非糖基化质，其非糖基化的单链多肽包含的单链多肽包含585585个氨基酸，分个氨基酸，分子量为子量为66kD66kD。在。在血浆中其浓度为血浆中其浓度为42g/L42g/L，约占血浆，约占血浆总蛋白的总蛋白的60%60%。常见的偶联蛋白 -多聚赖氨酸是多聚赖氨酸是目前天然防腐剂中目前天然防腐剂中具有优良防腐性能具有优良防腐性能的微生物类食品防的微生物类食品防腐剂。它是由腐剂。它是由2530赖氨酸残基聚合赖氨酸残基聚合而成，具有强烈的而成，具有强烈的抑菌能力，可以作抑菌能力，可以作为防腐剂用于食品为防腐剂用于食品的保鲜。的保鲜。偶联蛋白的性质 载体表面应首先应具有载体表面应首先应具有化学活性基团化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，这是化学偶联制备抗原的前提；联，这是化学偶联制备抗原的前提；其次，载体应具备一定的容量，可以其次，载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子；偶联足够的分子；载体还应该是惰性的，不应干扰偶联载体还应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能；分子的功能；而且载体应具有足够的稳定性，且应而且载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。该是廉价易得的。人工抗原合成方法人工抗原合成方法 小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到到偶联物偶联物的的浓度浓度及其及其相对比例相对比例、偶联剂偶联剂的的有效浓度有效浓度及其及其相对量相对量、缓冲液缓冲液成分成分及其及其纯纯度度和和离子强度离子强度、pHpH以及以及半抗原半抗原的的稳定性稳定性、可溶性可溶性和和理化特性理化特性等因素的影响。等因素的影响。一般是由一般是由半抗原半抗原上的上的活性基团活性基团决定偶决定偶联合成的方法。联合成的方法。半抗原上的活性基团半抗原上的活性基团人工抗原合成方法人工抗原合成方法1 1、分子中含有、分子中含有羧基羧基或者或者可羧化可羧化的半抗原的偶的半抗原的偶联联A A、混合酸酐法、混合酸酐法 。B B、碳化二亚胺法。、碳化二亚胺法。C C、N-N-羟琥珀酰亚胺酯法羟琥珀酰亚胺酯法 混合酸酐法交联原理混合酸酐法交联原理混合酸酐法交联原理混合酸酐法交联原理碳化二亚胺法交联原理碳化二亚胺法交联原理碳化二亚胺法交联原理碳化二亚胺法交联原理碳化二亚胺法交联原理碳化二亚胺法交联原理人工抗原合成方法2 2、含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联、含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联l1 1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiffschiff键键(-N=C(-N=C，在半抗原和蛋白质间引入一个，在半抗原和蛋白质间引入一个5 5碳桥。这一反应碳桥。这一反应条件温和，可在条件温和，可在4 44040及及pH6.0pH6.08.08.0内进行，操内进行，操作亦简便，因此应用广泛。作亦简便，因此应用广泛。l2 2）重氮化法：用于活性基团是）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基芳香胺基的半抗原，的半抗原，芳香胺基与芳香胺基与NaNO2NaNO2和和HClHCl反应得到一个重氮盐，它反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上酪氨酸羧基的邻位上，形成一，形成一个偶氮化合物。个偶氮化合物。戊二醛法合成人工抗原的原理戊二醛法合成人工抗原的原理盐酸克伦特罗重氮化反应原理盐酸克伦特罗重氮化反应原理人工抗原合成方法3 3、含羟基半抗原的偶联、含羟基半抗原的偶联l1 1）琥珀酸酐法；）琥珀酸酐法；l2 2）羰基二咪唑法。）羰基二咪唑法。人工抗原合成方法4、含巯基半抗原的偶联 1)马来酰亚胺法。2)将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。影响人工抗原质量的因素影响人工抗原质量的因素 偶联比 过去人们认为，联接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多。但实验证明，过多的半抗原并不能得到预期的结果，这是因为载体上覆盖的半抗原分子过多时，可能不利于载体与淋巴细胞表面结合，不能使载体引起免疫反应。研究发现各种载体的分子量不论是否接近，最佳结合比都不尽相同，并建议为了取得最佳免疫效果，应逐个确定各种载体的最佳结合比。影响人工抗原质量的因素偶联桥有研究者认为，一定长度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所产生抗体专一性的增强但也有一些研究者发现，手臂结构对免疫检测经常有不利的影响，有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强，对待测小分子亲和力却很弱，因此造成对特异性抗体检测的干扰。可以采取两种方法来避免因偶联桥而造成的不足：一是半抗原上相同位点结合蛋白质，但免疫原和包被抗原用不同的偶联桥；二是免疫原和包被抗原用相同的偶联桥，但与不同半抗原位点结合。最好的偶联桥是36个直链的碳原子结构。影响人工抗原质量的因素半抗原的分子空间结构用来作半抗原的分子最好有分支结构，直链分子难以产生抗体。此外，有些抗生素或农药有多个可供蛋白质偶联的位点，但据研究报道，不同位点与蛋白质结合制备的人工抗原产生的抗体效价及亲合力都有差别，这可能是因为不同位点结合导致半抗原呈现的空间结构不一样的原因。因此，如果一个分子内有多个不同的结合位点时，最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后，通过比较，筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测。半抗原的分子空间结构半抗原的分子空间结构半抗原的分子空间结构人工抗原的质量评定人工抗原的质量评定合成成功鉴定鉴定农药人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法，如果人工抗原的紫外吸收图谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱，则可初步证明人工抗原合成成功。紫外分光光度法测定人工抗原偶联质量紫外分光光度法测定人工抗原偶联质量人工抗原的质量评定浓度测定人工抗原的绝对含量常以蛋白质的相对浓度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg）。因此测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含量（mg/ml）是一致的。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法等。人工抗原的质量评定纯度鉴定 利用吸附与分配层析和利用吸附与分配层析和电泳技术电泳技术可鉴可鉴定人工抗原的偶联的纯度。如果电泳图谱定人工抗原的偶联的纯度。如果电泳图谱上只出现一条电泳带，则表明人工抗原达上只出现一条电泳带，则表明人工抗原达到电泳纯，否则说明人工抗原中含有未偶到电泳纯，否则说明人工抗原中含有未偶联的物质。联的物质。利用电泳技术鉴定人工抗原偶联的纯度利用电泳技术鉴定人工抗原偶联的纯度人工抗原的质量评定偶联比的测定分光光度法如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm(蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收，如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm，则与蛋白质肽的吸收发生重叠)，则可根据蛋白质及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数，计算出结合到每个蛋白质分子上的半抗原分子数偶联比例的计算偶联比例的计算（以（以-为例）为例）人工抗原的质量评定（同位素）标记抗原示踪法（同位素）标记抗原示踪法在制备半抗原在制备半抗原-蛋白质结合物时，向反蛋白质结合物时，向反应液中同时加入一定量的应液中同时加入一定量的标记半抗原标记半抗原，反，反应完成后，未结合的半抗原经透析除去，应完成后，未结合的半抗原经透析除去，测定透析前后的测定透析前后的放射性强度放射性强度，就可以计算，就可以计算出出结合百分比结合百分比。再依反应时加入的蛋白质。再依反应时加入的蛋白质摩尔数摩尔数即可知半抗原结合到蛋白质上的即可知半抗原结合到蛋白质上的分分子数子数。