miR-4534对宫颈癌细胞增殖的影响及其临床病理意义.pdf

年第卷第期医学理论与实践 对宫颈癌细胞增殖的影响及其临床病理意义相 丽 王会月 王 绪 张荣善 扬州大学医学院江苏省扬州市 宝应县妇幼保健院 宝应县人民医院摘要 目目的的:研究宫颈鳞状细胞癌()中 的表达水平、病理意义以及对细胞增殖的影响 方方法法:通过 实验检测 例 组织中 的表达水平分析 表达与患者临床病理特征的相关性 运用 实验检测 对增殖活性的影响 通过荷瘤实验观察减低 表达后对移植瘤生长的影响并通过增殖指标 免疫组化染色验证 对 增殖的影响 结结果果:检测出 在 组织中表达水平升高明显高于邻近正常宫颈组织有统计学差异(.)高表达的 与肿瘤直径和分化程度密切相关(均 .)这一结果提示 参与了 的生长增殖过程 实验结果显示在 时与过表达对照组(.)相比过表达 促进了 细胞的增殖活性(.)与减低表达对照组(.)相比降低 表达则抑制了 细胞的增殖活性(.)差异均有统计学意义(均.)裸鼠皮下移植瘤实验中降低 表达后移植瘤的重量和体积均小于对照组差异有统计学意义(均 .)细胞增殖指数 免疫组化染色显示减低 表达后 阳性细胞数目明显低于对照组差异有统计学意义(.)结结论论:是一个新的 促癌基因能促进 细胞的增殖生长本研究为未来治疗 提供新的策略关键词 病理意义 细胞增殖 中图分类号:.文献标识码:/:().:.:(.).(.).(.)(.)(.)(.)(.).(.).(.).:.宫颈癌()是发展中国家妇女最常见的癌症之一在全球癌症中宫颈癌发病率医学理论与实践 年第卷第期 排名第三目前其发病机制还未阐明 微小()是一种包含 个核苷酸的单链其主要功能是抑制编码 转录后翻译来调节基因表达或诱导靶信使 的降解 在癌症中 可作为癌基因和(或)抑癌基因发挥重要的生物学功能 虽然文献报道宫颈癌组织中有一些微小 表达水平异常但 在宫颈癌中的研究还知之甚少 本文就 在宫颈癌中的表达水平、临床病理意义及对增殖的影响进行探讨材料和方法.样本和资料选取 年 月 年 月期间在扬州大学附属医院和宝应县妇幼保健院接受宫颈癌根治术并确诊为宫颈鳞状细胞癌()的 例患者作为研究对象年龄 岁中位年龄 岁 纳入标准:()临床资料、病理资料无缺失者()术前未接受放疗、化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗者()对本研究知情同意者 排除标准:()合并其他部位恶性肿瘤者()自身免疫性疾病、感染性疾病患者 临床标本使用及病理资料收集均经医院伦理委员会批准并与患者签署知情同意书.质粒和细胞 和 质粒合成于南京金斯瑞生物科技公司 宫颈癌细胞株 细胞购自上海中科院细胞库 通过 细胞转染试剂盒将 和 质粒转染至 细胞株并将细胞株均放置含 胎牛血清 培养基的培养瓶中然后放置在 含有 浓度细胞培养箱内进行培育.实时荧光定量 实验 组织总 的抽提是通过 试剂裂解萃取并通过分光光度计测定 浓度 然后通过 合成 试剂盒(公司)合成 实时荧光定量 运用 试剂盒(公司)并按试剂说明书进行 的上游引物为 下游引物为 将包含反应体系的检测样本在 进行 实验实验步骤包括:()预变性:时间为 ()反应:重复:个循环时间为 时间为.细胞增殖活性实验主要步骤:接种 细胞悬液 于 孔板在细胞培养箱中孵育过夜 取出 细胞培养瓶加入 体积的 充分混合 继续培养细胞 置于孔板于摇床振荡约 用酶标仪读取 光吸收值(注意在结果中需要减去具有培养基和 溶液而没有细胞的孔的吸光值)计算细胞增殖活性.免疫组化实验组织切片厚度 脱蜡至水洗 用 灭活组织切片内源性的过氧化物酶 使用抗原修复液修复抗原 使用羊血清封闭液封闭 去除封闭液后滴加即用型 一抗 冰箱过夜滴加生物素标记的二抗培养箱中孵育滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液孵育 染色液显色苏木素复蓝透明封片光镜下观察 阳性染色为棕黄色颗粒用 缓冲液代替一抗作空性对照.裸鼠皮下荷瘤实验/裸鼠来源于扬州大学动物实验中心裸鼠重量 周龄分为实验组 只和对照组 只饲养在 级动物培养箱里 在第 天于裸鼠右侧腋腹壁的皮下接种 细胞 约 个细胞接种后每天监测裸鼠及皮下瘤组织生活和生长情况 后拉颈迅速处死裸鼠完整剥离瘤体 对肿瘤体积大小和重量进行测量并给予拍照 移植瘤做相关实验 裸鼠研究获得扬州大学动物实验伦理委员会批准.统计学方法使用.和 .软件分析数据和编辑图片 计数资料组间采用 法 检验计量资料采用均数 标准差表示符合正态分布两组间 检验多组间 检验 .为差异有统计学意义结果.组织中 的表达通过微小 表达谱并设置相关条件:表达水平上调、.且 .因而得到 个表达水平上调的:、(.)、和 然后将这 个 在 对 组织中进行 验证结果如图 所示仅有 和 表 达 水 平 升 高(.、.)本文选择表达水平更高的 作为研究对象图 验证差异性表达的 表示 .的表达及临床病理意义根据 的表达水平探讨其与临床病理资料的相关性 根据表达水平的高低将表达水平高于对照组的 例为高表达组其余 例为正常表达(与对照组表达近似)低表达组(表达水平低于对照组)统计结果如表 所示 的表达与肿瘤直径和分化程度密切相关(均 .)这一结果提示 参与 年第卷第期医学理论与实践了 的生长增殖过程表 两组临床病理特征比较项 目高表达组()正常或低表达组()值 值患者年龄 岁.岁 感染有.无肿瘤直径.分化程度高.中低淋巴结转移阳性.阴性 分期 期.期.对宫颈癌细胞增殖活性的影响.实验结果提示 与肿瘤直径相关因此本文 进 一 步 通 过 实 验 研 究 对 细胞增殖活性的影响 如图 所示在 时与过表达对照组(.)相比过表达(.)促进了 细胞的增殖活性与减低表达对照组(.)相比降低 表达(.)则抑制了 细胞的增殖活性差异均有统计学意义(均.)图 增殖活性实验结果.裸鼠实验降低 表达对宫颈癌细胞生长的影响已知在 中 表达水平上调故在体内裸鼠实验中仅验证降低 表达后对宫颈癌生长的影响/裸鼠实验分为两组即降低 表达组(表达组 只 周)和对照组(只 周)每只裸鼠在右侧腋腹壁的皮下接种 细胞 个/每天监测并制作出移植瘤生长曲线 后拉颈处死裸鼠取出移植瘤并测量体积和大小拍照然后对组织进行免疫组化实验 实验结果如下:降低 表达后移植瘤生长体积和重量均明显小于对照组(.)见图 另外 染色显示降低 组的 阳性细胞比例为(.)明显低于对照组(.)的阳性比例(.)见图 讨论近年来研究表明 中既有促进宫颈癌发生发展的 又有抑制宫颈癌进展的 例如 能通过负调控宫颈癌细胞中的 来抑制细胞增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡 通过上调靶基因 的表达图 裸鼠实验中移植瘤的生长体积和重量图 染色结果促进宫颈癌症的进展 可能成为预测癌症患者预后的潜在指标和候选靶向治疗 上调的 能下调 表达能使患者生存率最短 宫颈癌中 直接靶向 发挥致癌作用从而促进细胞周期进展 的低表达水平与癌症分化不良和淋巴结转移显著相关 的表达降低与癌症患者的晚期临床分期和淋巴结转移有关 与宫颈癌细胞迁移和侵袭、诱导上皮间充质转化和侵袭相关 定位于基因位点:(.)其成熟 基 因 序 列 为 通 过 表达谱分析研究表明在宫颈癌中、和 均表达水平升高但对于 在宫颈癌中的作用研究并未深入探讨 而 在前列腺癌中过度表达促进了前列腺癌细胞的增殖、迁移/侵袭 因此本文研究 在宫颈癌中的作用本研究发现在 例 组织中 表达水平升高说明 发挥着促癌基因 的 作 用 进 一 步 分 析 表 达 与 临床病理意义时发现 表达与肿瘤大小和分化程度密切相关而与患者年龄、感染、淋巴结转移和 分期之间无相关性表明 在 中 表达水平越高癌细胞分化程度越低就越能生长进一步说明 是一个促癌基因可成为 增殖的生物标志物 进一步行功能研究发现过表达 后细胞的增殖活性升高降低 表达后细胞的增殖活性下降再次提示 参与了 细胞的生长过程 在裸鼠移植瘤实验中敲低 表达后移植瘤生长缓慢体积较小瘤体重量也较轻 染色发现敲低组中 医学理论与实践 年第卷第期 阳性比例明显低于对照组 实验结果进一步验证了 能促进 细胞的生长和增殖综上所述 在 中表达水平上调与肿瘤的分化程度和直径大小密切相关 促进 细胞的生长增殖发挥促癌基因的作用 本研究探讨了 在 生长过程中的作用为今后诊断和治疗 提供新的思路参考文献 .():.:.():.():.:.():.:./.:.:.():.():./.:.():.():.(本文通信作者:张荣善)收稿日期 (编辑 倩楠)(上接第 页).:.():.():./.()():.():./.():.:.():.:.():.武卫党石磊张丹凤等.达格列净对糖尿病心肌缺血大鼠心肌功能改善作用的实验研究.陕西医学杂志():.():.耿肖囡肖东斌魏鑫等.达格列净对心血管疾病的预防保护机制.心血管病学进展():.:.:/.():.:.:.():.():.收稿日期 (编辑 倩楠)