WB的原理操作及注意项目.doc

WB原理、操作及注意事项
原理：
经过电泳区分不一样组分，并转移至固相支持物，经过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质Western印迹技术结合了凝胶电泳高分辨率和固相免疫测定特异敏感等多个特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小靶蛋白。
一、抗原选择和制备
A：样品制备
1 组织：
组织处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保留，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：
细胞处理方法： 离心搜集细胞或直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，搜集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保留，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白提取（特例）：
直接搜集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白定量方法及影响蛋白定量原因
1.双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度方法。在需要快速，但不很正确测定中，常见此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯早期阶段是很有利。双缩脲法原理是Cu2+和蛋白质肽键，和酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波优点有最大吸收。双缩脲法常见于0.5g/L～10g/L含量蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，和含有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积1m NaOH溶解沉淀蛋白质进行定量测定。
2.Lowry法：
此法是双缩脲法深入发展。她第一步就是双缩脲反应，即Cu++和蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量蛋白质溶液。其干扰物质和双缩脲法相同，而且受她们影响更大，硫醇和很多其它物质存在会使结果严重偏差。另外要注意是，加入福林试剂时要尤其小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到还原反应只有在pH10时才发生，所以，福林试剂加入到碱性Cu2+-蛋白质溶液中时，必需立即搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。
3.紫外吸收法：
大多数蛋白质在280nm波优点有特征最大吸收，这是因为蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在缘故，所以，利用这个特异性吸收，能够计算蛋白质含量。假如没有干扰物质存在，在280nm处吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量蛋白质溶液。部分纯化蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波优点有最大吸收。有核酸时，所测得蛋白质浓度必需作合适校正，通常按下述公式粗略计算：

　　是蛋白质溶液在280nm波优点（光程1厘米）测得光密度值。是蛋白质溶液在260nm小波优点（光程1厘米）处所测得光密度值。
　　　　此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来。所以，对其它蛋白质和其它核酸不一定适用。因为多种蛋白质所含芳香族氨基酸量不一样，所以，浓度为0.1%多种蛋白质在280nm处消光系数（）在0.5～2.5之间改变。
　　全部蛋白质在230nm以下全部有强吸收。比如，牛血清白蛋白α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下强吸收是因为肽键存在，所以，此值对全部蛋白质全部是一样。从215nm和225nm处光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml蛋白质。蛋白质浓度能够近似地由下式得到：
　　光密度之差求
得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成份产生误差。不过，蛋白质之间分子量差异比较大，所以，在比较多个蛋白质含量时，必需作合适校正。因为蛋白质吸收峰常因pH改变而改变，所以在制作标准曲线时，必需和样品条件一致。
4. Bradford比色法：
Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单快速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和部分碱性缓冲系统干扰。
分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20µl），以0.15mmol/l NaCl补足至100µl，同时以两管100µl0.15mmol/l NaCl作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品A595。从BSA标准曲线中确定待测样品浓度。测定10-100µg蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100µg另作一标准曲线进行测定。
5．电泳估算法（我们选择此法）：
样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，能够估算样品大约浓度。
以提取癌组织总蛋白为例：
① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷1×PBS洗涤3次，目标是去除样本中血液。
② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。
③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；
④ SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估量样品蛋白浓度。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
A：实际操作
1. 做胶前准备
1)检验是否有足够、洁净 spacer、comb 和架子。
2)检验是否有新鲜，足量10%APS，没有立即重配。
3)按将要检测抗体对应原始抗原分子量大小，计算出胶浓度，并算出分离胶各组分用量。
2. 制胶，电泳
1）装好架子。
2)根据下面配方配制分离胶。(单位：ml，Total： 8ml)

7.5％
10％
15%
2×Sep. buffer
4
4
4
30％ Gel.sol
2.0
2.7
4
ddH2O
1.9
1.2
0
TEMED
8ul
8ul
8ul
10%APS
80ul
80ul
80ul
在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶愈加好凝集。
3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，Total： 3.5ml)

3％
2×Stacking. buffer
1.7
30％ Gel.sol
0.35
ddH2O
1.4
TEMED
5ul
10%APS
50ul
倒好后插入预先准备好梳子。
4)待胶凝集好后，上样，电泳。 上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。通常电泳时间在1.5小时左右。
B ：注意事项及常碰到问题
1）分离胶不要倒太满，需要有一定浓缩胶空间，不然起不到浓缩效果。
2）上样蛋白量不应超出30ug/mm2 (载荷面即：假如你胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。
3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时轻易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或系统实际不纯或实效。
4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，造成电泳带畸形。太慢不均匀，尤其是甘油。
5）电泳中常出现部分现象：
︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。
︵ 条带呈皱眉状，可能是因为装置不适宜，尤其可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或两边聚合不完全。
拖尾：样品溶解不好。
纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。
条带偏斜：电极不平衡或加样位置偏斜。
条带两边扩散：加样量过多。
三、转移
在电流作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。
膜选择：印迹中常见固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选择PVDF（聚偏二氟乙烯），其含有愈加好蛋白吸附、物理强度，和含有愈加好化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。
A 半干法
立即凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液滤纸之间，经过滤纸上吸附缓冲液传导电流，起到转移效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，不过其转移时间短，效率高。
1 试验条件选择
电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，根据目标蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体能够依据实际合适调整。
目标蛋白分子大小(kDa)
胶浓度
转移时间(h)
80--140
8%
1.5-2.0
25---80
10
1.5
15--40
12
0.75
<20
15
0.5
2 试验操作
（1）滤纸和膜准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A. 检验是否有足够transfer buffer，没有立即配制。
B. 检验是否有适宜大小滤纸和膜。
C. 将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。
D. 将适宜靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
（2）转移
A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。通常见三层。
B. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒部分transfer buffer到膜上，保持膜湿润。
C. 将胶剥出，去掉stack gel，小心移到膜上。
D. 剪去膜左上角，在膜上用铅笔标识出胶位置。
E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。
F. 装好电转移仪，依据需要选定所需电流和时间。
G. 转移过程中要随时观察电压改变，如有异常应立即调整。
靠胶滤纸

胶
膜

靠膜滤纸

3 注意事项及常碰到问题
1）滤纸、胶、膜之间大小，通常是滤纸>=膜>=胶。
2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
3）因为膜疏水性，膜必需首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后操作中，膜也必需随时保持湿润（干膜法除外）。
4）滤纸能够反复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨情况下，能够将靠胶滤纸换新。
5）转移时间通常为1.5 小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可依据分子量大小调整转移时间和电流大小。

B 湿法
我们基础上不用此方法，这里暂不做介绍。
C 转移后效果判定
1．染胶
用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反应转移效果。
2．染膜
有两类染液选择，可逆和不可逆。可逆有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素能够被洗掉，膜能够用做深入分析用。不过不可逆染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于深入分析。
四、封闭（block）
封闭是为了使我们抗体仅仅只能跟特异蛋白质结合而不是和膜结合。
常见封闭液有bovine serum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们通常见non-fat milk。
在转移结束前配好5%Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在洁净容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过滤纸，方便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小时。

五、孵育一抗
A. 先将需要检测抗体准备好，并决定好它们稀释度。
B. 配好5%Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高百分比稀释，
最好采取梯度稀释。
C. 将稀释好抗体和膜一起孵育。 通常采取RT 1小时，可依据抗体量和膜上
抗原量合适延长或缩短时间。
注意：为了便于后面分析结果，我们通常会选择已确定分子量大小而且纯度高抗体作为marker和一抗同时孵育。

六、洗涤
用 TBST先快速洗三次，把milk立即wash掉。然后5mins *5。
洗涤是为了洗去一抗和抗原非特异性结合，洗涤效果直接影响结果背景深浅。

七、孵育二抗
孵育 RT1 小时。 通常采取HRP标识二抗，稀释百分比为1:5000。
二抗稀释百分比不能太低，不然轻易造成非特异性结合。
注意二抗选择有多个，要依据一抗来选择抗兔、抗鼠或抗羊二抗，和依据后面显色条件来选择HRP、AP或GOD（葡萄糖氧化酶）酶链二抗或标志其它探针（如核素等）。

八、洗涤
用 TBST先快速洗三次，把milk立即wash掉。 然后5mins *5。
洗涤是为了洗去二抗非特异性结合，洗涤效果直接影响结果背景深浅，所以洗涤一定要洁净。

九、显色（HRP酶）
1．增强化学发光法(ECL)
Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类关键是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常见一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）分子结构及化学反应式以下：

　　鲁米诺在免疫测定中既可用作标识物，也可用作过氧化物酶底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）作用下，发出荧光来。
试验步骤：
1）将两种显色底物1：1等体积混合（通常各1ml/membrane）。
2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇摆使均匀。
3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
4）在暗室中将X光片，覆盖在膜上面，夹好夹子，曝光1min。
5）显影、定影。
6）依据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最好结果。
注意：荧光在一段时间后会越来越弱。
2.DAB显色
DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质免疫组化染色应用尤其理想。
对于AP标识二抗我们选择BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一个不溶性黑紫色沉淀强信号。

十、分析结果及其判定
常见问题原因分析及处理方法： 见附录一、二。

附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）

附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）

附录三：试验中所用到试剂和缓冲溶液
1) 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:
Stock: to use:
20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock
10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml
250mM Tris 15.14g bromphenol blue or
total 475.00ml pyronine 4 to taste
2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix):
0.8 bis-acrylamide 0.8g
29.2% acrylamide 29.2g
total 100ml
3) 2x Laemmli Separation Buffer:
0.75M Tris-HCl 90.825g
0.2% SDS 10ml 20% SDS
total 1000ml
pH8.8
4) 2x Laemmli Stacking Buffer:
0.25M Tris 15.14g
0.2% SDS 1g
total 500ml
pH6.8
5) 10x Laemmli Running Buffer:
250mM Tris 60.55g

1.9M Glycine 285.27g
1% SDS 20g
total 2 liters
pH8.3
6) Transfer Buffer:
48mM Tris base 5.81g
39mM Glycine 2.93g
0.037% SDS 0.375g
20% MeOH 200ml
total 1000ml
7) TBST:
10mM Tris-HCl， 121g
100mM NaCl
0.2% Tween-20
Total 1000ml
pH7.4
8) Coomassie Stain :
40%MeOH 400ml
10%HAc 100ml
0.1%BBR 1g Brilliant Blue R
total 1000ml
9) Destain:
30%MeOH 300ml
7.5%HAc 75ml
total 1000ml
10) 10×丽春红染液配方：
丽春红 2g
磺基水杨酸 30g
三氯醋酸 30g
total 100ml
11）DAB
DAB 50mg
0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml
30%H2O2 30-40ul
先配成2-5倍储存液，过滤后分装，-20℃避光保留，H2O2在工作液中终浓度0.01％。