实验室质量控制操作规程.doc

艾滋病检测实验室质量管理

实验室质量管理涉及质量保证、质量控制和质量评价。

1 质量保证（QA）
1.1 行政支持
行政部门和领导要关心艾滋病实验室的建设和发展，保证实验室负责人和重要技术人员队伍的稳定，保证实验室建筑和设备需要、给予充足的经费支持，并进行经常性监督检查。
1.2 实验室规范化建设
艾滋病实验室的设立及其建筑、设施、设备必须符合《艾滋病检测工作管理办法》的规定。
1.3 人员培训及其评价
实验室工作人员上岗前必须接受技术培训并获得合格证书。在工作中要定期或不定期接受复训。实验室主管领导应定期对工作人员进行评价，涉及工作的准确性、效率、执行安全条例和规章制度情况、职业道德、出勤率以及上岗资格等。
1.4 标本采集、运送和解决，严格遵照FJCDCXAM001-2023。
1.5 检测方法和试剂的选择
应使用最适合的检测方法和敏感性高、特异性好的试剂，并定期进行质量评价。
1.6 设备维护与校准
设立常用仪器的维护及校准制度，以保证正常运转。
1.6.1 酶标读数仪、洗板机
天天：核对酶标仪滤光片波长，检查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现象。
每周：清洁仪器表面，保护光学零件不沾灰尘。
每月：检查洗涤时各孔是否与相应的冲洗头对位良好，负压是否符合规定规定。
每年：检查、清洗滤光片，假如出现破裂或霉点则要更换。根据仪器内具有的校准程序或使用校准板，对滤光片的精密度进行校准并保存记录。
实验过程中发现异常情况，应随时进行解决，可根据使用情况更换必要的部件。
1.6.2 移液器
一年至少应当标定一次，发现异常情况应随时进行校准。
标定方法涉及有色溶液光谱分析法、称量校准法、同位素计数法以及使用配套校准盒等。校准多道移液器时，必须保证每一个加样头都可以连续、准确地加样。移液器的精密度应在厂家说明书规定的范围内。
范例 用蒸馏水称量法标定移液器：
在室温22℃无风的工作室中，在万分之一级别天平上放置一个小三角烧瓶，用待校准的移液器吸取存放过夜的蒸馏水加入烧瓶底部，称重并计算蒸馏水重量，连续称重10次。加蒸馏水的量根据待校准移液器的规格而不同（见下表），10次校准称量均在规定的重量范围内为合格，贴上合格标签，注明校准日期，不合格移液器要请生产厂家进行校准。填写和保存校准记录。
称重法校准移液器方案
移液器规格
蒸馏水量
规定重量范围
0.5–10μl
2μl
1.75 - 2.25 mg
5–40μl
10μl
9.8 - 10.2 mg
40–200μl
70μl
69.4 - 70.6 mg
200–1000μl
300μl
298.0 - 302.0 mg
1–5ml
2023μl

1990.0 - 2023.0 mg
2–10ml
3500μl
3485.0 - 3515.0 mg

1.6.3 冰箱和孵育箱：
必须天天检查和记录低温超低温冰箱及孵育箱的温度，并作好记录。
1.6.4 定期检查其他仪器设备
精密仪器及出具实验结果的仪器必须定期校准，其他仪器定期检查并做好记录。
1.7 文献和文献管理
1.7.1 标准操作程序 (SOP)
艾滋病检测实验室要建立覆盖重要工作内容的SOP文献。
SOP由各岗位工作人员起草，实验室主任审定，并应定期修订。修订应当在实验室主管人员（技术负责人）的领导下进行，每年至少一次。所有工作人员要在所从事工作的SOP文献上署名表达已经阅读并掌握了有关内容。
u 艾滋病检测实验室应建立以下SOP：
1）样品的接受、登记和解决
2）检测方法和环节
3）仪器的使用与维护和校准
4）实验中的质量控制
5）结果解释与报告
6）保密程序
7）检测数据的记录与保存
8）追踪和解决
9）实验室的清理和消毒
10）实验室安全防护
u SOP通常涉及（但不限于）以下内容：
1）标题和编号
2）编写和修改日期
3）编写和修订人员姓名
4）方法、目的和应用范围
5）相应的职业规范
6）检测设备和试剂
7）安全防护相关环节
8）结果的解释和报告
9）附录，涉及相关的附加文献如标准表格、设备和试剂盒说明书等。
1.7.2 实验原始登记表
应按实验规定，设计操作的原始登记表，标明空白对照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及待检样品的位置，便于指导实验人员加样。要注明试剂盒厂家、测定方法、批号、效期、操作人员和复核人员姓名及检测日期。
1.7.3 标本的登记
收到标本后，及时登记有关参数，涉及受检者姓名或代号、试管编号、性别、年龄、职业、送检单位、人群类别、检查结果、送检日期、报告日期、备注 ( 必要时记录通信地址 )等。
1.7.4 HIV阳性标本的保存记录
涉及HIV阳性标本的类型、贮存量、贮存温度、贮存起始时间以及标本保管人姓名。
1.7.5 文献存档
实验原始登记表、打印数据、免疫印迹实验的膜反映条带或其照片、检测登记表、标本登记、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等都应当妥善存档保存5年以上。最佳同时使用计算机保存各种文献和记录。

2 质量控制（QC）
2.1 质控血清的制备和保存（以ELISA实验检测HIV抗体为例）
在每次实验中必须包具有内部对照质控血清和外部对照质控血清。
内部对照质控血清指试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。内部对照是质量控制的基础。每一次检测必须使用内部对照，并且只能在同批号的试剂盒中使用。
外部对照质控血清是为了监控检测的反复性和稳定性以及试剂盒批间或孔间差异而由实验室设立的一套对照血清，涉及强阳性、弱阳性和阴性对照血清。也可以只设立一个弱阳性对照，以该试剂盒临界值（Cut-off）的2-3倍为宜。
2.1.1 外部对照质控血清的制备
HIV抗体阳性和阴性血清，56℃30分钟灭活，3000转/分钟离心15分钟。弱阳性对照可以用HIV抗体阴性血清梯度稀释HIV抗体强阳性血清并标定后得到。按一年使用量配制，用0.2μm滤膜过滤除菌。
2.1.2 外部对照质控血清的保存
1）按一周实验用量分装、分类、标记、封口、-20℃冻存于非自动除霜冰箱中。
2）外部对照血清不可反复冻融，一旦融化后应当存放2-8℃，供一周内使用。
2.1.3 外部对照质控血清的使用
每一次实验必须使用外部对照质控血清，以便监控实验的反复性和稳定性。同时可以了解各批试剂盒的批间或孔间差异，绘制质量控制图。
2.1.4 外部对照质控物的质量规定
质控物的管间或瓶间变异必须小于监测系统预期的变异，并且质控物的成分应在稳定状态中。质控物应无菌，并不具有影响ELISA反映的防腐剂。
2.2 质控图的建立及应用（以ELISA实验检测HIV抗体为例）
最常用的质控图是Levey-Jennings质控图
2.2.1 建立质控图参数
外部对照质控物的平均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对质控物反复测定的基础上。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；假如仅做少量批次的检测也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控物测定结果，以建立一个临时性的平均值和标准差，当达成20批次数据后，替代临时性的平均值和标准差。
1）算术平均值( )：代表一组S/CO值的平均值。为了记录学上有显著性意义，应当采用至少20次(天)所测得的外部对照质控血清S/CO值结果计算出平均值。
2）标准差(s)：是描述样品与均数之间离散限度的一个指标，是与对照值的均值有关的预期范围。一组S/CO值的标准差以s表达。
3）变异系数(cv)：是反映各次S/CO值相对于均值离散限度的一个指标，可以用来衡量检测的反复性或精密度。
4）控制限：由实验室根据对质控物检测结果的平均值和标准差来拟定。例如12S质控规则的控制限为外部对照S/CO平均值加减2个标准差；13S质控规则的控制限为外部对照S/CO平均值加减3个标准差。

计算公式为：
Σx
= ──
n

s 计算公式为： ───────
∑( xn - x )2
s = ───────
n-1
cv 计算公式为：
s
cv = ── x 100 %

2.2.2 绘制质控图
质控图的绘制环节
1）在常规条件下，对同一批血清连续测定20次（天）或以上，获得一组S/CO值，求均数( )和标准差(s), 超过2s或3s的数据不应删除。
2）将均值( )和标准差(s)分别在质控框架图中标示出来。以S/CO值作纵座标(Y轴)，每一次(天)实验作横座标(x轴)，绘制质控图。
3）从第21次起，将每次质控血清的检测结果依次点入该质控框架图中，检查进入质控状态。
2.2.3 质控规则及使用
实验室在报告实验结果之前必须评价质控数据，可通过图形记录的检查或由计算机审核结果来决定。目前许多质控规则已被采用，常用的是12S和13S规则。
1）告警（12S）：当外部对照的S/CO值超过 +2s范围时，系统处在告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观测。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。
2）失控（13S）：当外部对照的S/CO值超过 +3s范围时，系统处在失控状态，本次实验结果不能被接受，也许是系统误差或存在随机误差。
3）位移：连续几次（3-5次）外部对照S/CO值都落在均值的一侧则称为位移，提醒实验条件发生了较大的变化重新绘制质控图。
4）趋势：连续几次（5-7次）外部对照S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。
质控规则的使用应检出随机误差和系统误差，即具有高的检出分析误差的能力，同时应具有较低的假失控概率。考察实验系统的可靠性应采用多标准质控方案，多规则质控方法能提高误差检出，并具有低的假失控概率。其要点为：
出现一次2s范围的变化时，系统处在告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观测。
出现下列情况时，应暂停检测查找因素：出现一次3s范围的变化、连续两次出现同一方向2s范围的变化、连续四次出现同一方向的1s范围的变化、连续十次结果都在1s范围内，但落在均值线的同一侧
2.2.4 质控图的分析及失控解决
实验室应建立质控图分析及失控情况解决程序
当质控已有计划并恰本地执行时，规定可靠的平均值和标准差用于计算质控限，将假失控概率降到最低。当出现失控时进行如反复质控测定或重新分析新的质控物不是最有效的方法，必须找出问题因素，找出解除故障的方法，并消除因素，防止将来出现同样的问题。
2.2.5 绘制和分析质控图的要点
1）要在常规条件下建立质控图参数，用S/CO比值绘制质控图。对同一批质控物连续测定得到20个数据，求均数( )和标准差(s), 超过2s或3s的数据不应删除。
2）由专人负责建立质控图，每月定期召开质控分析会，讨论本月的质量控制情况。
3）建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒，更换不同厂家的试剂盒后，必须重新绘制质控图。改用新批号试剂盒也应重新制作质控图。使用新批号或不同厂家的试剂盒必须在质控图上注明使用日期。
4）发现质控结果失控，应填写报告单，上交质量负责人，分析因素并决定是否发出检测报告。
5）使用新批次的外部对照质控物时，必须重新绘制质控图。变异系数(cv)小于20％，表达外部对照处在稳定状态。
2.3 即刻法”质控
“即刻法”质控方法是在对同一批外部质控血清连续测定3次后，即可对第3次检查结果进行质控。具体计算方法如下：
2.3.1 将质控血清的测定值从小到大排列：x1，x2，x3……xnx1为最小值，xn为最大值)
2.3.2 计算 和s
2.3.3 计算SI上限值和SI下限值
SI上限=
X最大值-
s

SI下限=
-X最小值
s
2.3.4 将SI上限、SI下限与SI值表（表4）中的数字比较。
表4 SI值表

n
n3s
N2s
n
n3s
n2s
3
1.15
1.15
12
2.55
2.29
4
1.49
1.46
13
2.61
2.33
5
1.75
1.67
14
2.66
2.37
6
1.94
1.82
15
2.71
2.41
7
2.10
1.94
16
2.75
2.44
8
2.22
2.03
17
2.79
2.47
9
2.32
2.11
18
2.82
2.50
10
2.41
2.18
19
2.85
2.53
11
2.48
2.23
20
2.88
2.56
1）当SI上限和SI下限 n3s值时说明该值已在3s范围之外，属“失控”。数值处在“告警”和“失控”状态应舍去，需重新测定该质控血清和病人样品。舍去的只是失控的这次数值，其他测定值仍可继续使用。

3 质量评价（EQA）
室间质量评价是检查实验室对未知样品获得对的结果的能力。
3.1 评价体系
3.1.1 艾滋病参比实验室和一些艾滋病确认中心实验室参与相关国际机构的室间质量评价活动。
3.1.2 艾滋病参比实验室对全国艾滋病确认中心实验室和艾滋病确认实验室进行室间质量评价，并负责提供室间质量评价标本、评价标准以及有关文献。
3.1.3 艾滋病确认中心实验室对本省的艾滋病初筛筛查实验室进行室间质量评价。
3.2 参与国家艾滋病参比实验室组织的室间质量考评