重组牛IFN-ω12生物学特性及其免疫调节机制的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45，No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202209029重组牛IFN-12生物学特性及其免疫调节机制的研究安东，田其真，曹斌，刘静，周宁，吉大庆，卢炜*(江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州225300)摘要：为表达重组牛干扰素棕12(rBoIFN-棕12)，并分析该蛋白的稳定性和免疫调节机制，本研究首先从牛的肝脏基因组中扩增牛IFN-棕12基因，构建克隆载体，从克隆载体中扩增牛IFN-棕12成熟肽编码基因，并将其克隆于pET-32a载体构建了重组表达载体pET-32a-BoIFN棕12，经酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌诱导表达重组蛋白rBoIFN棕12。在不同细胞系中检测纯化后rBoIFN棕12蛋白的生物学活性，结果显示rBoIFN棕12在MDBK和PK-15细胞中对水泡性口炎病毒(VSV)具有抗病毒活性；此外，40滋g/mL的rBoIFN棕12在MDBK细胞中相对rBoIFN琢A有较低细胞毒性。经酸碱或高温处理后，rBoIFN棕12仍具有抗病毒活性。通过双荧光素酶试验在牛肺细胞(BL)中检测rBoIFN棕12蛋白对IFN信号通路中关键元件的影响，结果显示与未加rBoIFN-棕12的对照细胞相比，rBoIFN棕12能够有效激活NF-资B响应元件、ISRE结合元件和BoIFN-茁启动子调控的荧光素酶活性。通过荧光定量PCR和western blot检测rBoIFN棕12作用MDBK细胞后不同时间IFN刺激因子(ISG)的表达情况，结果显示rBoIFN棕12作用MDBK细胞后，细胞中ISG15、ISG56、Mx-1的mRNA转录水平及表达量在3 h24 h逐渐增多，Mx-1蛋白表达量在6 h24 h比未处理组增多。本研究表明牛IFN-棕12具有抗病毒和抗细胞增殖活性，细胞毒性较低，可刺激细胞中NF-资B下游ISG中的Mx1、ISG15、ISG56的表达，并能启动细胞中NF-资B、ISRE、BoIFN-茁启动子激活的荧光素酶活性，具有典型I型IFN的特征，可作为有效的抗病毒药物，为牛IFN-棕系统的进一步研究提供思路。关键词：牛；IFN-棕12；分子特征；抗病毒活性；干扰素刺激基因中图分类号：S852.4文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)07-0737-07Biological characterization and immunomodulatory mechanism ofrecombinant bovine interferon-omega12AN Dong,TIAN Qi-zhen,CAO Bin,LIU Jing,ZHOU Ning,JI Da-qing,LU Wei*(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China)Abstract:A novel bovine IFN-棕12 was cloned and expressed,the protein stability and biological activity were analyzed inthis study.Firstly,bovine IFN-棕12 gene was cloned from bovine liver genome and clonal vector was constructed.BovineIFN-棕12 mature peptide encoding gene was amplified from clonal vector,and the prokaryotic expression vector pET-32a-BoIFN棕12 was constructed,then prokaryotic expression vector pET-32a-BoIFN棕12 was constructed,and the recombinant vectorwas transformed intoto express the fusion protein rBoIFN棕12.The biological activity of the purified protein was detected indifferent cell lines.Results showed that rBoIFN棕12 had antiviral activity against VSV on MDBK cells and PK-15 cells.Inaddition,rBoIFN棕12 at 40滋g/mL was less cytotoxic on MDBK cells than rBoIFN琢A.After acid-base treatment or hightemperature treatment,rBoIFN棕12 still showed antiviral activity.The effect of rBoIFN棕12 protein on key elements of interferon收稿日期：2022-09-30基金项目：江苏农牧科技职业学院大学生创新创业项目(202112806124Y)；江苏农牧科技职业学院课题(NSF2023ZR21)作者简介：安东(1992-)，女，河南漯河人，硕士，主要从事抗病毒天然免疫方向研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorsignaling pathway was detected by dual-luciferase assay on BL cells.The results showed that rBoIFN棕12 could effectively activatethe luciferase activity regulated by NF-资B response element,ISRE combining element and BoIFN-茁promoter.Fluorescenceguantitative PCR and western blot assay were used to detect the expression of ISGs in MDBK cells treated with rBoIFN棕12,theresults showed that the mRNA transcription and expression level of ISG15,ISG56 and Mx-1 were gradually increasing over time.The expression of Mx-1 was significantly higher than that of the untreated group.This study revealed that BoIFN-棕12 has antiviraland anti-proliferating activities with low cytotoxicity.It can stimulate the production of downstream proteins Mx1,ISG15,ISG56,and activate the luciferase activity activated by the promoter of NF-资B,ISRE,and BoIFN-茁,has the typical characteristics of type Iinterferon,which can not only be a potential candidate for a novel,effective therapeutic agent,but also facilitate further research onthe role of bovine IFN system.Key words:bovine;IFN-棕12;molecular characteristic;antiviral activity;interferon-stimulated genes棕干扰素(Interferon-棕，IFN-棕)主要由白细胞产生，是无内含子的多基因家族细胞因子，具有抑制病毒增殖、抗肿瘤和免疫调节等功能1-2。1985年由Capon、Feinstein和Hauptmann分别发现了IFN-棕，其氨基酸序列与IFN-琢氨基酸序列的同源性较高，也被称为IFN-琢3-5。成熟的IFN-琢约有166个氨基酸，IFN-棕有172174个氨基酸，IFN-棕的-COOH端比IFN-琢多了6个氨基酸6。目前，有研究报道发现人、猪、猫、牛、马、兔等哺乳动物体内存在IFN-棕，且已经有商品化的I型IFN(IFN-I)制剂用于人类、猫狗等哺乳动物的抗病毒临床治疗7-10。在机体天然免疫应答过程中，IFN的抗病毒作用并不是直接作用于病毒，而是通过与细胞表面的IFN-I受体结合，进而激活酪氨酸激酶转录因子(JAK-STAT)信号通路；直接激活干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISG)的转录、翻译与复制，以发挥抗病毒效应11。ISRE是IFN刺激应答元件，是IFN 5 UTR区的1个DNA元件，IFN与受体结合启动信号转导，刺激ISRE启动元件的激活，进而刺激IFN-I的产生，形成IFN产生的正反馈调节途径。核因子资B(NF-资B)是激活IFN-茁基因的转录因子，作为基因调节因子可促使抗病毒基因的表达，在宿主的免疫应答抑制病毒复制中起重要作用。IFN可诱导产生的细胞蛋白有300多种，其中Mx-1在病毒感染早期阶段抑制病毒基因组复制，被认为是病毒在宿主细胞内早期复制的指标12。ISG15拥有诸多的抗病毒功能，包括抑制病毒释放、裂解病毒蛋白质、免疫调节未活化的细胞因子等13。ISG56可以由IFN-I或者病毒诱导产生，对黄病毒科西尼罗河病毒具有抑制作用14-15。本研究扩增了牛IFN-棕12成熟肽编码基因，并构建该基因重组质粒pET-32a-BoIFN棕12，经大肠杆菌系统表达重组牛IFN-棕12蛋白(rBoIFN棕12)；rBoIFN棕12具有典型的IFN-I的活性、酸碱和高温稳定性、抗病毒活性及较低的细胞毒性；rBoIFN棕12能够有效激活NF-资B响应元件、ISRE结合元件和BoIFN-茁启动子，也可刺激细胞中ISG15、ISG56、Mx-1因子表达量增多，以发挥rBoIFN棕12抗病毒作用。本研究初步为新型抗病毒制剂的研制奠定了基础。1材料与方法1.1主要实验材料大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS、TG1感受态细胞和重组蛋白rBoIFN棕3、rBoIFN-琢A、牛肝脏基因组、MDBK细胞、PK-15细胞、MCDK细胞、BHK-21细胞和牛肺细胞(BL)均由本实验室保存；水泡性口炎病毒(VSV)购自中国兽医药品监察所；双荧光素酶报告载体pISRE-Luc、pNF-资B-Luc、pRL-TK、pGL3-Basic均购自Clonteth公司；牛IFN-茁启动子报告载体pGL-BoIFN茁-Luc由本实验室构建；pSilencerTM3.1-H1neo购自Ambion公司；Dual-LuciferaseRReporter Assay试剂盒购自Promega公司；脂质体2000购自Invitrogen公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒和HRP标记羊抗兔IgG(IgG-HRP)购自北京碧云天科技有限公司；SYBR Premix购自TaKaRa公司；兔源抗人Mx-1单克隆抗体(MAb，GTX110256)、内参 抗 体GAPDH(GTX100118)购 自GeneTex公 司；RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。1.2牛 IFN-棕12基因的扩增及序列分析根据NCBI中登录的牛IFN-棕1基因(281847)序列，设计特异性克隆引物BoIFNWS/A(表1)。以本实验室保存中 国 预 防 兽 医 学 报2023年738的牛肝脏基因组为模板，PCR扩增牛IFN-棕12目的片段，反应条件为：945 min；9430 s、526230 s、7240 s，30个循环；7210 min。PCR产物回收后连接至pMD18-T载体，构建的重组质粒酶切鉴定正确后由华大基因公司测序分析。根据测序结果，利用在线软件预测牛IFN-棕12糖基化位点(http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/和http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)及其三级结构(https:/swissmodel.expasy.org)。通过网 站软 件(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对 牛IFN-棕12氨基酸序列进行信号肽分析，同时利用Lasergene 11软件包(DNAStar，Inc.，USA)和ClustalX软件比对并分析牛IFN-棕12氨基酸序列，采用ClustalX和MEGA5.0软 件 分 析IFN-棕12的 氨 基 酸 序 列，并 构 建 牛IFN-棕12的进化树。1.3rBoIFN棕12的表达及纯化根据扩增获得的牛IFN-棕12的基因序列，利用软件Primer Premier 6设计IFN-棕12成熟肽编码基因扩增引物BoIFN棕12S/A，以1.2中构建并测序正确的克隆载体为模板，扩增牛IFN-棕12成熟肽编码基因序列(表1)，PCR反应条件同上。将PCR产物经H I和I双酶切后克隆于经同样双酶切处理的pET-32a(+)质粒中，经酶切及测 序 鉴 定，正 确 的 重 组 质 粒 命 名 为pET-32a-BoIFN棕12。将 重 组 质 粒pET-32a-BoIFN棕12转 化Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞，经1 mmol/L的IPTG诱导表达6 h，重悬菌体后在冰浴条件下超声裂解，取沉淀和上清经SDS-PAGE电泳，将表达的重组蛋白命名为rBoIFN棕12。大剂量诱导后采用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测纯化蛋白的浓度。对纯化蛋白按常规方法经SDS-PAGE检测其纯化效果。用0.45滋m滤膜过滤目的蛋白，用于蛋白生物学活性检测。1.4rBoIFN棕12抗病毒活性检测待96孔板中的各种细胞生长至汇合度达80%时，每孔加入100滋L 4倍倍比稀释的重组蛋白，37孵育24 h后将VSV以100 TCID50的剂量感染，24 h48 h后观察细胞病变(CPE)的抑制效果，同时设不做任何处理的细胞对照和不加IFN的病毒对照。以抑制50%细胞病变(CPE50)的最高IFN稀释度为1个活性单位(U)15。按照上述 方 法，检 测rBoIFN棕12、rBoIFN棕3在MDBK、PK-15、BHK21、MDCK细胞中的抗病毒活性。1.5rBoIFN棕12抗细胞增殖活性的MTT法检测待96孔板中的MDBK细胞生长至汇合度达80%时，分别 加 入4倍 倍 比 稀 释 的 不 同 浓 度 的 重 组 蛋 白(0.004 ng/mL40 000 ng/mL)，37孵育72 h后每孔加10滋L MTT(5 mg/mL)，37孵育4 h后，弃去培养液，每孔加150滋L DMSO，室温震荡15 min溶解沉淀，采用酶标仪测定细胞的OD490nm值。每个处理组3个重复。以未加IFN的MDBK细胞作为对照组，分别测定rBoIFN棕12和rBoIFN-琢A的抗细胞增殖活性。1.6rBoIFN棕12稳定性的检测用胰蛋白酶处理rBoIFN棕12，使胰酶的终浓度为0.25%，37水浴30 min，按 照1.4中 方法 检测 经胰 蛋白酶 处 理 组rBoIFN棕12抗病毒活性，同时设未经胰蛋白酶处理的rBoIFN棕12作为对照组。将rBoIFN棕12用稀盐酸(浓度25%)调节pH至2.0，37作用4 h后，调回原pH(约7.0)。按照1.4中方法检测经酸处理后rBoIFN棕12在MDBK细胞中的抗病毒活性，同时设未经酸处理的rBoIFN棕12作为对照组。将rBoIFN棕12分别置于42、56和63水浴2 h，迅速置于冰上冷却降温。按照1.4中方法检测经不同温度处理后rBoIFN棕12在MDBK细胞中的抗病毒活性，同时以未处理的rBoIFN棕12作为对照组。1.7rBoIFN棕12对启动子活性的影响分析将BL细胞铺于24孔板内，待细胞汇合度达70%80%时，利 用 脂 质 体2000分 别 将pNF-资B-Luc、pISRE-Luc、pGL-BoIFN茁-Luc报告载体和内参pRL-TK载体共转染细胞，转染24 h加入100 U rBoIFN棕12(未加rBoIFN棕12处理的BL细胞作为对照组)，12 h后收获细胞样品，按照Promega公司的双荧光素酶报告基因(DLRTM)检测系统 说明书 检测双荧光素酶信号，进而分析rBoIFN棕12对启动子活性的影响。1.8rBoIFN棕12诱导ISG表达的western blot鉴定将MDBK单层细胞铺于12孔细胞培养板，待细胞生长至80%时，每孔加100 ng的rBoIFN棕12，37培养24 h后收获细胞。参照RNAprep pure细胞/细菌总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录为cDNA后作为模板，根 据NCBI搜 寻 的 牛ISG15、ISG56、Mx1、GAPDH序列和转录组测序得到的序列设计荧光定量PCR引物(表1)，利用ABI 7500荧光定量PCR仪，按照SYBR Premix说明书的方法检测rBoIFN棕12安东，等.重组牛IFN-棕12生物学特性及其免疫调节机制的研究第7期739表1引物序列引物名称PrimersBoIFNWSBoIFNWABoIFN12SBoIFN12ABoGAPDHSBoGAPDHABoMx-1SBoMx-1ABoISG15SBoISG15ABoISG56SBoISG56A序列(5-3)Sequences(5-3)GATCCCTGGGCTGTGACYTGTCTCTTCTCTTKCAGGTAGAYATGGATAGAGGATCCATGGCCTTCGTGCTCTCTCTACTGCTACTCGAGTCAAGGTGAGTTCAGGTCTCCATCTTCAACGGCACAGTCAAGGACATACTCAGCACCAGCATCACTCAACCTCCACCGAACTGTCTTCTTCTGCCTCCTTCTCGCAGCCAACCAGTGTCTGCCTAGCATCTTCACCGTCAGTGGACTGTGAGGAAGGATGGAGGCGATAGACAACGATTGC注：下划线表示限制性内切酶位点。Note:The restriction enzyme sites that were introduced in primers areunderlined.图1牛IFN-棕12的三级结构(A)和氨基酸序列进化树(B)分析处理后MDBK细胞中ISGs mRNA的转录水平，以牛GAPDH作为内参基因，采用2-Ct法处理数据16。荧光定量PCR反应体系为20滋L，PCR程序：9530 s；955 s、6030 s，循环40次。另外，用200滋L哺乳动物细胞裂解液裂解收获的细胞15 min，以兔源抗人Mx-1 MAb(1颐5 000)为一抗，羊抗兔IgG-HRP(1颐10 000)为二抗，经ECL PLUS发光显色液显色后曝光，利用western blot检测MDBK细胞中Mx-1蛋白的表达水平。2结果2.1牛IFN-棕12基因的扩增及序列分析以牛肝脏基因组为模板，经PCR扩增牛IFN-棕12基因，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测定，结果显示，扩增片段大小约600 bp，与预期大小588 bp一致(图略)。牛IFN-棕12氨基酸序列显示其开放阅读区包含一个23 aa组成的信号肽序列以及172 aa成熟肽序列，蛋白质分子质量大小为21.919 ku，等电点为5.6。通过牛IFN-棕12氨基酸序列预测其三级结构，结果显示牛IFN-棕12与牛IFN-棕24、牛IFN-琢、牛IFN-着一样有5个潜在琢螺旋(图1A)。牛IFN-棕12存在2个潜在O-糖基化位点，无N-糖基化位点，这些位点在蛋白折叠、寡聚化和稳定性方面起重要作用17。对牛IFN-棕12和多种哺乳动物的氨基酸序列比对结果显示，牛IFN-棕12包含23个信号肽，有4个cys氨基酸，具有典型IFN-I序列特征。氨基酸序列分析结果显示，牛IFN-棕12与羊IFN-棕的相似性为89.74%，与马IFN-棕1的相似性为62.56%，与牛IFN-棕24的相似性为90.28%，与人IFN-棕的相似性 为65.64%，与猪IFN-棕1的相似性为68.21%。根据牛IFN-棕12氨基酸序列构建的进化树结果显示，牛IFN-棕12与牛IFN-棕3、牛IFN-棕24、羊IFN-棕亲缘关系较近，可能是由一个共同的祖先分子进化而来(图1B)。2.2重 组 质 粒 pET-32a-BoIFN棕12 的 鉴 定、rBoIFN棕12表达及纯化的SDS-PAGE结果对重组质粒pET-32a-BoIFN棕12双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示有两条基因片段(约600 bp目的片段和5 000bp载体片段)，均与预期相符(图略)。将pET-32a-BoIFN棕12转化Rosetta(DE3)感受态细胞中诱导表达，利用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白，利用SDS-PAGE检测rBoIFN棕12表达与纯化效果，结果显示，重组菌在分子质量约39 ku处有目的条带，与预期分子质量一致，并且表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在(图2)。rBoIFN棕12经纯化后显示清晰单一条带，BCA法测定纯化蛋白浓度为0.105 mg/mL。上述结果表明，rBoIFN棕12在Rosetta(DE)感受态细胞中获得了表达，且纯化效果较好。2.3rBoIFN棕12抗病毒活性检测结果采用CPE抑制法 检 测rBoIFN棕12的抗病毒活性17，结果显示，rBoIFN棕12在MDBK-VSV和PK-15-VSV系统中抗病毒活 性 分 别 为3.79伊106U/mg和1.04伊105U/mg，是rBoIFN棕3在相应系统中抗病毒活性的4倍左右。在BHK-21-VSV系统中rBoIFN棕3具有抗病毒活性，而rBoIFN棕12无抗病毒活性。在MDCK-VSV系统中二者均无抗病毒活性(表2)。表明rBoIFN棕12在MDBK和PK-15细胞中相对于rBoIFN棕3有更高的抗病毒活中 国 预 防 兽 医 学 报2023年740ABRhesus monkey IFN棕XP001108113Bovine IFN茁ABX72063Human IFN棕1 NP002168Chimpanzee IFN棕1 XP528554Bovine IFN琢1 XP005199179Bovine IFN琢F NP001165513Porcine IFN棕8 ACF17569Feline IFN棕13 NP001041667Bovine IFN棕12Bovine IFN子AAG14168Sheep IFN棕AAA31507Bovine IFN棕24Bovine IFN棕30.60.40.20.010010010097999999455567安东，等.重组牛IFN-棕12生物学特性及其免疫调节机制的研究第7期741性，rBoIFN棕12在鼠源的BHK-21细胞和犬源的犬肾细胞(MDCK)中无抗病毒活性。2.4rBoIFN12抗细胞增殖活性的检测结果分别将4倍倍比稀释的rBoIFN-琢A和rBoIFN棕12加入MD-BK细胞，采用MTT法检测其抗细胞增殖活性，结果显示，rBoIFN棕12和rBoIFN-琢A在MDBK细胞中抗细胞增殖活性均具有剂量依赖性，高浓度时对细胞增殖的抑制效果较低浓度时强(图3)。此外，当蛋白浓度为40 mg/mL时，rBoIFN棕12在MDBK细胞中的抗细胞增殖活性明显小于rBoIFN-琢A；当蛋白浓度为400 ng/mL4 000 ng/mL时，rBoIFN棕12的抗细胞增殖活性略低于rBoIFN-琢A。表明，相对于rBoIFN-琢A，rBoIFN棕12对MDBK细胞的细胞毒性较低。2.5rBoIFN棕12稳定性检测结果对rBoIFN棕12分别经胰蛋白酶、不同温度、不同酸碱度处理，检测其在MDBK细胞中对VSV抗病毒活性。结果显示，经0.25%胰蛋白酶处理后，rBoIFN棕12完全丧失抗病毒 活 性，表 明rBoIFN棕12对 胰 蛋 白 酶 高 度 敏 感。rBoIFN棕12经酸处理后(pH2)，其抗病毒活性是未经处理样品的0.57倍(图4)。rBoIFN棕12分别经42、56、63处理后，rBoIFN棕12的抗病毒活性是对照组的0.57倍、0.49倍、和0.28倍(图4)。结果表明，rBoIFN棕12对胰酶敏感，胰酶易使其失去抗病毒活性；rBoIFN棕12对高温、酸碱环境有一定的抵抗力，在高温、酸碱处理后仍保持一定的抗病毒活性。2.6rBoIFN棕12对启动子活性的影响分析分别将pNF-资B-Luc、pISRE-Luc、pGL-BoIFN茁-Luc报告载体和内参pRL-TK载体共转染单层BL细胞后，加入100 UrBoIFN棕12作用12 h，并均以未加rBoIFN棕12的转染组作为对照，进行双荧光素酶信号的检测。分析rBoIFN棕12对NF-资B、ISRE、BoIFN-茁启动子的影响。结果显示，相对于对照组，rBoIFN棕12在BL细胞中启动了商品化的人pNF-资B-Luc和pISRE-Luc报告载体的荧光素酶活性，激活了pGL-BoIFN茁-Luc启动子报M：蛋白质分子质量标准；1：诱导后的pET-32a(+)/Rosetta(DE3)；2：诱导后的pET-32a-BoIFN棕12/Rosetta(DE3)；3：诱导后的pET-32a-BoIFN棕12/Rosetta(DE3)上清；4：诱导后的pET-32a-BoIFN棕12/Rosetta(DE3)沉淀；5：纯化后rBoIFN棕12M:Unstained protein Marker;1:pET-32a(+)/Rosetta(DE3)afterinduction;2:pET-32a(+)-BoIFN棕12/Rosetta(DE3)after induction;3:Supernatants of pET-32a(+)-BoIFN棕12/Rosetta(DE3);4:Sedimentations of pET-32a(+)-BoIFN棕12/Rosetta(DE3);5:Purified rBoIFN棕12图2rBoIFN棕12表达及纯化的SDS-PAGE检测表2rBoIFN棕12和rBoIFN棕3抗病毒活性对比分析检测系统Detecting systemMDBK-VSVPK-15-VSVBHK-21-VSVMDCK-VSVrBoIFN棕38.56伊1052.39伊1042.21伊1050rBoIFN棕123.79伊1061.04伊10500抗病毒活性Antiviral activity(U/mg)116.0ku66.2ku45.0ku35.0ku25.0ku116.0ku66.2ku45.0ku35.0ku25.0kuM12345*:0.05图4rBoIFN棕12对pH和温度敏感性分析图3rBoIFN棕12和rBoIFN-琢A在MBDK细胞中抗增殖活性的检测结果Concentration of rBoIFN(ng/mL)1.51.00.50rBoIFN琢ArBoIFN棕124000040004004040.40.040.004UntreatedpH10.0pH2.042566343210告载体的荧光素酶活性。表明，rBoIFN棕12可以激活IFN信号通路中的NF-资B相应元件、ISRE结合元件和BoIFN-茁启动子的活性，以更好的发挥抗病毒作用。2.7rBoIFN棕12诱导ISG转录及表达的分析结果将rBoIFN棕12加入到MDBK单层细胞中，分别取培养不同时间点的样品进行qPCR检测和Mx-1表达的western blot检测。qPCR结果显示，rBoIFN棕12作用MDBK细胞3 h24 h后，Mx-1、ISG15和ISG56的转录水平持续升高，并呈时间依赖性(图6A)。Westernblot结果显示，rBoIFN棕12作用MDBK细胞6 h24 h时可检测到Mx-1蛋白的特异性条带(图6B)。上述结果表明，rBoIFN棕12作用MDBK细胞后，刺激细胞产生ISG中的Mx-1，ISG15和ISG56转录水平及表达量从IFN作用细胞后的3 h24 h逐渐增多，Mx-1在6 h24 h的转录水平及表达量增多。3讨论牛的8号染色体上聚集着很多IFN-I亚型，包括1012个IFN-琢，56个IFN-茁，35个IFN-子和1520个IFN-棕，不同亚型IFN有相似的结构和生物学活性。牛IFN-棕12包含23个信号肽，可形成5个琢螺旋，其成熟肽氨基酸序列中Cys-1与Cys-99、Cys-29与Cys-139等4个cys氨基酸可分别形成两个二硫键，对于IFN-I的抗病毒活性至关重要。在生物进化过程中，IFN-棕基因与IFN-琢基因的分开大约发生在1.3亿年前，早于真哺乳亚纲动物在进化过程中的出现，其氨基酸序列与IFN-琢的相应氨基酸序列的同源性较高。本研究从牛肝基因组中克隆表达了牛IFN-I，进化树分析显示，牛IFN棕-12与牛IFN-琢1的亲缘关系较牛IFN-茁 近。本 研 究 采 用 大 肠 杆 菌 系 统 表 达 了rBoIFN棕12，对其经酸碱和高温处理，发现其仍保持抗病毒活性，表明IFN-棕12对酸碱及高温具有一定的抵抗力，该结果与其他IFN-I理化性质相似18。研究显示IFN-棕还具有一定程度的跨物种生物学活性19-20，如牛源的IFN在牛源、猪源、兔源、猫源等传代细胞中均表现出抗病毒活性。本研究发现rBoIFN棕12在牛源MDBK和猪源PK-15细胞中对VSV均无抗病毒活性，在鼠 源BHK-21细胞中和犬源MDCK细胞中对VSV均无抗病毒活性；有文献报道BoIFN-棕3对BHK-21-VSV系统具有抗病毒活性，而BoIFN-琢A、BoIFN-着和BoIFN-棕24在该系统无抗病毒活性15,17。关于不同亚型IFN跨物种抗病毒活性差异产生的原因仍需进一步研究。病毒侵入机体后，宿主体内的模式识别受体(PRR)能够识别侵入病毒的高度保守的病原相关分子模式(PAMP)21，进而通过NF-资B等因子引起联级反应诱导I型IFN的产生。IFN与受体结合启动信号转导，刺激ISRE启动元件的激活，进而刺激IFN-I的产生，形 成IFN产 生 的 正 反 馈 途 径。本 研 究 发 现rBoIFN棕12能够启动NF-资B响应元件，干扰素刺激应答元件(ISRE)调控的荧光素酶活性，也激活牛IFN-茁启动子调控的荧光素酶活性，从而进一步诱导IFN的产生。文献报道IFN可以通过激活JAK-STAT信号通路调控大量ISG的表达以发挥抗病毒效应。本研究中rBoIFN棕12刺激MDBK细胞后，细胞中Mx-1、ISG15和ISG56表达量逐渐增多，且Mx-1蛋白在该重组蛋白刺激6 h24 h的表达量较未经IFN处理组增图6rBoIFN棕12诱导MDBK细胞中相应ISG转录水平(A)和Mx-1蛋白表达(B)的检测结果图5rBoIFN棕12对启动子活性影响的分析结果rBoIFN棕12Mx-1Infection time(hour)NF-资BBoIFN茁-LucISRENF-资BBoIFN茁-LucISRE252015543210ISG15ISG56100080060040020002412963024h12h9h6h3h0GAPDHMX-1BA中 国 预 防 兽 医 学 报2023年742123456789101112131415161718192021安东，等.重组牛IFN-棕12生物学特性及其免疫调节机制的研究第7期743多，表明rBoIFN棕12激活了MDBK的相关信号通路，刺激了细胞产生ISG发挥抗病毒效应。本研究首次证实牛IFN-棕12具有抗病毒和抗细胞增殖的活性，细胞毒性较低，可刺激ISG中Mx-1、ISG15、ISG56的 表 达，能 够 启 动NF-资B、ISRE、BoIFN-茁启动子激活的荧光素酶活性，为牛抗病毒药物的研究提供了基础材料。参考文献：PITINI V,ARRIGO C,ALTAVILLA G.How cells respond tointerferons J.J Clin Oncol,2010,28(25):99-102.SEN G C.Viruses and interferons J.Annu Rev Microbiol,2001,55(1):255-256.CAPON D J,SHEPARD H M,GOEDDEL D V.Two distinctfamilies of human and bovine interferon-alpha genes are coordi-nately expressed and encode functional polypeptides J.MolCell Biol,1985,5(4):768-779.FEINSTEIN S I,MORY Y,CHERNAJOVSK Y,et al.Familyof human alpha-interferon-like sequences J.Mol Cell Biol,1985,5(3):510-517.HAUPTMANN R,SWETLY P.A novel class of human type Iinterferons J.Nucl Acids Res,1985,13(13):4739-4749.ADOLF G R.Antigenic structure of human interferon omega 1(interferon alpha II1):comparison with other human interferonsJ.J Gen Virol,1987,68(6):1669-1676.MEGE D,LEFEVRE F.The porcine family of interferon-omega:cloning,structural analysis,and functional studies offive related genes J.J Interf Cytok Res,1991,11(6):341-350.OHE K,TAKAHASHI T,HARA D,et al.Sensitivity of FCVto recombinant feline interferon(rFeIFN)J.Vet Res Commun,2008,32(2):167-174.LUO XIU-XIN,GUO YONG-LI,BAO JUN,et al.Characteriza-tion and antivirus activities of a novel bovine IFN-omega24 J.Mol Immunol,2015,66(2):357-363.AN DONG,GUO YONG-LI,BAO JUN,et al.Molecular char-acterization and biological activity of bovine interferon-omega3J.Res Vet Sci,2017,115:125-131.DE