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生化笔记完全版-DNA复制和修复生物体遗传信息储存在DNA中，并通过DNA复制由亲代传给子代。在子代生长发育中遗传信息自DNA转录给RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后裔体现出与亲代相似遗传性状。1958年，F.Crick提出中心法则：（1）以原DNA分子为模板，合成出相似DNA分子过程。（2）以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列相应RNA分子过程。（3）以mRNA为模板，依照三联密码规则，合成相应蛋白质过程。中心法则揭示了生物体内遗传信息传递方向。 图DNA生物合成有两种方式：DNA复制和反转录DNA体内复制涉及：原核、真核生物染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状）DNA体外复制：分子克隆。第一节 DNA复制一、 DNA半保存复制1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋构造模型时就推测DNA也许按照半保存机制进行自我复制。P321 图191 Watson和Crick提出DNA双螺旋复制模型在复制过程中，一方面亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补子代链，成果新形成两个子代DNA与亲代DNA分子碱基顺序完全同样，并且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA，另一条是新合成。1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli. DNA，证明了DNA复制是半保存复制。P322 图19-2 DNA半保存复制。1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下初次观测到完整正在复制E. coli. 染色体DNA。P323 图 19-33H-脱氧胸苷标记E.coli. DNA ，通过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将E.coli. DNA转至膜上，干燥，压感光胶片，3H放出粒子，还原银，在光学显微镜下观测。用这种办法证明了大肠杆菌染色体DNA是一种环状分子，并以半保存形式进行复制。DNA半保存复制可以阐明DNA在代谢上稳定性。通过多代复制，DNA多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后裔而不被分解掉。二、 复制起点、单位和方向DNA复制是在起始阶段进行控制，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完毕复制。1、 复制起点复制起点是以一条链为模板起始DNA合成一段序列。有时，两条链复制起点并不总是在同一点上（如D环复制）。在一种完整细胞周期中，每一种复制起点只使用一次，完毕一次复制过程。多数生物复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）区段，即经常开放区段，富含A.T。环状DNA复制起点拟定办法P325 图19-6复制起点克隆和功能分析重组质粒转化法大肠杆菌复制起点oriC区1Kb重组质粒在转化子中复制行为与其染色体同样，受到严密控制，每个细胞只有1-2个拷贝，用核酸外切酶缩短oriC克隆片段大小，最后得到245bp基本功能区，携带它质粒依然可以自我复制，拷贝数可以增长到20以上，这阐明发动复制序列在245bp基本功能区，而决定拷贝数序列在基本功能区之外和1Kb之间。鼠伤寒沙门氏菌起点位于一段296bpDNA片段上，与大肠杆菌复制起始区有86%同源性，并且有些亲缘关系较远细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因而，复制起始区构造也许是很保守。起始序列具有一系列对称反向重复和某些短成簇保守序列。2、 复制单位复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制单位，每个复制子都具有一种复制起点。原核生物染色体和质粒、真核生物细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一种固定起点开始复制，复制方向大多数是双向，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链复制）。环状DNA复制眼象，称形复制。真核生物染色体DNA是线形双链分子，具有许多复制起点，因而是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体具有1000个复制子。病毒DNA各种各样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。3、 复制方向定点起始，复制方向大多数是双向（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一种复制叉。用放射自显影实验判断DNA复制方向及速度低放射性3H-脱氧胸苷 高放射性3H-脱氧胸苷a. 单向b. 双向等速 三种成果图形c. 双向异速E.coli.一种温度敏感株，在42时，能使DNA在完毕复制后，不再开始新复制过程，而在25时复制功又能能恢复。4、 DNA几种复制方式（1）、 直线双向复制单点，双向，T7多点，双向，真核染色体DNA（2）、 型复制：环状双链DNA，单向或双向（E .coli.）（3）、 滚环复制：环状单链DNA，x174（4）、 D环复制：线粒体、叶绿体DNA（5）、 多复制叉复制：第一轮复制尚未完毕，复制起点就开始第二轮复制。在E.coli.富营养时，可采用多复制叉复制方式。E.coli. DNA复制最快可达50Kb/min，完全复制需40min，富营养时，20min分裂。而真核染色体要6-8小时。三、 与DNA复制关于酶及蛋白质因子当前已发现30各种酶及蛋白质因子参加DNA复制（一） DNA聚合反映和聚合酶DNA生物合成5，3，化学合成3，5，1、 DNA聚合反映必备条件 DNA聚合酶 DNA模板(反转录时用RNA模板)引物 (DNA、RNA或蛋白质) 4种dNTP Mg2+2、 聚合反映过程及特点总反映式：n1dATP DNA pol . dAMPn2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）PPin3dCTP Mg2+ dCMPn4dTTP dTMPP329 图19-10 P330图19-11在链延长过程中，链游离3，-羟基，对进入脱氧核糖核苷三磷酸磷原子发生亲核袭击，生成3，.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。DNA聚合酶反映特点： 以4种dNTP为底物 反映需要接受模板指引，不能催化游离dNTP聚合。 反映需有引物3，-羟基存在 链生长方向5， 3， 产物DNA性质与模板相似3、 由DNA聚合酶催化几种DNA聚合类型 P331图19-12 （1） 发荚环构造：加入单链DNA作为模板和引物，3羟基端回折成引物链。（2） 末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3末端突出作为模板。（3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。（4） 环形聚合：加入带引物环形DNA作为模板。4、 E.coli DNA聚合酶（1）、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg酶，400 copy/cell）单体酶，分子量109Kd，含一种Zn2+，每个细胞中含400个DNA pol.催化活性：5， 3， 聚合活性3， 5， 外切活性5， 3， 外切活性用蛋白水解酶将DNA pol.某些水解可得：大片段（Klenow），75Kd，活性：5， 3，聚合活性、3， 5，外切活性。小片段，36Kd，活性：5， 3，外切活性（只作用于双链DNA碱基配对某些，切除修复）。Klenow片段用途：a 补齐DNA 3，隐缩未端b. 标记DNA片段未端ccDNA合成第二链 dd DNA测序（2）、 E.coli. DNA Pol.（100 copy/cell）单体酶，分子量120Kd催化活性：5， 3，聚合(活性很低) 3， 5，外切也许在DNA修复中起某中作用。（3）、 E.coli.DNA pol.（复制酶，10-20 copy/cell）寡聚酶，全酶由10种共22个亚基构成，、和三种亚基构成核心酶。P334表10-3DNA pol.是合成新链DNA重要酶，又称复制酶(Replicase)Pol.5，3，外切酶活性只作用于单链DNA。P334 表19-2 E.coli三种DNA聚合酶性质比较DNA聚合酶有6个结合位点 模板DNA结合位点 引物结合位点 引物3，-OH位点、反映位点 底物dNTP结合位点 5， 3， 外切位点(pol.没有) 3， 5， 外切位点(校正)5、 真核生物DNA聚合酶P334 表19-4 真核生物DNA聚合酶真核DNA聚合酶普通不具备外切活力，也许由此外酶在DNA复制中起校正功能。 DNA聚合酶，多亚基，功能与E.coli. pol.类似，是真核DNA复制酶。 DNA聚合酶，重要在DNA损伤修复中起作用。 DNA聚合酶，从线粒体得到，也许与线粒体DNA复制关于。 DNA聚合酶，特点：有3， 5，外切活力。（二） 引物酶或RNA聚合酶（引起酶）细胞内，DNA复制需要引物（DNA或RNA），引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基RNA引物。DNA复制为什么要用RNA引物？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？）P338从模板复制最初几种核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配新复制最初几种核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶5，3，校对功能难发挥作用。（三） 解螺旋酶大肠杆菌解螺旋酶、与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。解螺旋酶I、II、III沿着模板链53方向随着复制叉迈进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿35方向移动。（四） DNA旋转酶属DNA拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制叉迈进时带来扭曲张力。拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生物和真核生物。拓扑异构酶I使DNA一条链发生断裂和再连接，反映不必供应能量，重要集中在活性转录区，与转录关于。拓扑异构酶使DNA两条链同步断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供应能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制关于。（五） 单链DNA结合蛋白（SSB）复制叉上解螺旋酶，沿双链DNA迈进，产生单链区，大量单链DNA结合蛋白与单链区结合，制止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。（六） DNA连接酶（ligase）连接双链DNA上切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNA ligase即可连接粘性末端DNA，又可连接平齐末端双链DNA。E.coli.和其他细菌DNA ligase以NAD为能源，动物细胞和噬菌体DNA ligase以ATP为能源。（七） DNA复制拓扑构造P338-339四、 DNA半不持续复制P336 图19-15 DNA半不持续复制DNA聚合酶催化方向是5，3，。前导链：滞后链：1968年，发现冈崎片段。长度：细菌：1Kb-2Kb，相称于一种顺反子大小。真核：100-200bp，约等于一种核小体DNA长度。五、 DNA复制过程（E.coli.）P342 图19-17 大肠杆菌复制体构造示意图1、 复制起始引起：当DNA双螺旋解开后，合成RNA引物过程。引起体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、nnI）构成复合体，负责RNA引物合成。引起体沿着模板链53方向移动（与冈崎片段合成方向正好相反，而与复制叉移动方向相似），移到一定位置上即可引起RNA引物合成。E.coli.DNA复制原点ori C，由245bp构成，三组13bp重复序列（近5，端处），四组9 bp重复序列（另一端处）。图大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：DNaA 在原点处打开双螺旋DNaB 使DNA解旋DNaC DNaB结合在原点所需Hu 刺激起始引物酶（DNaG） 合成RNA引物SSB 结合单链DNARNA聚合酶 增进DNaA活性旋转酶 松驰DNA扭曲应力20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。DnaB（在DnaC协助下）与开放复合物结合，进一步解链。2、 DNA链延长反映前导链只需要一种RNA引物，后随链每一种冈崎片段都需要一种RNA引物，链延长反映由DNA pol.催化。复制体：在DNA合成生长点（既复制叉上）分布着许多与复制关于酶和辅助因子，它们在DNA模板链形成离散复合物，彼此配合进行高度精准复制，称为复制体。复制体沿着复制叉方向迈进就合成DNA。3、 RNA引物切除及缺口补齐DNA pol5， 3，外切活力，切除RNA引物。DNApol5， 3，合成活性补齐缺口。4、 DNA切口连接DNA ligase，动物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。5、 DNA合成终结环状DNA、线性DNA，复制叉相遇即终结。u 小结： DNA解螺旋酶解开双链DNA。 SSB结合于DNA单链。 DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉迈进时带来扭曲张力。 DNA引物酶(在引起体中)合成RNA引物。 DNA pol.在两条新生链上合成DNA。 DNA pol切除RNA引物，并补上DNA。 DNA ligase连接一种冈崎片段。DNA复制过程中，聚合酶对dTTP和dUTP辨别能力高,有少量dUTP掺入DNA链中，此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNA pol、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上对的碱基。六、 真核生物DNA复制 P3431、 复制起点和单位真核生物染色体DNA是多复制子，有各种复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp之间，比细菌染色体DNA（单复制子）小得多。实验证据：5-氟脱氧胞苷标记真核生物DNA复制叉移动速度此原核慢，如哺乳动物复制叉移动速度每分钟1-3Kb，细菌每分钟5Kb。真核生物染色体所有复制完毕前，起点不再从新开始复制。而在迅速生长原核生物中，起点可以持续发动复制。真核生物在迅速生长时，可采用更多复制起点同步复制。如黑腹果蝇，初期胚胎细胞中相邻复制起点平均距离为7.9kb，而在培养成体细胞中，平均距离为40kb，成体细胞只运用一某些复制起点。2、 复制过程中组蛋白装配核小体构造（200bp左右）在真核生物复制子上，亲代染色体核小体被逐个打开，组蛋白以完整八聚体形式直接转移到子代DNA前导链上，新合成组蛋白与后随链组装成核小体。因而，DNA复制是半保存，而组蛋白则是全保存。实验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观测3、 真核生物DNA复制终结端粒：一段DNA序列与蛋白质形成一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有构造。功能：保证线性DNA完整复制保护染色体末端决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。端粒（telomeres）分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约100bp重复序列，形式为：5，（TxGy）n3，(AxCy) n，x和y普通为14。端粒末端重复序列，通过端粒酶（telomerase）将其加到染色体末端。端粒酶具有RNA和蛋白质（起DNA聚合酶作用）两种组分，RNA分子约159b，具有各种CyAx重复序列，RNA分子用作端粒TxGy链合成模板。端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身RNA模板互补DNA片段。人类体细胞端粒长度，随个体年龄增长而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至1-4Kbp时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。杂交 图聚合 图转位再杂交 图进一步聚合 图非原则GG配对 图 七、 DNA复制调控八、 DNA复制真实性杨岐生P144生物体DNA复制具备高度真实性，复制107-1011碱基对,只有一种错误碱基。碱基对自由能普通在4-13KJ/mol，这样自由能相称于平均参入100个核苷酸就也许浮现一次错配，仅靠Watson-Crick双螺旋碱基配对原则，突变率将高达10-2 。1、 DNA聚合酶对碱基选取作用酶被动论：不同核苷酸在聚合位点停留时间不同，对的dNTP能长时间停留，而参加聚合。DNA聚合酶能依照模板核苷酸，选取对的dNTP掺入引物末端。酶积极参加理论：DNA聚合酶对对的与错误核苷酸，不但亲和性不同，并且将它们插入DNA引物端速度也不同。动力学校正阅读：在新磷酸二酯键未形成时，dNTP结合在酶与模板引物复合物聚合位点上，DNA聚合酶能辨认对的与错误dNTP。DNA聚合酶对底物辨认作用，DNA聚合酶有两种底物，一种是DNA模板引物，另一种是dNTP。DNA聚合酶先辨认DNA模板和引物3，未端，再辨认底物dNTP，是一种有序辨认过程。2、 3，5，外切活性校正阅读E. coli. DNA pol.和pol.有3，5，外切活性，可删除错误插入核苷酸。缺失3， 5，外切活性E. coli. DNA pol.，催化DNA合成时，浮现错误几率增高5-50倍。因而，3，5，外切活性可以使DNA复制真实性，提高1-2个数量级。 图3、 影响DNA合成真实性因素 高浓度NMP(如3，-AMP，5，-GMP) NMP竞争酶dNTP结合位点，抑制3，5，外切活性。 某一种dNTP浓度银高,可使引物3，末端离开外切活性中心。 dNTP 普通与二价阳离子结合成活化形式，Mg2+为重要二价阳离子。当用其他二价阳离子（如Mn2+）代替Mg2+时，会变化酶主体构造，影响聚合活性和3，3，外切活性。4、 为什么用RNA引物从模板复制最初几种核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配新复制最初几种核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶5，3，校对功能难发挥作用。第二节 DNA损伤及修复DNA损伤，罗纪盛P428某些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤，破坏其构造与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT），两个T以共价键形成环丁烷构造。CT、CC间也可形成少量二聚体（CT、CC），使复制、转录受阻。P346图19-22细胞内具备一系列起修复作用酶系统，可以除去DNA上损伤，恢复DNA双螺旋构造。当前已知有4种酶修复系统：光复活、切除修复、重组修复、SOS反映诱导修复，后三种不需要光，又称为暗修复。一、 光复活1949年已发现光复活现象，可见光（最有效400nm）可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。P347 图19-23 紫外线损伤光复活过程A 形成嘧啶二聚体 B. 光复合酶结合于损伤部位 C 酶被可见光激活 D. 修复后释放酶二、 切除修复P348 图19-24 DNA损伤切除修复过程在一系列酶作用下，将DNA分子中受损伤某些切除，并以完整那一条链为模板，合成出切去某些，DNA恢复正常构造。I、构造缺陷修复：（1）核酸内切酶辨认DNA损伤部位，在其附近将其切开。（2）核酸外切酶切除损伤DNA。（3）DNA聚合酶修复。（4）DNA连接酶连接。 图II、无嘌呤无嘧啶碱基缺陷或错配脱碱基（N-糖苷酶）：甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第7位氮原子烷基化，活化糖苷键，导致脱嘌呤作用；酸也能使DNA脱嘌呤。DNA复制时，DNA聚合酶对dTTP和dUTP辨别力不高，有少量dUTP掺入DNA链。细胞中尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤时也可以被次黄嘌呤-N-糖苷酶切掉次黄嘌呤。对于无嘌呤无嘧啶损伤有两种修复办法：（1） AP核酸内切酶切开，核酸外切酶切除，DNA聚合酶修复，DNA连接酶连接。（2） 插入酶插入对的碱基三、 重组修复P349图1925重组修复过程切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制潮流未修复损伤部位，可以先复制，再重组修复。在重组修复过程中，DNA链损伤并未除去。重组修复至少需要4种酶组分。重组基因recA编码一种分子量为40000蛋白质，它具备互换DNA链活力。RecA蛋白被以为在DNA重组和重组修复中均起核心作用。recB、recC基因分别编码核酸外切酶V两个亚基。此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。四、 诱导修复和应急反映（SOS反映）诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制紧急状况下，为求得生存而浮现一系列诱导性修复。SOS反映诱导修复系统涉及避免差错修复（无差错修复）和倾向差错修复。避免差错修复：SOS反映能诱导光复活切除修复和重组修复中某些核心酶和蛋白质产生，从而加强光复活切除修复和重组修复能力，这属于避免差错修复。倾向差错修复：SOS反映还能诱导产生缺少校对功能DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高突变率，这属于倾向差错修复。SOS反映是由RecA蛋白和LexA阻遏物互相作用引起。RecA蛋白不但在同源重组中起重要作用，并且它也是SOS反映最初发动因子。在有单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活而体现出蛋白水解酶活力，它能分解噬菌体阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd）许多基因阻遏物，当它被RecA蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中涉及紫外线损伤修复基因uvrA、uvrB、uvrC（分别编码核酸内切酶亚基）以及recA和lexA基因自身，尚有单链结合蛋白基因ssb，与噬菌体DNA整合关于基因himA、与诱变作用关于基因umuDC，与细胞分裂关于基因sulA，ruv，和lon，以及某些功能不清晰基因dinA，B，D，F等。SOS反映广泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在极为不利环境中求得生存一种基本功能。然而癌变有也许也是通过SOS反映导致，由于能引起SOS反映作用剂普通都具备致癌作用，如X-射线，紫外线，烷化剂，黄曲霉素等，而某些不能致癌诱变剂并不引起SOS反映，如5-溴尿嘧啶。当前，关于致癌物某些简便检测办法就是依照SOS反映原理而设计，既测定细菌SOS反映。第三节 RNA指引DNA合成（反转录）反转录（reverse transcription）：以RNA为模板，合成DNA。与普通转录过程中遗传信息流从DNA到RNA方向相反。1970年，Temin 和Baltimore分别从致癌RNA病毒（劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中发现发反转录酶。致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其他肿瘤病毒。此类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。通过改造后可以作为基因治疗载体。放线菌素D（抑制以DNA为模板反映，复制和转录）能抑制致癌RNA病毒复制，可见致癌RNA病毒复制过程必然涉及DNA。Bader 用嘌呤霉素（puromycin）来抑制静止细胞蛋白质合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒（RSV），证明反转录酶是由反转录病毒带入细胞，而不是感染后在宿主细胞中新合成。一、 反转录酶由一种亚基和一种亚基构成，具有Zn2+，具备三种酶活力。（1）RNA指引DNA聚合酶活力（以RNA为模板，合成一条互补DNA，形成RNADNA杂种分子）。（2）RNase H酶活力，水解RNADNA杂种分子中RNA，可沿35和53两个方向起外切酶作用。（3）DNA指引DNA聚合酶活力。模板：RNA或DNA以自身病毒类型RNA为模板时，该酶反转录活力最大，但是带有恰当引物任何种类RNA都能作为合成DNA模板。引物：RNA或DNA底物：dNTP二价阳离子：Mg2+或Mn2+真核mRNA3端有polyA，加入oligo dT后，可以作为反转录酶模板，合成cDNA。二、 病毒RNA反转录过程所有已知致癌RNA病毒都具有反转录酶，因而被称为反转录病毒（retrovirus），反转录病毒复制需要通过一种DNA中间体（前病毒）。1、 反转录病毒基因组构造P353 图19-27（1） 反转录病毒基因组普通由两条相似（+）RNA链构成。5端附近区域以氢键结合在一起，全长7-10Kb。（2） 每一条RNA链两端具备相似序列，形成正向重复序列。（3） 5端有帽子构造，3端有polyA，与真核mRNA相似。（4） 5端带有1分子宿主tRNA，作为反转录时引物。某些鸟类反转录病毒携带是tRNAtrp，鼠类是tRNApro2、 反转录过程。当致癌RNA病毒侵染宿主细胞时，病毒RNA及反转录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入反转录酶使RNA反转录成双链DNA。（1） 以病毒（+）RNA为模板，合成互补（-）DNA。（2） 切除RNADNA杂种分子中RNA。（3） 以（-）DNA链为模板，合成（+）DNA链，最后形成两端带有LTR（长末端重复序列）双链DNA。反转录病毒只有整合到宿主染色体DNA后才干被转录，转录产物经拼接可以产生不同病毒mRNA。LTR（长末端重复序列）对前病毒DNA整合到宿主染色体DNA以及整合后转录均起着重要作用。反转录病毒合成过程：图缺口模板（基因组）RNA，在U3旁生成一种正链DNA合成RNA引物，而别的模板RNA被降解。正链DNA合成开始，复制。 图3、 反转录病毒生活周期 P354 图19-29（1） 病毒粒子侵染细胞，病毒RNA和反转录酶一起进入细胞。（2） RNA被反转录成双链DNA（前病毒），环化，进入细胞核。（3） 反转录病毒DNA整合到宿主染色体DNA中。（4） 前病毒DNA进行复制，转录出功能基因、基因组RNA和病毒蛋白。（5） 基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。三、 反转录生物学意义。1反转录酶存在于所有致癌RNA病毒中，它存在与RNA病毒引起细胞恶性转化关于。2艾滋病毒（AIDS）人类免疫缺陷病毒（HIV），也是一种反转录病毒，重要感染T4淋巴细胞和B淋巴细胞。病毒粒子直径100nm，球状，粒子外包被两层脂质质膜，膜上有糖蛋白（gp120、gp41），另有两层衣壳蛋白p24、p18。HIV基因组由两条单链正链RNA构成，每个链长9.7kb，RNA 5，端有帽子构造，3端有PolyA，链上结合有反转录酶。3乙肝病毒 大蛋白、中蛋白、主蛋白（表面抗原） 核心抗原 双链环状DNA 乙肝病毒与反转录病毒区别：P355 4、真核生物正常细胞内也存在反转录过程真核生物谈色体基因组中存在为数众多逆假基因和逆基因。逆假基因：无启动子和内含子，但有polyA残基，推测是由mRNA反转录后整合到基因组中去。逆基因：具备启动子和转录功能，无内含子。也许是由于mRNA反转录后刚好整合到启动子下游处，或者是带启动子RNA序列反转录后整合到基因组中第四节 DNA合成技术一、 cDNA合成1、 cDNA文库构建cDNA：以mRNA为模板，用反转录酶合成第一链，去除mRNA，合成第二链。cDNA文库是获得真核构造基因最佳办法，成熟mRNA无内含子。（1）、 真核mRNA分离纯化特点：含量少，不均一，表达具备发育阶段性和组织特异性。总RNA： rRNA 8085% mRNA 15% tRNA及其他小分子RNA 1015%不均一：在15%mRNA中，有1000030000种mRNA。分离、纯化：用Oligo dT纤维素柱（亲和层析法），加入总RNA，高盐洗脱，先流出非mRNA，减少盐浓度，加入Oligo dA竞争，可洗出mRNA 混合物。免疫法可分离特定mRNA。（2）、 cDNA合成（反转录酶）A. 自身引物法（S1核酸酶降解法） 图Oligo(dT)15-18个核苷酸mRNA5端序列有丢失。B. 取代合成法（较惯用） 图Oliyo（dT）与mRNA3端AAA杂交作为引物，合成第一条DNA链。RNaseH在mRNA上产生各种切口。DNA pol.切口平移，DNA ligase连接，合成出第二条DNA链。T4DNA pol.切去端头RNA-DNA杂交链。C. 引物合成法可以合成全长cDNA，mRNA5端不丢失。 图（3）、 cDNA与载体连接（4）、 重组体转化（5）、 扩增、保存2、 获取特定mRNAcDNA（1）免疫法分离特定mRNA（2）PCR法二、 PCR技术（聚合酶链式反映）Polymerase chain Reaction以目基因或DNA片段为模板，在引物介导及Taq DNA聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目基因或DNA片段。它能迅速、专一地扩增所但愿得到目基因或DNA片段。1、 反映物（1）模板单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR模板，若以RNA为起始材料，则须经反转录，获得第一条cDNA后才干用于PCR。（2）Taq DNA聚合酶DNA聚合酶是进行PCR扩增核心，从水生栖热菌（Thermus aquaticns VT-1）分离出来。Taq DNA聚合酶有较好热稳定性，92.5解决130min，仍保存50%酶活性，在74活性最高，错误掺入核苷酸比率为1/7500。（3）引物引物是决定PCR成果核心，它由寡核苷酸构成，15-30个b（4）核苷酸dNTPdNTP浓度50-200umul/L。（5）镁离子Mg2+2、 PCR原理图变性 95 复性 55 延伸 72