藏药二十五味鬼臼丸对去势大鼠血清性激素及骨转换标志物的影响.pdf

2520242024年JOURNALANDBIOLOGYVol.45No.1之之第1期第45卷杂志中国高原医与生物学藏药二十五味鬼日丸对去势大鼠血清性激素及骨转换标志物的影响*段方林，申继强，代冬芳,李凤辉,江宇楠，余瑶，李玉琴，李长兴！（1.青海大学医学部，西宁8 10 0 0 1;2.青海省人民医院，西宁8 10 0 0 7）摘要目的探究藏药二十五味鬼白丸对去势大鼠血清性激素及骨转换标志物的影响。方法将36 只SD大鼠随机分为给药组、模型组及假手术组，给药组和模型组做卵巢摘除手术。术后两周开始灌胃给药，给药组予二十五味鬼白丸混悬液（40 0 mg/kg），模型组和假手术组予蒸馅水，每日1次，持续12 周。用微计算机断层扫描技术（Micro-CT）检测右侧股骨近端结构、扫描电子显微镜（SEM)观测股骨微结构；以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b),血清骨形成标志物骨碱性磷酸酶BALP,血清E,、LH、FSH。结果Micro-CT和SEM显示，藏药二十五味鬼白丸能显著改善去势骨质疏松症大鼠模型的股骨近端骨微结构和骨小梁密度；Pearson相关性分析显示，血清E，水平与TRAP5b水平呈负相关，与BALP水平呈正相关；血清FSH、LH 水平与BALP水平呈负相关。结论藏药二十五味鬼白丸对去势大鼠血清性激素的影响：升高血清E，激发机体下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO）上游的LH、FSH 反馈调节；对骨转换标志物的影响：降低血清TRAP5b含量同时升高血清BALP含量，可改善骨代谢失衡，进而改善骨微结构关键词二十五味鬼白丸；性激素；骨转换标志物；骨小梁；绝经后骨质疏松中图分类号R965文献标志码ADOI10.13452/ki.jqmc.2024.01.004Effects of Xizang medicine Ershiwuwei Guijiu Pill on serum sex hor-mones and bone turnover markers in the ovariectomized rats*DUAN Fanglin,SHEN Jiqiang,DAI Dongfang,LI Fenghui,JIANG Yunan,YU Yao,LI Yuqin,LI Changxing(1.Medical College of Qinghai University,Xining 810001,China;2.Qinghai Provincial Peoples Hospital,Xining 810007,China)Abstract Objective To explore the effects of Xizang medicine Ershiwuwei Guijiu Pill on serum sex hor-mones and bone turnover markers in the ovariectomized rats.Methods 36 SD rats were randomly divided into med-icine group,model group and sham group.Ovariectomy was performed in the medicine group and model group.Twoweeks after the surgery,the medication was administered by gavage,with the medicine group receiving a suspen-sion of Ershiwuwei Guijiu Pill(400 mg/kg),and the model group and sham operation group receiving distilled wa-收稿日期：2 0 2 3-0 6-2 9修回日期：2 0 2 3-12-2 2：青海省科技厅基础研究项目（2 0 2 3-ZJ-783）.青海大学青年科研基金项目（2 0 2 2-QNY-9,2023-QYY-1），青海省卫生健康系统指导性计划课题（2 0 2 2-wjzdx-06）：*：通信作者，博主，硕土生导师，段方林（1997 一），男，汉族，贵州籍，在读硕士研究生26ter once a day for 12 weeks.Micro-CT was used to detect the structure of the right proximal femur;SEM was usedto observe the microstructure of the femur;ELISA was used to detect serum bone resorption marker tartrate-resis-tant acid phosphatase 5 b(TRAP5 b),serum bone formation marker serum bone-specific alkaline Phosphatase(BALP),serum estradiol(E,),luteinizing hormone(LH),follicle-stimulating hormone(FSH).Results The re-sults of Micro-CT and SEM showed that Ershiwuwei Guijiu Pill could significantly improve the proximal femurbone microstructure and bone trabecular density in the model of ovariectomized osteoporosis rats.The pearson cor-relation analysis resalts showed that there is a negative correlation between E,levels and TRAP5 b levels,while se-rum E,levels are positively correlated with BALP.There is a negative correlation between serum FSH,LH levelsand BALP levels.Conclusion The Xizang medicine Ershiwuwei Guijiu Pill could improve the level of serum E,inthe ovariectomized rats and stimulate the feedback regulation of LH and FSH in the upstream of hypothalamic pitu-itary ovarian axis(HPO).In addition,it could also reduce the content of serum TRAP5 b and increase the contentof serum BALP,which could improve bone metabolism imbalance and thereby improve bone microstructure.Keywordss Ershiwuwei Guijiu Pill;sex hormone;bone turnover markers;trabecular bone;postmenopausalosteoporosis藏药二十五味鬼白丸用于防治绝经后骨质疏松症(postmenopausal-osteoporosis,PMOP)的依据不足。本研究以去势骨质疏松症大鼠模型为研究对象，观测藏药二十五味鬼白丸对去势大鼠血清性激素及骨转换标志物的影响，为其防治PMOP提供科学依据。1材料与方法1.1实验动物SPF级雌性SD大鼠36 只，3月龄，体质量（2 0 0 20)g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（陕）2 0 2 3-0 0 2。室内饲养环境温度为（2 2 1)。予自由饮食（水）。本研究通过青海大学实验动物伦理委员会审查（批准号：QHDX2021000541）1.2实验药物及试剂藏药二十五味鬼白丸（青海柴达木高科技药业有限公司，批号：Z63020209）。大鼠血清雌二醇（E2)ELISA试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司，批号：MB-2116A），促黄体生成素（LH)ELISA试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司，批号：MB-6623A），促卵泡激素（FSH)ELISA试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司，批号：MB-2107A）大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5bELI-SA试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，批号：HB1242-Ra）,大鼠骨特异性碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海恒远生物科技有限公司,批号：HB757-Ra）。1.3实验仪器离心机（德国Eppendorf公司），多功能酶标仪（美国Bio-Rad公司），SkyScan1176小动物Micro-CT扫描仪（德国Bruker公司），扫描电子显微镜（SEM。日本JEOLLTD电子公司）。Micro-CT50成像系统（德国Bruker公司）。1.4分组、造模及给药方法将大鼠适应性饲养1周后，随机分为给药组（18只）、模型组（12 只）假手术组（6 只）。根据参考文献建立PMOPSD大鼠模型：在大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉；假手术组切除卵巢旁等体积脂肪组织，保留卵巢，给药组、模型组结扎血管后完整切除双侧卵巢，术后连续3天肌注青霉素(2 0 万单位/只，1次/日）。术后第5天逐只进行阴道涂片，观测白细胞、角化细胞及有核上皮细胞以了解大鼠动情周期。若动物连续5天不出现动情期反应则表示造模成功。术后2 周，给药组予二十五味鬼白丸混悬液（将二十五味鬼白丸研磨成粉状，用蒸馏水配制，0.4g/mL），每周称量给药组动物体质量，计算平均体质量，按照40 0 mg/kg计算每次予二十五味鬼白丸的灌胃剂量，模型组和假手术组予等体积蒸馏水。上述各组每日灌胃1次，持续12 周。最后一次灌胃后禁食12小时时麻醉（2%戊巴比妥钠，40 mg/kg），于腹主动脉取血。剥离出股骨,剔除肌肉、韧带和软骨组织后，用生理盐水冲洗，并用4%多聚甲醛固定。1.5股骨组织检测方法应用Micro-CT50成像系统评价大鼠右侧股骨近端的微观结构，分辨率为18 m，并采用系统分析软件选定目的区域骨组织分析骨小梁连通性(Con-nectivity，C o n n），检测小梁厚度（Trabecularthick-ness,Tb.Th）,计算总孔隙率Total porosity,Po(tot)。1.6股骨微结构观察方法27向固定股骨的4%多聚甲醛中加人2.5%戊二醛继续浸泡股骨2 4小时，用15%次氯酸钠溶液处理6 小时，再经超声波清洗10 分钟后用蒸馏水反复冲洗。依次浸泡于50%、7 0%、90%、100%乙醇进行梯度脱水，每次10 分钟。干燥后喷金，置SEM下拍摄股骨冠状切面用于骨微结构观测。1.7性激素和骨转换标志物含量检测方法用EDTA抗凝管收集腹主动脉血5mL,轻微颠倒混匀放置2 0 分钟后离心（4，30 0 0 r/min，12 分钟），血清置-8 0 冰箱保存。用ELISA法检测大鼠血清TRAP5b、BA LP、E,、FSH、LH 水平。1.8统计学方法采用SPSS26.0软件进行统计学分析。数据用(xs)表示。组间比较用单因素方差分析法，两两比较用LSD-t检验法。进行Pearson相关性分析，P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1藏药二十五味鬼白丸对去势大鼠血清性激素的影响与模型组相比，给药组的E含量显著增加（P 0.0 5）,FSH、LH 含量下降（P0.05）（表1）。表1各组性激素含量（元s）Table 1Content of sex hormones in each group(x+s)组别nE2FSHLH模型组1257.7561.475*14.5200.604*13.9090.520*给药组1862.2353.887*#12.8241.154*#12.4761.331#*假手术组671.4361.170#11.2900.865#11.1040.668#F42.93024.52215.660P0.00010.00010.0001#：与模型组比较，P0.05；*：与假手术组比较,P0.05在下丘脑-垂体-卵巢轴(HPO)负反馈调节中,当机体分泌足量的E,时，FSH、LH 受到反馈调节导致其分泌量减少。本实验结果提示，藏药二十五味鬼白丸可能通过调节机体的E,分泌，维持大鼠绝经后急剧下降的E，水平。2.2藏药二十五味鬼白丸对去势大鼠骨转换标志物的影响与模型组相比，给药组的骨吸收标志物TRAP5b显著降低（P0.05）,而骨形成标志物BALP显著增加(P0.05)(表2)。表2各组骨转换标志物含量（元士s）Table2Content of bone turnover markers in each group(x+s)组别nTRAP5 bBALP模型组121509.05862.833*9.4951.347*给药组181375.629107.867#14.6241.754#假手术组61348.77746.657#13.4801.037#F10.49541.129P0.00030.0001#：与模型组比较，P0.05；*：与假手术组比较，P0.0528在构建去势骨质疏松症大鼠模型过程中，摘除双侧卵巢导致雌激素水平明显下降，破骨细胞的骨吸收作用增强，导致TRAP5b含量升高，而成骨细胞的骨形成作用减弱，导致BALP含量下降。经藏药二十五味鬼白丸干预后，TRAP5b含量降低、BALP含量增加，改善了去势骨质疏松症大鼠模型的骨转换失衡状况，即减缓骨吸收并增加骨形成。2.3股骨近端结构通过Micro-CT检测可观测到股骨头骺线附近的骨髓腔内骨小梁网状结构的分布情况。与假手术组相比，模型组骨小梁连通性较低，即单位面积内骨小梁网状结构之间的连接数量较少，骨小梁间孔隙率大，骨小梁平均厚度较小。模型组Micro-CT图像显示，在骺线附近的骨髓腔内骨小梁（图1黄色箭头所示位置）彼此连接数量较少，距离线位置越远骨小梁连接越少，甚至出现间断；线附近骨小梁呈现片状连接，且空隙间距较大。与模型组相比，给药组骨小梁连通性较高，骨小梁间空隙率较小，骨小梁平均厚度较大。给药组Micro-CT图像显示，骺线附近骨小梁交织呈网状结构，骨小梁连接数量较多，连接紧密，即单位面积内的连接率和骨小梁厚度均高于模型组在股骨结构参数结果中,与模型组相比,给药组大鼠股骨Conn、T b.T h 显著增加（P0.05）,而Po(tot）显著下降（P0.05）（表3）表3各组大鼠股骨结构参数（xs）Table3Structural parameters of femur in each group(xs)组别nConnTb.Th(m)Po(tot)(%)模型组3409.333223.395*86.8684.420*67.6544.889*给药组3524.000336.968#119.00114.906#41.9266.060*#假手术组31280.333115.110#137.8814.316#40.1605.858#F11.40722.99422.446P0.0090.0020.002#：与模型组比较，P0.05；*：与假手术组比较，P0.05A：假手术组B：模型组C:给药组黄色箭头示线附近的骨髓腔内骨小梁图1股骨近端Micro-CT扫描结构Figure1Micro-CT scanning structure of proximal femur分析可知，与假手术组比较，模型组骨小梁连接稀疏，结构破坏严重，骨小梁之间腔隙变大；相较于模型组，给药组骨小梁连接密度明显改善，排列致密，骨小梁之间腔隙显著变小，呈网状排列（图1）。2.4股骨微结构在30 倍镜下，可观察到股骨内部骨小梁厚度、间距和排列连接情况。与假手术组对比，模型组骨小梁厚度近端到远端逐渐变薄，近端骨小梁呈片状，分布较为密集，远端呈杆状，且粗细不均，骨小梁间距不一，网状排列紊乱。与模型组比较，给药组骨小梁排列有序，近端至远端整体粗细均匀，骨小梁间的空隙错落有致。在50 0 倍镜下，可观察到骨小梁表面的骨胶原纤维走向、骨吸收孔数量、骨小梁断裂情况。与假手术组比较，模型组骨胶原纤维走向与骨小梁长轴不一致，骨吸收孔较多，骨小梁出现多处横向断裂。与模型组比较，给药组骨胶原纤维走向与骨小梁长轴保持一致，骨小梁偶见断裂及少量骨吸收孔（图2）。29近端远端SEI15kVWD16mnSS43X500SEI15kVWD15mmSS43X30500umA：假手术组近端远端15VWD16mmSS43X500SoumSEI15KV$yD15mmSS54x30500umB：模型组近端WD147n5543远端SEI15kVWD15mm$54300umC:给药组图2 股骨扫描电子显微镜图Figure2SEMoffemur302.5二十五味鬼白丸干预后性激素与骨转换标志物的相关性（表4)表4性激素与骨转换标志物的相关性Table 4Correlation of sex hormones and bone turnover markersTRAP5 bBALP组别nindexPPE-0.6390.0250.7430.006模型组12FSH0.8750.001-0.8670.001LH0.7690.003-0.8900.001E-0.9610.0010.9700.001给药组18FSH0.9440.001-0.9630.001LH0.9430.001-0.9360.001E.-0.9480.0040.9290.007假手术组6FSH0.9910.001-0.9280.008LH0.9410.005-0.8840.019将经二十五味鬼白丸干预后的去卵巢大鼠血清E,、FSH、LH 水平与血清中骨转换标志物TRAP5b、BALP水平进行Pearson相关性分析显示：E,水平与TRAP5b水平呈负相关，与BALP水平呈正相关；FSH、LH 水平与TRAP5b水平呈正相关，与BALP水平呈负相关。3讨论3.1藏药二十五味鬼白丸对去势大鼠血清性激素的影响PMOP发生机制为绝经后女性卵巢功能减退，体内雌激素水平不足。雌激素缺乏导致骨质疏松：由于雌激素减少导致破骨细胞活跃，破坏机体骨稳态2。在去势骨质疏松大鼠模型上，藏药二十五味鬼白丸通过发挥类植物雌激素样作用，升高血清E,，激发机体HPO上游的LH、FSH 反馈调节3.2藏药二十五味鬼白丸对去势大鼠骨转换标志物的影响骨转换标志物为骨重塑过程中的血清代谢物，其在血清的浓度可反映机体的骨转换速率。TRAP5b为高敏性骨吸收标志物，可反映破骨细胞的活跃性。BALP为骨形成的特异性标志物,能使无机磷酸盐水解，促进骨形成，增加骨矿化3。藏药二十五味鬼白丸干预去势骨质疏松大鼠模型后，降低血清TRAP5b含量，同时升高血清BALP含量，结合形态学观测结果可知，二十五味鬼白丸能够调节去势骨质疏松大鼠模型中的骨代谢失衡而改善骨微结构3.3藏药二十五味鬼白丸对绝经后骨质疏松的防治茜草大叶茜草素、白杨素、阴香、葛根素等天然植物中的植物雌激素能够增加去势骨质疏松大鼠模型骨量(4-7)。二十五味鬼白丸组方中的肉桂、藏茜草、鬼白、石榴子等药材含有多种植物雌激素类化学成分，如鬼白毒素、大叶茜草素、肉桂酸等8-10。其中藏茜草的主要生物成分大叶茜草素，通过抑制RANKL信号传导和降低破骨细胞分化等机制减少了去势骨质疏松大鼠模型的骨质流失。石榴子的主要生物成分也含有植物雌激素类物质。Kaban等利用去势骨质疏松大鼠模型研究发现，石榴子提取物可以明显改善去势骨质疏松大鼠雌二醇水平、阴道上皮厚度以及胫骨小梁厚度12。此外,石榴子可通过提高肝脏和骨骼中的ICF-1表达来促进去势骨质疏松大鼠的骨量13。肉桂主要生物成分中的肉桂酸，以调节肠道菌群和诱导分化成骨细胞的作用方式，抑制去势骨质疏松大鼠的骨丢失14；同时，肉桂可显著改善骨转换标志物及胫骨微结构，增加胫骨矿质元素15】在课题组前期研究中发现，藏药二十五味鬼白丸具有类植物雌激素作用，能改善下丘脑、垂体、子宫以及股骨的雌激素受体表达16-17。可通过调控组织中ER和Wnt-catenin信号通路实现改善骨质疏松的药效作用18 1。本研究通过Micro-CT和SEM观测发现，经藏药二十五味鬼白丸干预去势骨质疏松大鼠模型后，大鼠股骨骨小梁数量和厚度显著增加，而骨小梁之间髓腔的孔隙率显著下降，验证了二十五味鬼白丸能够改善去卵巢大鼠股骨骨量和骨微结31（责任编辑：陈芃）构。在改善骨质疏松症的药效基础上，检测了大鼠血清中骨吸收标志物TRAP5b、骨形成标志物BALP以及血清性激素E,、FSH、LH 的含量,并进行了相关性分析。通过性激素与骨转换标志物的相关性分析可知，经二十五味鬼日丸长期干预后，体内E,水平升高，导致TRAP5b水平下降、BALP水平上升。在升高体内E,水平的同时激活HPO负反馈机制，减少FSH、LH 的释放，由此可能造成了血清FSH、LH 水平与TRAP5b水平呈正相关性，与BALP呈负相关性。Rouach等在一项关于去势骨质疏松大鼠模型骨质流失原因研究中发现19,E,的补充治疗可逆转摘除卵巢导致的骨组织形态损伤，同时降低FSH含量而改善去势骨质疏松大鼠模型骨小梁体积比综上所述，藏药二十五味鬼白丸对去势大鼠血清性激素的影响：增加E,含量，降低FSH、LH 含量；对骨转换标志物的影响：降低吸收标志物TRAP5b含量同时增加骨形成标志物BALP含量。本研究发现在含量富含多种植物雌激素的藏药二十五味鬼白丸干预下，去势骨质疏松大鼠模型体内E,水平升高，激活HPO轴反馈机制，改善转换代谢平衡，实现骨质疏松症防治，参考文献1陶柱萍，韦桂宁,王雪雪，等.卵巢摘除诱导围绝经期综合征动物模型的研究进展J.中国实验动物学报，2020,28(2):260-266.2 Almeida,M.,M.R.Laurent,V.Dubois,et al.Estrogensand Androgens in Skeletal Physiology and Pathophysiology J.Physiol Rev,2017,97(1):135-187.3廖翼涛，张贤，李超，等.骨质疏松症中医证型与骨转换标志物相关性研究J.中国骨质疏松杂志，2 0 2 2,2 8(12):1823-1827.4 Baek,J.M.,J.Y.Kim,Y.Jung,et al.Mollugin from Ru-bea cordifolia suppresses receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand-induced osteoclastogenesis and bone resorbingactivity in vitro and prevents lipopolysaccharide-induced boneloss in vivoJ.Phytomedicine,2015,22(1):27-35.5 Ibrahim,S.O.,S.B.Mada,M.M.,et al.Chrysin allevi-ates alteration of bone-remodeling markers in ovariectomizedrats and exhibits estrogen-like activity in silico JJ.Hum ExpToxicol,2021,40(12):S125-S136.6 Kania,N.,W.Widowati,F.R.P.Dewi,et al.,Cinnamo-mum burmanini Blume increases bone turnover marker and in-duces tibias granule formation in ovariectomized rats J.J Ay-urveda Integr Med,2018,9(1):20-26.7 Xiao,L.,M.Zhong,Y.Huang,et al.Puerarin alleviatesosteoporosis in the ovariectomy-induced mice by suppressingosteoclastogenesis via inhibition of TRAF6/ROS-dependentMAPK/NF-kappaB signaling pathwaysJJ.Aging(Albany NY),2020,12(21):21706-21729.8徐名慧，仇文婷，晋玲，等.藏族药小叶莲化学成分和药理作用研究进展J.中国中药杂志，2 0 2 3,8（6)：1-9.9郭凯华，练从龙，杨灏，等.不同生长年限茜草的近红外定性及定量分析J.分子植物育种,2 0 2 3,8(6)：1-11.10王荣香,宋佳,孙博，等.香豆素类化合物功能及生物合成研究进展J.中国生物工程杂志，2 0 2 2,42(12)：7 9-90.11 Baek,Kim,J.Jung,Y.,et al.Mollugin from Rubea cor-difolia suppresses receptor activator of nuclear factor-kappaBligand-induced osteoclastogenesis and bone resorbing activityin vitro and prevents lipopolysaccharide-induced bone loss invivoJ.Phytomedicine,2015,22(1):27-35.12 Kaban,I.Kaban,A.Tunca,A.F.,et al.Effect of pome-granate extract on vagina,skeleton,metabolic and endocrineprofiles in an ovariectomized rat model J.J Obstet GynaecolRes,2018,44(6):1087-1091.13 Bachagol,D.Joseph,G.S.Ellur,G.,et al.Stimulationof liver IGF-1 expression promotes peak bone mass achieve-ment in growing rats:a study with pomegranate seed oil J.JNutr Biochem,2018(52):18-26.14 Hong,S.Cha,K.H.Park,J.H.,et al.Cinnamic acidsuppresses bone loss via induction of osteoblast differentiationwith alteration of gut microbiota J.J Nutr Biochem,2021(101):108900.15 Kania,N.Widowati,W.Dewi,F.R.P.,et al.Cinnamo-mum burmanini Blume increases bone turnover marker and in-duces tibias granule formation in ovariectomized rats J.J Ay-urveda Integr Med,2018,9(1):20-26.16王琦，李淑桢，代冬芳，等.二十五味鬼白丸的植物雌激素样作用及其对雌激素受体的调控J.中成药，2 0 2 2,44(1):55-60.17李淑桢,王琦，李沁园，等.基于下丘脑-垂体-卵巢轴探讨藏药二十五味鬼白丸对绝经后骨质疏松大鼠的干预作用J.中草药，2 0 2 1,52（2 0）：6 2 8 2-6 2 90.18李沁园，代冬芳，吴佩锋，等.二十五味鬼白丸通过Wnt/-catenin信号通路改善去卵巢大鼠骨质疏松症J.中国实验方剂学杂志，2 0 2 3,2 9（2）：59-6 5.19 Rouach,V.,S.Katzburg,Y.Koch,N.Stern,et al.Boneloss in ovariectomized rats:dominant role for estrogen but appar-ently not for FSHJ.J Cell Biochem,2011,112(1):128-137.