CollagenⅤ在推拿促进长期大负荷运动大鼠肌肉干细胞自我更新中的作用研究.pdf

中医康复2024年2月 第1卷 第2期Traditional Chinese Medicine Rehabilitation,Feb.2024,Vol.1,No.02基础实验研究CollagenCollagen 在推拿促进长期大负荷运动大鼠肌肉干细胞在推拿促进长期大负荷运动大鼠肌肉干细胞自我更新中的作用研究自我更新中的作用研究*张瑞驰，靳松林，李伦宇，阿衣留布，丁海丽（成都体育学院，四川 成都 610041）摘摘要要 目的目的：观察推拿对长期大负荷运动大鼠骨骼肌损伤修复、后肢抓力及Collagen 表达的影响，探讨推拿促进大鼠肌肉干细胞自我更新的机制。方法方法：32只雄性SD大鼠随机分为空白对照组（C组）、长期大负荷运动组（E组）、长期大负荷运动+推拿组（ET组）、长期大负荷运动+假推拿组（ES组）。C组不做任何处理，E组、ET组和ES组进行4周大负荷跑台运动制备长期大负荷运动损伤模型；E组不予任何干预；ET组于每次运动后6h予以推拿干预；ES组于每次运动后6h仅予以抚摸干预。测定初始及4周后大鼠的体重和后肢抓力。末次干预后24h取大鼠两侧腓肠肌，采用透射电镜观察肌纤维超微结构变化；免疫组织化学染色检测 Collagen 表达水平；实时荧光定量 PCR 检测 Col5a1 和 Col5a3 mRNA 表达水平；Western Blot检测 Pax7、MyoD和Myf5蛋白表达水平；双重免疫荧光染色检测Pax7与Collagen 共定位。结果结果：与C组相比，E组、ES组和ET组大鼠后肢抓力增加值差异显著（P0.01），E组和ES组超微结构均出现肌原纤维断裂等变化，E组和ES组Collagen、Pax7、MyoD、Myf5、Col5a1和Col5a3 mRNA以及Pax7与Collagen 共定位表达显著降低（P0.05）；与E组相比，ET组后肢抓力增加值差异显著（P0.05），超微结构表现良好，Collagen、Pax7、MyoD、Myf5、Col5a3 mRNA以及Pax7与Collagen 共定位表达显著升高（P0.05）。结论结论：推拿可通过上调Collagen 表达，促进大鼠骨骼肌肌肉干细胞自我更新，从而加速修复长期大负荷运动诱发的超微结构损伤，增强肌肉力量。关键词关键词 长期大负荷运动；推拿；肌肉干细胞；自我更新；型胶原蛋白 中图分类号中图分类号 R R685685 文献标识码文献标识码 B B 文章编号文章编号 20972097-31283128(20242024)0202-00010001-0707DOIDOI：1010.1978719787/j/j.issnissn.20972097-31283128.20242024.0202.001001The Role of CollagenThe Role of Collagen in Tuina Promoting Self-Renewal of Muscle Satellite Cells Undergoingin Tuina Promoting Self-Renewal of Muscle Satellite Cells UndergoingLong-Term Large Load Exercise in RatsLong-Term Large Load Exercise in RatsZHANG Rui-chi,JIN Song-lin,LI Lun-yu,Ayiliubu,DING Hai-li(Chengdu Sport University,Chengdu,Sichuan 610041)AbstractObjectiveAbstractObjective:To observe the effects of Tuina on the repair of skeletal muscle injury,grasping force of hind limbs and expression of Collagen(COL)after long-term large load exercise in rats,and to explore the mechanism of Tuina promoting the self-renewal of muscle satellite cells(MSC).MethodsMethods:A total of 32 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into groups C,E,ET,and ES.Group C did not do any treatment,while the other rats did large load treadmill exercise for 4 weeks to prepare gastrocnemius injury model.Group E received no intervention.Group ETreceived Tuina 6h after each exercise,while group ES only received stroke.Body weight and grasping force of hind limbs of the rats were measuredat the beginning and 4 weeks later.after 24h of the last exercise and Tuina,samples of gastrocnemius were obtained from both sides of all the rats,and observed the ultrastructure of skeletal muscle fibers by transmission electron microscopy,detected the expression of Collagen with immunohistochemical staining,the expression of mRNA Col5a1 and Col5a3 with RT-PCR,and the expression of Pax7,MyoD and Myf5 protein with Westernblotting,observed co-localization by labeled Pax7 and Collagen with Double immunofluorescence staining.ResultsResults:Compared with group C,theincreased grasping force of hind limbs in group E,ES and ET significantly different(P0.01),the changes such as myofibril fracture were observedin the ultrastructure of group E and ES,and the expression of Collagen,Pax7,MyoD,Myf5 protein,mRNA Col5a1,Col5a3 and the expressions ofco-location of Pax7 and Collagen in group E and ES decreased significantly(P0.05).Compared with group E,the increased grasping force ofhind limbs in group ET significantly different(P0.05),the expression of Collagen,Pax7,MyoD,Myf5 protein,mRNA Col5a1,Col5a3 and the expressions of co-location of Pax7 and Collagen in group ET increased significantly(P0.05),and the ultrastructural damage recovered well.ConcluConclu sionsion:Tuina can promote the self-renewal of skeletal muscle satellite cells in rats by up-regulating expression of Collagen,to accelerate the repair ofultrastructural damage induced by long-term large load exercise and enhancing muscle strength.KeywordsKeywordslong-term large load exercise;Tuina;muscle satellite cells;self-renewal;Collagen 超负荷原则是现代运动训练体系的主要原则，人体不断适应增加的运动负荷，从而使身体机能和运动能力得到提升1。在此过程中，若运动负荷长时间过度超出机体承受能力，可能会导致骨骼肌损伤发生，损伤又需要足够的时间修复2，但实际情况下训练与损伤修复的时间平衡点往往难以把控。若损伤未愈仍持续大负荷运动，可导致机体组织损伤进一步累积并迁延3，影响运动表现。竞技体育*基金项目基金项目：国家自然科学基金项目，编号：81904318作者简介作者简介：张瑞驰（2000-），男，在读硕士，研究方向：肌骨损伤康复。通讯作者通讯作者：丁海丽（1982-），女，博士，教授，研究方向：运动损伤防治与康复。1中医康复2024年第1卷中，推拿常被应用于运动员训练及赛后的肌肉疲劳恢复和损伤治疗，效果显著。目前，现有研究在免疫调节4、蛋白合成/分解代谢5-6和细胞外基质7等方面进行了探究，证实推拿以力学形式作用于损伤或疼痛部位软组织，从而达到缓解症状和促进组织修复的效果8。但其具体作用分子机制仍不清晰，有待进一步探讨。肌卫星细胞（Muscle Satellite Cells,MSC）具有干细胞特性，即肌肉干细胞，是成体骨骼肌再生修复的主要细胞类型，通常处于静息状态9。当骨骼肌遭受损伤性刺激时，MSC被激活并大量增殖，以满足机体干细胞需求，这一过程中，部分激活和增殖的MSC会重新退回静息状态以维持骨骼肌再生潜能，影 响 损 伤 修 复10。型 胶 原 蛋 白（Collagen ,COLV）由MSC分泌并通过作用于MSC表面降钙素受体介导MSC静息状态的维持，是MSC静息生态位关键组成成分11-12。课题组前期研究发现13，推拿可上调一次性大负荷运动骨骼肌损伤的Collagen 表达，促进损伤修复。然而，推拿对长期大负荷运动骨骼肌损伤的干预效果及机制仍不明晰。本实验旨在观察长期大负荷运动后推拿对Collagen 表达及损伤修复的影响，探讨推拿能否介导Collagen 表达促进MSC自我更新。1 1材料与方法材料与方法1.1 实验动物及分组 8周龄健康SPF级雄性SD大鼠共32只，初始体重1856g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SYXK（川）2020-030。实验动物在成都体育学院标准动物房内分笼饲养，整个实验过程中保持自由饮食、饮水，室温 2024，相对湿度 30%60%，12h光照/黑暗模拟昼夜交替环境。适应性喂养3天后，所有大鼠按随机数字表法分为空白对照组（C组，n=8）、长期大负荷运动组（E组，n=8）、长期大负荷运动+推拿组（ET组，n=8）、长期大负荷运动+假推拿组（ES组，n=8）。本实验过程中对动物所有处理均遵循动物伦理学标准，并得到成都体育学院动物伦理委员会批准。1.2 试剂与器材 免疫染色封闭液、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒、ECL试剂盒：碧云天。反转录试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit）、荧光定量试剂盒（TB Green TM Premix Ex TaqTM（Tli RNaseHPlus）：宝日医。BCA 蛋白浓度测定试剂盒：博士德。Collagen V 抗 体：Thermo Fisher Scientific。Pax7抗体：圣克鲁斯。MyoD1抗体、Myf5抗体：Affinity Biosciences。HRP标记抗兔二抗：成都正能。TSAPLus荧光双重染色试剂盒、Fitc标记抗兔二抗、Cy3标记抗小鼠二抗：赛维尔。Finger-8-TR型推拿量化仪：苏州长显光电科技。YLS-13A大小鼠抓力测定仪：徐州利华电子科技。1.3 造模方案 所有大鼠进入动物房后适应性喂养3天，其中E、ES、ET组大鼠进行1周适应性运动并参考张学林14所用方法建立 4 周大负荷运动损伤模型，C组不进行运动作为对照，运动方案见表1。表1 大鼠大负荷运动方案周期适应性运动第一周第二周第三周第四周第12天第34天第5天第16天第16天第16天第16天坡度（）0-5-10-16-16-16-16运动时长（min）10153060609090速度（m/min）161616162020201.4 干预措施 根据 灵枢经筋 中“以痛为腧”，推拿操作主要利用阿是穴原理，对损伤部位进行揉按，将机械力刺激传递至损伤部位。自正式运动起，每日运动结束后6h，除E组不予处理外，高年资中医推拿科主治医师参照郑氏手法操作要求15对ET组大鼠小腿三头肌施以揉法为主的推拿手法，每侧 5min，每天1次，每周6天，休息1天，操作过程中借助Finger-8-TR型 FSR薄膜式压力传感器对推拿参数进行量化和监测，根据团队前期实验结果13，并参照文献16，控制推拿力度为 4N 左右，频率为 120 次/min。仅对 ES 组大鼠于小腿三头肌处皮肤施以轻抚，频率和时间同ET组。1.5 样本采集与处理 于末次干预后24h采用1%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉，剥离两侧腓肠肌组织，左侧腓肠肌内侧头采用3%戊二醛固定用于透射电子显微镜检测；右侧腓肠肌组织分为两份，一份采用环保型GD肌肉固定液固定用于后续免疫组化和免疫荧光染色，另一份以-80保存用于后续WesternBolt和实时荧光定量PCR检测。1.6 观察指标1.6.1 后肢抓力测试 参照Wang H等17的方法，使用YLS-13A大小鼠抓力测定仪进行检测：右手抓住大鼠背部将其放于网格抓杆，使其下肢抓住抓杆，左手托起大鼠上半身缓缓将其放平，然后右手握该大鼠尾部，将抓力仪推至前端，踩踏板清零，待大鼠抓牢后，缓缓拉动大鼠尾部，直至其脱落或计数截止。抓力测定仪能够准确记录大鼠后肢抓力的最大值，每只大鼠重复测试3次，取平均值。1.6.2 透射电镜 腓肠肌组织于 3%戊二醛预固定后，1%四氧化锇再固定。丙酮逐级脱水后，将样品先经脱水剂处理，又用环氧树脂包埋，再经加温聚合 2第2期张瑞驰 等 Collagen 在推拿促进长期大负荷运动大鼠肌肉干细胞自我更新中的作用研究后切片。采用超薄切片机制备约50nm切片后，漂浮于刀槽液面上，再捞至铜网。室温下用醋酸铀和枸橼酸铅染色液染色，运用JEM-1400PLUS透射电镜观察超微结构并采集图像。1.6.3 免疫组织化学染色 将固定后的组织经全自动脱水机脱水，石蜡包埋，7m切片，脱蜡后的切片经3%甲醇双氧水阻断内源性过氧化物酶，滴加免疫染色封闭液进行抗原修复，室温封闭20min，加入一抗Collagen （1：100），4孵育过夜。于次日 PBS 水洗 后，加 入 山 羊 抗 兔 二 抗（1：1000），37 孵 育30min，再次PBS水洗。使用DAB显色试剂盒显色，苏木素复染，中性树胶封片。使用BA200Digital数码显微摄像系统对切片进行图像采集。采用Image-pro Plus 6.0分析同一参数下总和光密度值，根据图片总面积计算平均光密度值。1.6.4 实时荧光定量PCR 各大鼠取100mg骨骼肌组织，采用Trizol法提取mRNA，并将获得的mRNA经超微量分光光度计（Thermo）检验纯度和浓度。使用 PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒进行基因组DNA除去反应和逆转录反应，获得样品cDNA。按照 TB Green TM Premix Ex TaqTM （Tli RNaseHPlus）建立 20L预混液反应体系，95预变性 30s，95变性5s，55退火30s，72充分延伸30s，45循环，并用PIKORed 96实时荧光定量仪进行扩增和采集荧光。使用PikoReal软件分析各检测样本的CT（Threshold cycle）值，通 过 2-CT计 算 Col5a1 和Col5a3相对 mRNA表达水平。引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，序列如下：Col5a1:5-GGACTCCGACTCCAATGTCTCTCC-3；Col5a1:5-GGCTCAATGATGGCTGGTTCTCC-3；Col5a3:5-TGAGAAGCTGCCGGAGACTGG-3；Col5a3:5-CCCTATGCACACCCAAGGTTTCC-3；-actin:5-GAAGATCAAGATCATTGCTCC-3；-actin:5-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3。1.6.5 Western Blot 各大鼠取20mg腓肠肌组织与裂解液混合并匀浆，4、12000r/min离心5min，取上清液采用BCA法测定蛋白浓度，加热变性制作蛋白样品。获得样品后加入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（浓缩：80V 30min；分离：120V 90min），再 以 200mA 转 膜 90min。用 含 5%脱 脂 奶 粉 的TBST 封闭 2h，分别加入 Pax7（1：600）、MyoD1（1：1000）、Myf5（1：500）、-actin（1：50000）一抗，4孵育过夜，TBST 充分洗涤，加入山羊抗兔二抗（1：10000），37孵育 2h，TBST再次充分洗涤，使用增强ECL化学发光液显影、定影，采用Image-J软件分析目标蛋白及内参蛋白的灰度值并计算比值。1.6.6 免疫荧光共定位 将固定后的组织经全自动脱水机脱水，石蜡包埋，7m切片。经梯度乙醇脱蜡后，使用EDTA（pH 8.0）对玻片进行抗原修复。滴加免疫染色封闭液室温封闭10min后，分别添加一定比例Collagen （1：500）、Pax7（1：300）一抗混合液，室温孵育 12h 后转移至 4过夜。次日 PBS 水洗后，滴加Fitc标记山羊抗兔和Cy3标记山羊抗小鼠二抗，室温孵育 2h。再次 PBS水洗，滴加 DAPI，室温孵育 10min，用抗荧光淬灭封片剂封片。采用Pannoramic 250全自动数字扫描显微镜进行拍照观察，随机选取视野采集。1.7 统计方法 采用SPSS 25.0软件进行统计分析，实验数据均以均值加减标准差（x s）表示，组间比较采用单因素方差分析。方差齐性检验采用Brown-Forsythe test和Bartletts test，方差齐时，采用LSD检验；方差不齐时，采用Tamhans T2检验。P0.05）。E组、ES组与ET组4周后抓力较C组均显著增加（P0.01）。经校准，E组与ES组在完成运动方案后抓力增加值较C组具有显著性差异（P0.05），ET组也具有显著性差异（P0.01）；同时，ET组较E组和ES组抓力增加值也具有显著性差异（P0.05），见图1。注：与C组比较，*P0.05，*P0.01；与E组比较，#P0.05；与ES组比较，P0.05图1 各组大鼠后肢抓力变化（g）3中医康复2024年第1卷2.2 透射电镜观察腓肠肌超微结构 C组大鼠腓肠肌肌原纤维排列整齐，肌节明暗带清晰可见，线粒体完整且有规律地排列在Z线两侧。E组与ES组大鼠腓肠肌超微结构发生改变，肌原纤维发生断裂和降解、Z线断裂、肌浆网肿胀、线粒体结构不清且肿胀。ET组大鼠腓肠肌超微结构较E组和ES有明显改善，肌原纤维排列整齐、肌浆网完整，但仍有部分线粒体结构不清，见图2。CEESET图2 各组大鼠腓肠肌超微结构（20000）2.3 免疫组织化学染色 各组大鼠腓肠肌组织均出现深棕色颗粒阳性表达，其中C组和ET组深棕色颗粒显著多于E组和ES组。E组与ES组Collagen 表达水平较C组均呈下降趋势，其中E组降低具有显著性（P0.05）；ET组Collagen 表达较其余三组均显著升高（P0.05），见图3。注：与C组比较，*P0.05，*P0.01；与E组比较，#P0.01；与ES组比较，P0.01图3 各组大鼠Collagen V表达（400）2.4 实时荧光定量PCR E组、ES组与ET组Col5a1mRNA表达水平较C组均显著降低（P0.01）；ET组表达较E组和ES组呈上升趋势，其中较E组升高具有显著性（P0.05）。E组与ES组Col5a3 mRNA表达水平较C组均显著降低（P0.01）；ET组表达较C组显著升高（P0.05），同时较E组与ES组也显著升高（P0.05），见图4。注：与C组比较，*P0.05，*P0.01；与E组比较，#P0.05，#P0.01；与ES组比较，P0.01图4 各组大鼠Col5a1和Col5a3 mRNA表达 4第2期张瑞驰 等 Collagen 在推拿促进长期大负荷运动大鼠肌肉干细胞自我更新中的作用研究2.5 Western Blot E组Pax7蛋白表达水平较C组降低（P0.01），同时 ES组 Pax7蛋白表达较 C 组也降低（P0.05），两组MyoD和Myf5蛋白表达较C组均降低（P0.05）外，其Pax7蛋白表达较E组和ES组显著升高（P0.01），且MyoD和Myf5蛋白表达较另三组均显著升高（P0.01）；ES组较E组除MyoD蛋白表达升高显著（P0.05），见图5。注：与C组比较，*P0.05，*P0.01；与E组比较，#P0.05，#P0.01；与ES组比较，P0.01图5 各组大鼠Pax7、MyoD和Myf5蛋白表达2.6 免疫荧光共定位 红色荧光标记Pax7，绿色荧光标记 Collagen，Pax7 与 Collagen 共定位呈现黄色荧光。E组和ES组黄色荧光信号较C组减少；ET组黄色荧光信号较C组无明显差异，而较E组和ES组增加；E组和ES组黄色荧光信号无明显差异，见图 6。E组与 ES组 Pax7与 Collagen 的 Overlap系数较C组均显著降低（P0.05），而较E组和ES组均显著升高（P0.05），见图7。图6 各组大鼠Collagen 与Pax7免疫荧光共定位结果（400）5中医康复2024年第1卷注：与C组比较，*P0.01；与E组比较，#P0.01；与ES组比较，P0.01图7 各组大鼠Collagen 与Pax7共定位表达3 3讨论讨论推拿作为中国传统疗法之一，常应用于治疗长期过度使用骨骼肌引起的慢性肌肉劳损，缓解肌肉酸痛和疲劳无力等症状18。竞技运动中，运动员平日反复进行的高强度训练导致骨骼肌重复性微损伤积累，造成骨骼肌过度使用，久之则易形成慢性劳损19-20。有研究证实，离心大负荷运动易造成骨骼肌超微结构变化，导致骨骼肌微损伤21-22。而长期大负荷运动过程中，为适应骨骼肌的过度使用，其超微结构损伤及重复性微损伤会累积，出现组织炎症浸润及纤维化等现象23。推拿已被证实具有加速运动所致骨骼肌损伤修复的作用24，与团队前期研究发现推拿可加速一次性大负荷运动骨骼肌超微结构损伤修复结果一致13。且有研究表明，通过推拿给予机体一定机械力刺激可诱导细胞骨架蛋白重塑25，这也对骨骼肌超微结构损伤修复具有重要意义。本研究运用大鼠四周递增连续离心下坡跑模拟运动员长期大负荷运动状态，通过透射电镜观察到大鼠腓肠肌超微结构发生了肌原纤维断裂及降解、Z线断裂等改变，而经推拿干预的大鼠腓肠肌超微结构有明显改善，提示推拿可促进长期大负荷运动所致骨骼肌损伤修复。此外，另有研究表明推拿在促进损伤修复的同时还能有效改善肌肉力量26。本研究结果显示，推拿组大鼠后肢抓力的提升远超单纯运动大鼠，这进一步说明推拿促进损伤修复的同时，能更有效地巩固并增强长期大负荷运动产生的肌肉力量。MSC自我更新是骨骼肌损伤修复的内源性动力，该过程受MSC生态位严格调控。Pax7是MSC及其自我更新的关键标志物，参与维持 MSC生态位、调控其自我更新且持续表达抑制成肌细胞肌源性分化程序27。与此同时，骨骼肌再生修复依赖肌源性调节因子来调节分化程序28。MSC通常处于静息状态，稳定表达Pax7，当受到损伤刺激活化后，则开始表达MyoD和Myf5，参与肌肉中成纤维细胞等非肌肉细胞向肌肉的转化过程。本研究检测了大鼠腓肠肌中Pax7、MyoD和Myf5蛋白表达情况，以探究推拿对MSC自我更新的影响。有证据证明，运动引起的重复性损伤会降低 MyoD 和 Myf5 表达29，本研究发现单纯运动组中 Pax7、MyoD 和Myf5蛋白表达均降低，这说明长期大负荷运动可能导致重复性损伤。而推拿组相较于空白对照组MyoD和Myf5蛋白表达显著升高，提示骨骼肌损伤后推拿有助于MSC自我更新。另一方面，推拿组三种蛋白表达较单纯运动组和假推组均显著升高，结合透射电镜结果，提示推拿可能因促进MSC自我更新而加速长期大负荷运动所致骨骼肌损伤修复。Collagen 是MSC生态位关键组成成分，对维持MSC静息态起重要作用。Baghdadi MB等11发现Collagen 缺失时，会导致MSC进入异常细胞周期，消耗干细胞池，影响MSC生态位稳定，进而导致自我更新受损。为验证推拿能否通过干预Collagen 表达，影响MSC自我更新，本研究采用免疫组织化学染色法检测Collagen 表达，发现长期大负荷运动后Collagen 表达显著降低，而介入推拿会上调Collagen 表达，与团队前期研究推拿对一次性大负荷运动所致骨骼肌损伤Collagen 表达变化趋势一致13。与此同时，本研究还检测了 Collagen 主要基因Col5a1和Col5a3 mRNA表达，推拿干预下两基因mRNA表达升高，与免疫组织化学染色结果类似，这提示长期推拿有助于上调 Collagen 表达。为进一步探究 Collagen 在推拿干预下对 MSC自我更新的作用，本研究就Collagen 与Pax7进行免疫荧光共定位，结果显示长期大负荷运动后Collagen 与Pax7共定位程度降低，而长期推拿使共定位程度有所提高，这说明Collagen 参与推拿促进MSC自我更新过程。由此推测，推拿的确可能通过上调Collagen 表达，促进长期大负荷运动大鼠骨骼肌损伤中所进行的MSC自我更新。综上所述，本研究探究了推拿可能通过上调Collagen 表达的方式，促进MSC自我更新，从而加速长期大负荷运动导致骨骼肌损伤的修复，并增强肌肉力量。但由于MSC生态位成分复杂，是否还有其他细胞和因子参与推拿修复骨骼肌损伤过程，或参与调控Collagen 来间接影响其损伤修复，仍有待进一步研究。参考文献参考文献1Tien T,Pedersen Haglo H,Unhjem R,et al.Maximal strength 6第2期张瑞驰 等 Collagen 在推拿促进长期大负荷运动大鼠肌肉干细胞自我更新中的作用研究training:the 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